直接反映基因特征,非推測(cè)oweroinre

DNA遺傳標(biāo)記

特點(diǎn)：1.直接反映基因特征，非推測(cè)。2.基因座位數(shù)量多，無論表達(dá)與否。3.多態(tài)性程度高，等位基因多，鑒別能力強(qiáng)。4.適合于陳舊的樣品，檢測(cè)能力強(qiáng)。5.靈敏度高，有利于微量樣品的檢測(cè)。6.易于檢測(cè)手段的自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好。逐漸取代了蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法。

第一部DNA基礎(chǔ)

一、DNA結(jié)構(gòu)與特征

1.DNA分子結(jié)構(gòu)

線性大分子-基本單位為脫氧核苷酸組成----堿基、脫氧核糖、磷酸差別----堿基：嘌呤堿—腺嘌呤（A）與鳥嘌呤（G）

嘧啶堿—胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）結(jié)構(gòu)：堿基+脫氧核糖=脫氧核苷-+磷酸=脫氧核苷酸

2.DNA理化性質(zhì)1）

DNA的變性變性（denaturation）:在一定條件下，DNA雙鏈間氫鍵斷裂，形成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。也稱退火（annealing）。條件：A：溫度上升----Tm值(meltingtemperature)50%DNA分子解鏈的溫度。與GC/TA比值有關(guān)。1%GC-0.4℃。B：堿性升高---0.5NNaOH-完全解鏈。2）DNA的復(fù)性復(fù)性（renaturation）撤除變性條件后，變性的單鏈DNA根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，恢復(fù)成DNA雙鏈的過程。條件：A：溫度降低—過低易錯(cuò)配。過高不易復(fù)性。

B：高離子強(qiáng)度。3）DNA分子雜交雜交（hybridization）：來源不同的兩條DNA單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，形成雙鏈雜種DNA的過程。二、基因

1.基因與基因組

基因（gene）：合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所需的全部核苷酸序列基因組（genome）：一個(gè)生物體的所有基因。核基因組：細(xì)胞核中23對(duì)染色體包含的所有基因線粒體基因組：線粒體DNA中的所有基因

2.

基因結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)基因：能夠編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。外顯子（exon）：編碼序列。內(nèi)含子(intron)：非編碼序列（間隔列）。如β珠蛋白-1700堿基（bp），編碼146個(gè)氨基酸，3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。3.基因突變

突變（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改變。1）點(diǎn)突變（pointmutation）：?jiǎn)螇A基置換。同義突變（samesensemutation）:簡(jiǎn)并密碼，無突變效應(yīng)。錯(cuò)義突變(missensemutation)：新密碼子，氨基酸序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。無義突變(non-sensemutation)：變成終止密碼，合成不完整多肽產(chǎn)生突變效應(yīng)。終止密碼突變（terminatorcodonmutation)：合成過長的多肽，產(chǎn)生突變效應(yīng)。移碼突變（frame-shiftmutation)：DNA鏈中插入1個(gè)或幾個(gè)單堿對(duì)，使突變處以下部位密碼發(fā)生變化，使合成的氨基酸種類或序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。2）片段突變：DNA鏈中小片段單堿序列發(fā)生缺失、重復(fù)或重排，產(chǎn)生突變效應(yīng)。單堿基突變(圖中用黑點(diǎn)示意位置為突變點(diǎn))三、DNA多態(tài)性的分類

1）長度多態(tài)性：等位基因片段長度的個(gè)體差別。由一特定序列，首尾相連串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同產(chǎn)生的個(gè)體差別。可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）

短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)A：產(chǎn)生原因：DNA滑動(dòng)與同源染色體不等交換。

B：差別：VNTRSTR

重復(fù)序列組成2-7bp7-數(shù)十bp

重復(fù)序列數(shù)目2-10數(shù)個(gè)10數(shù)個(gè)-數(shù)百個(gè)鑒別能力高極高優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增現(xiàn)象不明顯極明顯檢測(cè)靈敏度極高稍差片段總長度200-500bp數(shù)千以上bpC：STR的命名：非編碼區(qū)-D3S1358

D3第三號(hào)染色體S單拷貝（singlecopy）1358

VNTR序列的發(fā)現(xiàn)序號(hào)

