第三章 營養(yǎng)成分2010-3

第六節(jié)

食品中維生素的測定

維生素(vitamin)是維持人體正常生命活動所必須的天然有機化合物，但它們參與機體重要的生理過程，是生命活動不可缺少的物質(zhì)。維生素的種類多（20多種），結(jié)構(gòu)復雜，理化性質(zhì)及生理功能各異。根據(jù)溶解性，可分為：

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名稱英文名稱食物來源

脂溶性維生素維生素AVitaminA魚肝油、蛋黃、肝、腎、乳維生素DVitaminD魚肝油、肝臟、蛋黃、牛奶維生素EVitaminE綠蔬、植物油、豆類、玉米維生素KVitaminK綠葉蔬菜、大豆

水溶性維生素維生素B族VitaminBcomplex

維生素B1（硫胺素）thiamine,糙米、麥麩、酵母、豆類維生素B2（核黃素）riboflavin肝、腎、蛋黃、豆類、酵母維生素B3（泛酸）pantothenicacid蛋黃、動物肝臟、酵母維生素B5（煙酸、尼克酸）nicotinamide,金槍魚、動物肝臟、蘑菇維生素B6（吡哆素）pyridoxine肝臟、蛋黃、肉、大豆、谷維生素B7（生物素）vitaminH,biotin酵母、動物肝臟維生素B11（葉酸）folicacid綠葉蔬菜、豆類、動物肝臟維生素B12（鈷胺素）cobalamins肉類、魚類、家禽、奶類

維生素C（抗壞血酸）ascorbicacid新鮮蔬菜、豆芽、水果表3-5維生素的類別及食物來源

編輯課件根據(jù)溶解性，可分為：l

脂溶性維生素（fat-soluble)：維生素A(包括胡蘿卜素)、維生素D、維生素E和維生素K等。l

水溶性維生素(water-soluble)：維生素B族(包括B1、B2、煙酸、B6、泛酸、生物素、肌醇、膽堿、葉酸、B12等)和維生素C。

編輯課件

一、

脂溶性維生素的測定

（一）概述

維生素A是由b-紫羅酮環(huán)與不飽和一元醇所組成的一類化合物及其衍生物的總稱。包括維生素A1和A2，維生素A1又稱視黃醇，維生素A2即3-脫氫視黃醇。編輯課件

1716192071115

CH2OH

18

維生素A維生素A采用國際單位表示：1國際單位維生素A：0.3g維生素A(醇)；0.344g乙酸維生素A(酯）14913編輯課件

-胡蘿卜素(carotene)在肝臟、小腸粘膜或其它組織中可轉(zhuǎn)化為維生素A，故胡蘿卜素又稱為維生素A源。維生素E，又稱生育酚，有多種異構(gòu)體，其中-生育酚的生理活性最高，分布最廣泛。

編輯課件脂溶性維生素的理化性質(zhì)：(1)溶解性：

不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚、苯等有機溶劑；(2)耐酸堿性：

維生素A、D對酸不穩(wěn)定，對堿穩(wěn)定；維生素E對酸穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護下，也能承受與堿一起煮沸。編輯課件(3)耐熱性和耐氧化性：維生素A、D、E耐熱性好，能經(jīng)受煮沸。維生素A易被氧化，光、熱促進其氧化；維生素E在空氣中緩慢氧化，光、熱、堿能促進氧化；維生素D性質(zhì)穩(wěn)定，不易被氧化。

檢測時脂溶性維生素時應(yīng)避光編輯課件攝入量根據(jù)《我國居民營養(yǎng)素參考攝入量》成人男性：800gRE,女性：700gRE視黃酮當量（retinolequivalents，RE）1gRE=1g視黃酮=6g-胡蘿卜素=12g其他類胡蘿卜素編輯課件測定食品中脂溶性維生素時，通常采用皂化法處理樣品，以除去脂肪等雜質(zhì)，在皂化和濃縮時，常加入抗氧化劑(如焦性沒食子酸、維生素C等),然后用乙醚、石油醚等有機溶劑提取濃縮脂溶性維生素。編輯課件(二)維生素A的三氯化銻比色法1.原理

