乙肝病毒的變異及臨床意義

乙肝病毒的變異及臨床意義第一頁，共四十三頁，2022年，8月28日乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎以及相關(guān)的肝硬化、肝細胞癌和肝功能衰竭是全球范圍內(nèi)重要的醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生問題。抗病毒治療是這一類慢性肝病的根本治療方法。干擾素α和核苷（酸）類似物（NA)是兩類主要的抗病毒治療藥物。但長期使用NA，耐藥是一個突出的問題。所以，認識耐藥、防范耐藥具有重要的臨床意義。第二頁，共四十三頁，2022年，8月28日一、乙肝病毒的研究簡史二、乙肝病毒的結(jié)構(gòu)及復(fù)制三、病毒變異:S、C、P、X區(qū)四、病毒耐藥的概念和危害五、常用抗病毒藥的耐藥位點六、預(yù)防和監(jiān)測第三頁，共四十三頁，2022年，8月28日一、乙肝病毒的研究簡史1965年Blumberg發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原1967年發(fā)現(xiàn)其與肝炎相關(guān)，稱為肝炎相關(guān)抗原1970年Dane發(fā)現(xiàn)HBV完整顆粒1972WHO將澳大利亞抗原命名為乙型肝炎表面抗原（HBsAg)1979年Galibert完成了HBV全基因測序

HBsAg的發(fā)現(xiàn)曾獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎第四頁，共四十三頁，2022年，8月28日二、乙肝病毒的結(jié)構(gòu)及復(fù)制乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科，HBV基因組由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA組成，長的為負鏈、短的為正鏈，負鏈含3200bp，正鏈長度約為負鏈的50-80%。第五頁，共四十三頁，2022年，8月28日第六頁，共四十三頁，2022年，8月28日HBV有四個ORF均位于負鏈，分別稱作s區(qū)、C區(qū)、X區(qū)和P區(qū)，分別編碼外膜蛋白、核心蛋白、X抗原和DNA多聚酶。第七頁，共四十三頁，2022年，8月28日HBV進入肝細胞后，病毒核酸進入細胞核并轉(zhuǎn)換成cccDNA(共價閉合環(huán)狀DNA),以此為模板，轉(zhuǎn)錄成四種HBVRNA,其中只有3.5kb的mRNA含病毒DNA序列上的全部遺傳信息，因此也稱為病毒前基因組RNA。它與病毒聚合酶一起被核殼蛋白包裹，包裝成病毒核心。在病毒核心內(nèi)的前基因組RNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成負鏈DNA，再以負鏈為模板合成正鏈DNA，一部分再進入細胞核補充消耗的cccDNA,另外一部分則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配包膜，形成成熟的病毒顆粒向細胞外分泌。第八頁，共四十三頁，2022年，8月28日HBV病毒顆粒感染肝細胞及DNA復(fù)制過程第九頁，共四十三頁，2022年，8月28日慢性活動型乙肝患者肝細胞每天可以產(chǎn)生1013個HBV顆粒，在外周血中濃度可達1012/ml，半衰期1～1.2d。被HBV感染的肝細胞半衰期為10天~100天不等。肝細胞內(nèi)的cccDNA半衰期較長，根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析，排除宿主的特異性免疫反應(yīng)以及病毒變異的影響，需要進行14年的抗病毒治療才能完全清除患者肝細胞內(nèi)的cccDNA。目前無藥物可作于cccDNA,其穩(wěn)定存在是HBV不能根治的原因。

第十頁，共四十三頁，2022年，8月28日三、病毒變異病毒變異是生物遺傳進化的必然，乙型肝炎病毒(HBV)變異是在慢性感染過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而自然發(fā)生的。在外來壓力的作用下，HBV常發(fā)生選擇性變異，一些特異性HBV突變株被選擇出來。HBVDNA每個復(fù)制循環(huán)中每10000個堿基對可發(fā)生1個核苷錯誤，每天產(chǎn)生3.2×1010個點突變。HBV逆轉(zhuǎn)錄過程中缺乏校正機制是HBV容易耐藥的根本原因。第十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日1、S基因區(qū)變異

S基因區(qū)可分為：前S1、前S2和S區(qū)，分別編碼preS1、preS2和HBsAg。前S蛋白免疫原性很強，可與肝細胞的受體結(jié)合，是HBV具有嗜肝性的重要原因。由于S基因編碼HBsAg，所以其變異會產(chǎn)生如下不良臨床結(jié)果：第十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日(1)HBsAg陰性的乙肝病毒感染：S基因變異后所表達的HBsAg不能被現(xiàn)在的普通檢查方法檢測到，致使乙肝病毒仍然存在，卻不被發(fā)覺。對這種情況，應(yīng)該結(jié)合HBeAg檢查和乙肝病毒的基因檢查技術(shù)，方可得出正確的結(jié)果。