編碼區(qū)內(nèi)含子-HumHPRTB

次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hypoxanthinephosphoribosyltransferase）1））序列列多多態(tài)態(tài)性性：DNA片段段堿堿基基排排列列順順序序的的個(gè)個(gè)體體差差別別。。單核核苷苷酸酸多多態(tài)態(tài)性性（singleucleotidepolymorphism,SNPs））原因因：：堿堿基基的的置置換換、、插插入入、、缺缺失失。。特點(diǎn)點(diǎn)：：多多位位于于非非編編碼碼區(qū)區(qū)，，選選擇擇壓壓力力。。數(shù)量量多多，，1/1000bp，，300萬二態(tài)態(tài)性性，，2個(gè)個(gè)等等位位基基因因，，多多態(tài)態(tài)性性程度度較較低低。。孤立立事事件件，，人人類類遺遺傳傳學(xué)學(xué)意意義義大大。。第二二部部分分DNA的制制備備核心心與與關(guān)關(guān)鍵鍵腦>肺>肌肉肉>腎6pg/細(xì)胞胞一、、理想想DNA樣品品的的要要求求1.純度度-RNA、、蛋白白質(zhì)質(zhì)、、多多糖糖、、脂脂類類。。2.完整整性性-DNA大分分子子。。3.DNA量。。Μg/指紋紋圖圖；；ng/PCR；；pg/PCR二、、經(jīng)典典DNA提取取法法1.在弱弱堿堿和和螯螯合合劑劑的的條條件件下下行行組組織織勻勻漿漿，，溶解解胞胞、、核核膜膜。。2.去垢垢劑劑與與蛋蛋白白酶酶消消化化蛋蛋白白，，分分離離DNA。。3.有機(jī)機(jī)溶溶劑劑去去除除蛋蛋白白，，萃萃取取DNA。。4.乙醇醇與與鹽鹽類類沉沉淀淀DNA。。三、、試劑劑的的使使用用原原理理1.弱堿堿和和螯螯合合劑劑：：Tris-HClpH8.0，，DNA分子穩(wěn)穩(wěn)定。。EDTA（（乙二胺胺四乙乙酸））-抑抑制核核酸酶酶。通通過螯螯合鎂離離子。。2.去垢劑劑與蛋蛋白酶酶：SDS（十二烷烷基磺磺酸鈉鈉）：：增加加膜通透性性；促促進(jìn)DNA與蛋白白質(zhì)分分解；；促使使核酸酸酶與蛋白白質(zhì)變變性。。蛋白酶酶K：酶解解組蛋蛋白。。3.有機(jī)溶溶劑：：酚-變性性沉淀淀蛋白白質(zhì)，，組蛋蛋白、、蛋白白酶等等。PH6.0，需Tris-HClpH8.0平衡。。氯仿-變性性沉淀淀蛋白白質(zhì)，，除酚酚，水水相分分離。。異戊醇醇-除除酚，，除泡泡沫。。4.乙醇與與鹽類類：DNA不溶于于乙醇醇與鹽鹽類。。四、基本步步驟1.樣品處處理-分離離細(xì)胞胞，低低滲鹽鹽水或或細(xì)胞胞懸浮浮液。。10mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS.2.消化-TNE（（15mmol/LTris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA,5mmol/LNaCl））4ml，，10%SDS0.45ml，，10mg/ml蛋白酶K（終濃度度100μg/ml）混勻，，50℃3h，45℃℃過夜。。3.DNA提取-等體體積飽飽和酚酚-等等體積積飽和和酚/氯仿仿/異異戊醇醇（25/24/1）-氯仿仿/異異戊醇醇（24/1））。500r/min,10min.4.沉淀DNA-1/10體積3mol/LNaAc，，2倍無水水乙醇醇-70%乙醇醇。室室溫?fù)]揮干。。5.溶解DNA-適量TE（（10mmol/LTris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA,長時(shí)間間。五、其其他方方法1.Chelex-100提取DNA基本成成分：：含有有亞氨氨基二二乙酸酸鹽離離子的的苯乙乙烯-二乙乙基苯共聚聚物。?；痉椒椒ǎ海撼恋淼砑?xì)胞胞；5%試試劑200μl；；56℃0.5h以上；100℃8min；劇烈震震蕩；；離心心上清清。注意：：離離心心徹底底。