在三氯甲烷溶液中，維生素A與三氯化銻反應(yīng)可生成藍色化合物，在620nm波長處有最大吸收，其吸光度與維生素A的含量成正比。編輯課件2.樣品處理

樣品加NaOH醇溶液水浴上回流(使脂肪轉(zhuǎn)變成肥皂并溶于水中)加乙醚提取維生素A凈化處理乙醚提取液后揮干乙醚三氯甲烷定容。編輯課件3.注意事項：(1)三氯甲烷中不應(yīng)含有水分，因三氯化銻遇水會水解出現(xiàn)沉淀，干擾比色測定SbCl3十H2O→SbOCl↓十2HCl在三氯甲烷中加入乙酸酐，以保證脫水。(2)SbCl3與維生素A所產(chǎn)生的藍色物質(zhì)通常只能穩(wěn)定3~6s，6s以后便開始退色，因此在吸收池中反應(yīng)，產(chǎn)生顏色后立即讀取吸光度值。編輯課件(3)維生素A見光易分解，實驗操作應(yīng)在暗處進行。2．胡蘿卜素的紙色譜法

以丙酮-石油醚提取水洗滌（除去提取液中水溶性色素及丙酮）石油醚提取液濃縮。

編輯課件層析濾紙?zhí)崛∫簵l狀點樣石油醚展開將Rf值與標準胡蘿卜素相同的色斑剪下用石油醚溶解450nm波長下測定吸光度，與標準系列比較定量。

編輯課件3.維生素A和維生素E的HPLC測定法

食品樣品經(jīng)皂化處理后，用乙醚提取維生素A和維生素E，濃縮后，揮去乙醚，以乙醇溶解提取物。在反相C18色譜柱上，以甲醇(+水或己烷)為流動相進行色譜分離，紫外分光光度檢測器檢測，與標準比較定量。編輯課件編輯課件二、水溶性維生素的測定

水溶性維生素(VB1,VB2,Vc)的理化性質(zhì)：l

溶解性：易溶于水，不溶于苯、乙醚、三氯甲烷等有機溶劑。l

穩(wěn)定性：在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定，即使加熱維生素B1、B2也不被破壞；在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解。Vc在酸性還原性介質(zhì)中穩(wěn)定。編輯課件l

維生素B2對光敏感，在酸性、中性及堿性環(huán)境中都易被光線破壞，維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。編輯課件（一）維生素B1的測定維生素Bl又名硫胺素(thiamine)，易溶于水和丁醇、異丁醇、異戊醇等有機溶劑。維生素B1的測定主要采用熒光分析法(GB12390-90)。人體每日需要量為1～2mg。VB1參與糖代謝及乙酰膽堿(Ach)的代謝，促進消化功能。維生素B1缺乏可引起神經(jīng)系統(tǒng)病變還可引起心血管系統(tǒng)病變。在酵母、米糠、花生、豆類、牛乳、蛋黃中含量豐富。編輯課件食品中的維生素Bl經(jīng)提取凈化后，在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化成硫色素，在紫外光照射下，硫色素產(chǎn)生藍色熒光，溶液的熒光強度與維生素B1的濃度成正比，與標準比較定量。1.測定原理

編輯課件本方法檢出限為0.05μg，線性范圍為0.2μg～10μg。硫胺素是由取代的嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)由亞甲基相聯(lián)而成的一類化合物