(2)免疫預(yù)防失敗：使用野毒株HBsAg制備的血源性或基因過程乙肝疫苗所產(chǎn)生的抗HBs對一些變異株的HBsAg的親和力和中和作用明顯下降，從而可使乙肝疫苗阻斷母嬰傳播和乙肝免疫球蛋白預(yù)防移植肝再感染乙肝病毒失敗。

第十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日(3)致病性的改變：S基因變異株在乙肝病毒無癥狀攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎、肝硬化和肝癌患者體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，使病變程度加重，范圍增加。

(4)HBsAg亞型的改變：由于核苷酸序列發(fā)生變異，會引起HBsAg亞型的改變，使病情復(fù)雜化。第十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日總之———S基因變異是疫苗免疫失敗的重要原因S基因變異后免疫球蛋白將不能發(fā)揮保護作用逃避干擾素治療和宿主免疫清除S基因變異是形成HBsAg陰性、抗HBs陽性、HBV-DNA持續(xù)陽性的慢性乙型肝炎的重要原因第十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日2、前C/C基因變異

C1896位(A83)的變異：是HBV中最常見的變異。nt1896G-A，使28位的色氨酸（密碼子TGC）變異為終止密碼TAC，導(dǎo)致前C蛋白的翻譯終止，從而使eAg不能合成。此突變有助于HBV逃避免疫攻擊但它并不影響HBV復(fù)制，而形成慢性感染狀態(tài)。這種情況臨床上表現(xiàn)為HBeAg(-)、HBV-DNA(+)。

上述變異也見于干擾素治療后，因此提示以HBeAg轉(zhuǎn)陰作為疾病好轉(zhuǎn)的指標有時并不準確，應(yīng)結(jié)合HBVDNA檢測判斷。

第十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日前C區(qū)/C區(qū)突變檢測的臨床意義判斷e抗原下降代表病毒復(fù)制能力下降的診斷是否可靠判斷乙肝病毒是否為特殊的e抗原陰性病毒類型慢性重癥肝炎、肝硬化失代償、原發(fā)性肝癌與C區(qū)位點突變有關(guān)對判斷疾病預(yù)后,調(diào)整抗病毒治療方案具有一定的參考價值

是否是真的血清學(xué)轉(zhuǎn)換C區(qū)變異使得細胞毒T淋巴細胞(CTL）效應(yīng)降低第十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日3、X基因突變

X基因突變編碼154個氨基酸的X蛋白，X蛋白可激活乙肝病毒基因的復(fù)制過程，是乙肝病毒基因組內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能重疊最明顯的區(qū)域。因此，X基因在乙肝病毒復(fù)制、表達及致病中起關(guān)鍵作用。近年來還發(fā)現(xiàn)乙肝病毒X基因變異及其產(chǎn)物HBxAg與乙肝病毒的致癌密切相關(guān)。第十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日4、P基因變異

P基因主要編碼DNA多聚酶，是最長的開放讀框，與C、S與X基因重疊。該基因共分成5個區(qū)(A、B、C、D和E)。這些區(qū)域是較保守的，參與核苷酸或模板結(jié)合，并且具有催化活性。近10多年來，在用核苷類藥物治療患者中，出現(xiàn)了P基因突變，體內(nèi)外試驗表明這些突變株與藥物耐藥相關(guān)。