2.硅硅珠法法提取取DNA基本成成分：：GuSCN（硫氰酸酸胍，，蛋白白變性性劑））與二二氧化化硅（硅硅珠，，核酸酸吸附附劑））?；痉椒椒ǎ海貉阂海?-4μl））TES（（100μμl））SDS（20μl）煮沸5min；300μlGuSCN溶液與20μl硅珠液液保溫溫15min；離心；；離心心加GuSCN溶液；；離心心加乙乙醇漂漂洗；；TES56℃10min離心取取上清清。3.直直接煮煮沸法法，100℃10min六.注注意事事項(xiàng)1.如消化化不完完全，，可用用TNE溶解后后再重重提。。2.消化時(shí)時(shí)間宜宜長不不宜短短。3.操作輕輕柔。。4.混勻要要充分分。5.揮干不不宜過過度。。七.不不同生生物性性檢材材的DNA制備1.混混合斑斑二步步提取取法（（精液液與陰陰道液液）原理：精精子子細(xì)胞胞膜富富含硫硫醇蛋蛋白，，包裹裹DNA的魚精精蛋白白富含含半光光氨酸酸，二二硫鍵鍵豐富富，可可抵抗蛋蛋白酶酶作用用。二二硫蘇蘇糖醇醇（DTT）可還原二硫硫鍵，，使蛋蛋白酶酶發(fā)生生作用用。方法:(1)分離細(xì)細(xì)胞成成分。。(2)常規(guī)消消化。。(3)加10%SDS40μl，1mol/LDTT16μμl，，10μμg/μl蛋白酶酶K4μμl，，37℃過夜。。(4)常規(guī)處處理。。八.DNA定量1.凝凝膠電電泳半半定量量分析析法標(biāo)準(zhǔn)參參照分分析。。2.分分光光光度計(jì)計(jì)分析析原理：：核酸酸于260nm波長為為吸收收峰，，1OD值為50μg/μl雙鏈核核酸（（40μg/μl單鏈核核酸），，根據(jù)據(jù)OD值可計(jì)計(jì)算DNA含量。。蛋白白于280nm波長為為吸收收峰，，260/280比比檢測(cè)測(cè)核酸純純度。九.DNA純化第三部部分聚合酶酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)應(yīng)技術(shù)術(shù)聚合酶酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）在模板板DNA和4種種脫氧氧核苷苷酸存存在的的條件件下，，由一一對(duì)特特異性性引物物限定定的靶靶DNA片段，，經(jīng)DNA聚合酶酶催化化的體體外合合成過過程。。一、PCR的基本本過程程1.變變性（（denaturation））:在加熱熱的條條件下下（94℃℃左右右），，模板板DNA配對(duì)堿堿基間間氫鍵鍵斷裂裂，DNA雙鏈變變成單單鏈。。2.退退火（（annealing）：：在降溫溫的條條件下下（55℃℃-62℃℃），，引物物與其其互補(bǔ)補(bǔ)的模模板DNA結(jié)合形形成雜雜交雙雙鏈。。3.延延伸（（extension）：：在合適適的溫溫度下下（68℃℃-72℃℃），，經(jīng)DNA聚合酶酶催化化4種種脫氧氧核苷苷酸，，由引引物的的3ˊˊ端為為起始始點(diǎn)，，從5ˊ向向3ˊˊ端延延伸，，合成成新的的與模模板DNA互補(bǔ)的的DNA鏈。每反應(yīng)應(yīng)一個(gè)個(gè)循環(huán)環(huán)，靶靶DNA片段數(shù)數(shù)量增增加一一倍，，并以以指數(shù)數(shù)的量量堆積積，經(jīng)經(jīng)30余次次循環(huán)環(huán)，產(chǎn)產(chǎn)物量量可達(dá)達(dá)到2×105-7個(gè)拷貝貝。幾幾個(gè)循循環(huán)后后擴(kuò)增增產(chǎn)物物作為為模板板。二、PCR反應(yīng)的的體系系標(biāo)準(zhǔn)體體系為為50-100μl，，常用20μl。。DNA模板/DNA聚合酶酶/一一對(duì)引引物/4種種脫氧氧核苷苷酸/緩沖沖液。。反應(yīng)條條件：：95℃4-5min,94℃℃30s,55℃-62℃30s,72℃℃30-60s,30循環(huán)后后72℃5-10min。三、試試劑的的要求求：1.