編輯課件2.樣品處理：樣品粉碎或勻漿于低溫冰箱中保存，測定前解凍。(1)樣品中硫胺素的提?。合←}酸提取高壓鍋（121℃）加熱淀粉酶水解45℃～50℃過夜

游離硫胺素。(2)樣品中硫胺素的純化：樣液人造浮石交換管硫胺素被吸附水洗除雜質(zhì)酸性氯化鉀洗脫硫胺素。(3)硫色素的生成、萃取和熒光測定:編輯課件取一定體積樣品提取液和硫胺素標準液（各2份）加堿性鐵氰化鉀加氫氧化鈉形成硫色素破壞硫胺素用丁醇萃取，分層有機相脫水，熒光測定。編輯課件根據(jù)標準硫胺素含量和熒光強度及樣品熒光強度(均扣除空白)，計算樣品中硫胺素的含量。3.注意(1)樣品與鐵氰化鉀溶液混合后，所呈黃色至少應(yīng)保持15s，否則需再滴加鐵氰化鉀溶液1~2滴。但鐵氰化鉀過多又會破壞硫色素。(2)紫外光會破壞硫色素，硫色素形成后應(yīng)迅速測定，并避光操作。編輯課件(3)硫色素能溶于正丁醇，且穩(wěn)定。(4)洗衣粉內(nèi)常含熒光物質(zhì)，故所用的儀器，禁用洗衣粉洗滌。

編輯課件(二)維生素B2的測定

維生素B2又名核黃素(riboflavin)，是多種酶（含有核黃素的氧化還原酶）輔基的組成成分，參與機體的氧化還原過程。主要存在于瘦肉、肝、腎、心、奶類、蛋類、綠葉蔬菜等動物性食品，許多綠葉蔬菜和豆類也含有一定量維生素B2，而谷類中則含量較少。編輯課件豬肝2.08豬腎1.14豬心0.48牛奶0.14雞蛋0.32黃豆0.20芹菜0.19莧菜0.12西蘭花0.13表1常見食品中維生素B2的含量（mg/100g）編輯課件

維生素B2易溶于水，在酸性和中性溶液中穩(wěn)定，于120℃加熱6h僅有少量被破壞，但在堿性溶液中較易分解。游離核黃素對光敏感，特別是紫外光，在酸性、中性或堿性條件下都易被光線破壞。只有當維生素B2與磷酸蛋白質(zhì)結(jié)合成復合物，對光才比較穩(wěn)定。VB2在水溶液中呈現(xiàn)黃綠色熒光,

測定維生素B2常用熒光分析法。編輯課件1.測定原理

樣品酸解、酶解使VB2游離高錳酸鉀氧化色素和雜質(zhì)硅鎂吸附劑柱凈化測定熒光強度(激發(fā)波長為440nm，525nm波長處檢測。試液中加連二亞硫酸鈉

還原VB2為無熒光物質(zhì)測定雜質(zhì)的熒光強度。還原前后熒光強度的差值與維生素B2含量成正比，與標準比較定量。本方法檢出限為0.006μg，線性范圍為0.1μg～20μg。編輯課件2.樣品處理

樣品酸性條件下于120℃水解核黃素游離調(diào)節(jié)pH值使蛋白質(zhì)在等電點沉淀過濾除去雜質(zhì)核黃素溶液KMnO4酸性條件氧化色素和雜質(zhì)H2O2除去多余的KMnO4。編輯課件3.核黃素的吸附和洗脫

核黃素溶液硅鎂吸附劑柱熱水洗除雜質(zhì)丙酮-冰乙酸-水(5+2+9)洗脫收集洗脫液。

編輯課件4.熒光測定

測定樣品的熒光讀數(shù)A，樣品空白的熒光讀數(shù)Ao，標準溶液的熒光讀數(shù)B，標準管空白熒光讀數(shù)Bo,可計算樣品中維生素B2的含量。編輯課件4.說明(1)加入連二亞硫酸鈉(Na2S204)，還原維生素B2使生成無熒光的物質(zhì)，可排除雜質(zhì)熒光所引起的干擾。加入后應(yīng)盡快進行測定，否則會氧化成有熒光的核黃素。編輯課件(2)操作應(yīng)在避光條件下進行。編輯課件(三）HPLC同時測定B族維生素B族維生素的檢測方法很多，高效液相色譜法分析速度快、靈敏度高、準確性好，樣品量需用量少，可以同時測定多種B族維生素。國家衛(wèi)生標準方法(GB/T5009.197-2003)可以同時測定保健食品中的VB2、煙酸和煙酰胺的高效液相色譜法。編輯課件樣品經(jīng)甲醇、水和磷酸的混合液提取，濾膜過濾后，以1-葵烷磺酸鈉-乙腈-磷酸為流動相，用C18柱分離，紫外280nm檢測，以保留時間定性，峰高或峰面積定量。