第十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日四、病毒耐藥的概念和危害在核苷(酸)類似物治療過程中，從病毒變異到臨床耐藥是一個逐漸發(fā)生的過程。最初，體內(nèi)可能有少量變異的病毒株。盡管這些病毒對藥物抵抗力強，但其復(fù)制數(shù)量比野生病毒株少。因此，體內(nèi)的野生病毒株仍占“優(yōu)勢”，但隨著治療時間延長，野生病毒株被藥物抑制住以后，耐藥的變異病毒株被“篩選”出來，得到復(fù)制的機會，并逐漸增多，成為體內(nèi)的“優(yōu)勢”株，這時便出現(xiàn)耐藥。第二十頁，共四十三頁，2022年，8月28日與DNA-P結(jié)合抑制HBV-DNA復(fù)制核苷類似藥物的作用機制第二十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日圖.抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥第二十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日為了準確地反映這種病毒變異到臨床耐藥的過程，我們把病毒變異后的耐藥分為基因耐藥、病毒學(xué)耐藥和臨床耐藥三個階段——基因耐藥：在抗病毒治療過程中體內(nèi)乙肝病毒基因組產(chǎn)生了變異，形成新的耐藥性病毒基因序列，對藥物易感性降低，但這種耐藥病毒株在體內(nèi)的量很少，只能通過病毒基因的檢測查到變異病毒株。*（表型耐藥）第二十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日病毒學(xué)耐藥：在基因耐藥的基礎(chǔ)上繼續(xù)發(fā)展，變異病毒株逐漸增多，HBVDNA水平反彈，一般在(1×103)～(1×106)拷貝/毫升之間，還沒有造成肝功能異常和明顯的肝臟組織學(xué)損傷。病毒學(xué)耐藥也稱為病毒學(xué)反彈。2006年美國NIH會議建議其定義為：治療后達到應(yīng)答，但在繼續(xù)治療過程中HBVDNA比達到的最低值一致性地超過1log10拷貝/ml時，稱為病毒學(xué)反彈。臨床耐藥：病毒學(xué)耐藥繼續(xù)發(fā)展，HBVDNA水平上升至1×106拷貝/毫升以上，最終出現(xiàn)ALT升高、肝臟組織學(xué)損傷，并可能有臨床癥狀。第二十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日病毒耐藥對臨床的影響耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物選擇減少耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處病毒反彈,血清轉(zhuǎn)氨酶升高,HBeAg血清轉(zhuǎn)換率降低肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高公共衛(wèi)生危害耐藥病毒株的傳播免疫逃逸第二十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日五、常用抗病毒藥的耐藥位點

第二十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日拉米夫定耐藥位點：病毒最主要的變異發(fā)生在YMDD位點。YMDD是4個氨基酸(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)的縮寫，這4個氨基酸位于乙肝病毒DNA聚合酶上，是拉米夫定的主要作用位點，最常見的變異是M(蛋氨酸)被V(纈氨酸)或I(異亮氨酸)取代，分別稱為YVDD或YIDD變異(即：M204V/I)。一旦發(fā)生了YMDD變異，拉米夫定對HBVDNA的抑制作用就會降低1000倍以上。當長期應(yīng)用拉米夫定時，發(fā)生YMDD變異的比率逐年增加。舉例1：略第二十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日阿德福韋耐藥位點：主要為N236T(蘇氨酸置換門冬酰胺)或A181/T(纈氨酸/蘇氨酸置換丙氨酸)。體外檢測，這些變異株對阿德福韋的易感性降低3～10倍，具有這些變異株的患者可伴有病毒學(xué)反彈、肝炎發(fā)作和肝功能失代償。其他的耐藥株有215、237和238位點變異，但需進一步確定這種變異的臨床意義。舉例2、舉例3：略第二十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日恩替卡韋耐藥位點：P區(qū)的184、202和250位點發(fā)生氨基酸的置換變異，認為與發(fā)生恩替卡韋耐藥有關(guān)，使其對藥物易感性降低<10倍。在原有拉米夫定耐藥患者中，病毒對恩替卡韋的感性降低8～30倍。恩替卡韋屬于高基因屏障藥物，耐藥方式：rtL180M+rtM204V耐藥位點再出現(xiàn)rtT184，或S202，或M250位點改變，也就是必須同時出現(xiàn)3個耐藥位點。第二十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日替比夫定耐藥位點：其抑制HBV復(fù)制的活力較拉米夫定強，但二者有交叉耐藥，對有M204I變異或L180M/M204雙重變異的拉米夫定耐藥患者，替比夫定的敏感性也同樣降低1000倍以上；但替比夫定對單獨M204變異株仍有抑制作用，其易感性僅降低1～2倍。對阿德福韋耐藥株A181的易感性降低3～5倍，但對N236T變異株仍敏感。第三十頁，共四十三頁，2022年，8月28日以上可以看出，拉米夫定、替比夫定有交叉耐藥性，恩替卡韋與前兩者有部分交叉耐藥性，而阿德福韋的耐藥位點獨特，與以上三種藥物均無交叉耐藥性。

第三十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日干擾素治療對HBV的壓力主要集中在前C/C區(qū)及前S區(qū)。近來對前C區(qū)基因變異的研究顯示，干擾素治療并不增加前C區(qū)基因變異的機會，前C區(qū)終止變異也不影響干擾素治療應(yīng)答，但在干擾素治療過程中產(chǎn)生前C區(qū)變異往往可預(yù)示病毒清除失敗。出現(xiàn)機體耐藥可能與中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)。