1.實驗原理編輯課件2.樣品處理

稱取適量研磨混勻的樣品，加入甲醇、水和磷酸的混合液（100+400+0.5）超聲提取5min，3000r/mim離心5min，上清液經(jīng)濾膜過濾后即可進樣。編輯課件3.色譜條件C18柱（150mm×4.6mm,5μm），流速1ml/min，柱溫：室溫，檢測波長為280nm，流動相為1-葵烷磺酸鈉溶液（0.22g1-葵烷磺酸鈉溶解于850ml水中）+乙腈+磷酸=850+150+1。編輯課件4.方法說明1）可通過調(diào)節(jié)流動相的pH值來控制維生素的電離，從而調(diào)節(jié)其保留時間和分離度。2）可在測定過程中變換檢測波長，提高檢測靈敏度，如維生素B1、煙酸、煙酰胺最大吸收波長為254nm，維生素B2、維生素B6、葉酸為280nm。

編輯課件3）流動相中加入1%磷酸，可降低維生素的離子化，改善峰形，減緩峰的拖尾現(xiàn)象。

4）由于B族維生素在水中可以解離為帶電荷的離子，在系統(tǒng)中加入一種與上述電荷相反的離子對試劑，使其形成中性離子對，即可于反相離子對色譜中進行分離。編輯課件

維生素C，又稱為抗壞血酸(ascorbicacid)，具有較強的還原性，被氧化后形成脫氫型抗壞血酸，仍然具有生理活性。脫氫型抗壞血酸水解成2,3-二酮古洛糖酸后，便失去生理活性。在蔬菜和水果中含量很豐富。(三)維生素C的測定編輯課件O=CO=CCOOHHO-CO=CC=OHO-COO=COC=OHO-CH-CH-C-OHHO-C-HHO-C-HHO-C-HCH2OHCH2OHCH2OH（還原型）（脫氫型）（二酮古洛糖酸）

編輯課件

2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈紅色，VC能將其還原成無色。將2,6-二氯酚靛酚裝入滴定管中，滴定樣品中的維生素C，當維生素C全部氧化后，滴下的染料使溶液顯示粉紅色，指示滴定終點。

1.還原型抗壞血酸的測定（1.2,6-二氯酚靛酚滴定法）編輯課件本法是測定還原型維生素C最簡便方法，適合于蔬菜水果中維生素C含量的測定，但不適宜于紅色蔬菜。樣品中某些雜質(zhì)可還原染料，但速度較慢，終點以粉紅色出現(xiàn)15s不退為準。整個測定過程要迅速，以免維生素C被空氣中氧所氧化，并避免接觸金屬離子。編輯課件2.總抗壞血酸的測定（2,4-二硝基苯肼比色法,GB/5009.86-2003）用酸處理過的活性炭作氧化劑，將還原型維生素C全部氧化成脫氫型維生素C。然后與2,4-二硝基苯肼作用，生成紅色的脎，根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量與維生素C總量成正比，在520nm波長下比色定量。編輯課件注意事項1.樣品用20g/L草酸勻漿或研磨。2.活性炭置于1mol/LHCl中回流1－2h，過濾，濾液用水洗至無鐵離子，于110度烘箱中烘干，備用。3.檢出限為0.1ug/mL編輯課件(1)原理：樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉（quinoxaline),其熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比。適用于蔬菜、水果及其制品中還原型和脫氫型抗壞血酸的測定。3.抗壞血酸的熒光分析法（GB/T5009.86-2003)編輯課件(2)樣品處理：①樣品制備：取一定量樣品，加偏磷酸-乙酸溶液，勻漿，用酸堿度（pH1.2），過濾。②氧化：分別取濾液及標準液，加適量活性炭，振搖過濾，分別收集濾液③除去干擾：各取試樣氧化液和標準氧化液作為空白，分別加入硼酸-乙酸鈉溶液，放置在冰箱中，備用。再分