第三十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日病毒對不同抗病毒藥物的“基因屏障”是不同的，因此藥物的耐藥發(fā)生率也不同。所謂病毒對藥物的基因屏障是病毒變異或逃逸藥物選擇造成病毒耐藥的閾概率。有高耐藥基因屏障的藥物，病毒耐藥的危險性較低；而低耐藥基因屏障的藥物，病毒耐藥的危險性較高。第三十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日圖2.各種抗病毒藥物的耐藥發(fā)生率第三十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日六、預(yù)防和監(jiān)測抗病毒治療期間所達到的病毒抑制程度，既是決定預(yù)后最重要的指標，也是預(yù)測耐藥發(fā)生的好方法。近年來，路線圖的概念是為了預(yù)測療效及耐藥而提出來的。第三十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日Roadmap預(yù)測的概念KeeffeEB,etal.

ClinicalGastroenterolHepatol2007;5:890–897.12周檢測最初無應(yīng)答病毒學(xué)應(yīng)答早期治療失敗依從性良好依從性不好24周檢測早期應(yīng)答PCR檢測陰性完全病毒學(xué)應(yīng)答介于≥300和<104copies/ml部分病毒學(xué)應(yīng)答≥104copies/ml病毒學(xué)應(yīng)答不好開始治療加用第二種藥物繼續(xù)原方案治療每6個月監(jiān)測一次初始選擇低耐藥基因屏障藥物：加用不同變異位點的藥物初始選擇高耐藥基因屏障藥物：每3個月監(jiān)測一次，持續(xù)超過48周初始選擇抗病毒療效弱藥物：每3個月監(jiān)測一次，持續(xù)至48周48周時完全應(yīng)答，繼續(xù)治療48周時不完全應(yīng)答，加用療效更強并且不交叉耐藥的藥物第三十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日治療期間病人監(jiān)測的目的是評估藥物的安全性、依從性和有效性。特別是早期病毒學(xué)的應(yīng)答狀況對發(fā)現(xiàn)原發(fā)性治療失敗和預(yù)測長期療效非常有價值，可以預(yù)測長期治療可能發(fā)生組織學(xué)改善、減少肝病進展和/或耐藥。第一個監(jiān)測點是在治療12周時，如果血清HBVDNA下降小于1log10IU/ml或50copies/ml，稱為原發(fā)性治療失敗。原發(fā)性治療失敗是罕見的，如果不是因為病人依從性問題，對于原發(fā)性治療失敗的病人應(yīng)當改變治療方案。第二個監(jiān)測時間點是治療24周時病人的血清HBVDNA水平。24周時的療效分為完全應(yīng)答、部分應(yīng)答或不充分應(yīng)答。第三十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日完全應(yīng)答的定義為：HBVDNA<60IU/ml或<300copies/ml(PCR法)。完全應(yīng)答的病人繼續(xù)服藥，延長到每6個月隨訪并檢測一次。部分應(yīng)答定義為：治療24周時HBVDNA<2000IU/ml(<4log10copies/ml)。部分應(yīng)答的病人如使用耐藥基因屏障較低的藥物，應(yīng)考慮增加第二種無交叉耐藥性的藥物，防止病毒耐藥后反彈；如使用耐藥基因屏障較高藥物，應(yīng)當繼續(xù)每3個月監(jiān)測一次直到48周以后；如使用抗病毒作用較慢的藥物(如：阿德福韋)，應(yīng)當繼續(xù)每3個月監(jiān)測一次；到治療48周時，如仍為部分應(yīng)答或不充分應(yīng)答，應(yīng)改變治療藥物，除非HBVDNA接近可檢測的下限；如在治療48周時達到完全應(yīng)答，應(yīng)繼續(xù)治療。不充分應(yīng)答被定義為：在治療24周時，HBVDNA≥2000IU/ml(≥4log10copies/ml)。第三十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日病毒耐藥的預(yù)防1．使用抗病毒療效理想和有高耐藥基因屏障的藥物。在目前上市的乙肝抗病毒藥物中，干擾素療程短，不引起病毒耐藥；在口服抗病毒藥物中，選擇高耐藥基因屏障的藥物。2．規(guī)范治療和提高病人治療的依從性治療的規(guī)范性和病人的依從性可減少耐藥的發(fā)生，如果不按照要求隨意更換藥物、不按時服藥或隨意停藥，就會增加病毒耐藥的機會及其他危害（舉例4：略）。第三十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日3.掌握好抗病毒指征及停藥標準指征：轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)反復(fù)增高，HBVDNA陽性停藥標準:1