引引物：：人工工合成成的單單鏈DNA。A：長度15-30bp。。Ln=2×(G+C)+(A+T)<38,延伸溫溫度大大。B：內(nèi)部的的互補(bǔ)補(bǔ)序列列。C：引物間間的互互補(bǔ)序序列。。D：序列的的隨機(jī)機(jī)。E：識(shí)別序序列的的單拷拷貝。。引物物決定定特異異性。。F：濃度：：02-1μmol/L。。G：應(yīng)純化化低溫溫保存存。2.DNA模板A：量10ng左右。。B：純，無無污染染。3.DNA聚合酶酶A：根據(jù)具具體實(shí)實(shí)驗(yàn)要要求選選擇。。B：注意外外切酶酶活性性，5-3或3-5。C：活性最最適溫溫度70-75℃，，半衰衰期一一般95℃℃40min92℃℃130minD：鎂離子子依賴賴。第六章章DNA多態(tài)性性分型型方法法一、長長度多多態(tài)性性分型型擴(kuò)增片片段長長度多多態(tài)性性分析析（amplifiedfragmentlengthpolymorphisms,Amp-RLP）。。主要指指VNTR和STR1.步步驟（1））PCR擴(kuò)增，，遺傳傳標(biāo)記記特異異性由由特異異性引引物決決定。。（2））電泳泳分離離PCR產(chǎn)物A：凝膠：：聚丙丙烯酰酰氨凝凝（polyacrylamidegel,PAG），，成分：：丙烯烯酰氨氨與甲甲叉丙丙烯酰酰氨凝膠濃濃度（（T）：：6-8%，與分析析的片片段大大小有有關(guān)。。交聯(lián)度度（C）：：3%，甲叉/丙烯烯酰氨氨與甲甲叉B:載樣緩緩沖液液：甘甘油（（蔗糖糖）密密度重重力，，防擴(kuò)擴(kuò)散。。泳速指指示劑劑：溴溴酚藍(lán)藍(lán)（5%，，65bp））二甲苯苯青（（5%，260bp））C：電壓：：100-200V（3））譜帶顯顯示：：A：溴乙啶啶染色色：ethidiumbromide,EB,嵌合與與DNA雙鏈間間，紫紫外線線激發(fā)發(fā)紅色色熒光光。注意：：強(qiáng)致致變劑劑?？煽杉幽z中中或后后染色色。B：銀染色色：AgNO3，Ag+可與DNA穩(wěn)定結(jié)結(jié)合，，甲醛還還原Ag+顆粒，，顯黑黑褐色色。比比溴乙乙啶敏敏感度度高。。C：熒光顯顯色:(P78)染料標(biāo)標(biāo)記在在引物物5ˊˊ端，，激光光激發(fā)發(fā)。（4））基因因型判判定：：根據(jù)等等位基基因分分型標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物物（alleleladder））或片段段長度度標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)物(molecularmarker)同步電泳比比對(duì)判判型。。等位基基因命命名根根據(jù)重重復(fù)序序列的的重復(fù)復(fù)次數(shù)數(shù)。注意事事項(xiàng)：：出現(xiàn)現(xiàn)3條條譜帶帶或3個(gè)峰峰時(shí)，，污染染、混混合樣樣品、、變異異。2.STR基因座座的選選擇：：A：重復(fù)序序列為為4個(gè)個(gè)堿基基。B：等位基基因數(shù)數(shù)量在在10個(gè)左左右。。C：基因座座距離離足夠夠遠(yuǎn)。。D：引物識(shí)識(shí)別序序列盡盡可能能單拷拷貝。。E：PCR產(chǎn)物在在100bp-300bp之間。。3.多多基因因座復(fù)復(fù)合擴(kuò)擴(kuò)增檢檢測(cè)二、序序列多多態(tài)性性分型型（一））限制制性片片段長長度多多態(tài)性性分析析法restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs因DNA核苷酸酸序列列的變變異，，使DNA限制性性內(nèi)切切酶識(shí)識(shí)別部部位產(chǎn)產(chǎn)生、、消失失或移移位，，致使使酶切切片段段長度度和/或數(shù)數(shù)量發(fā)發(fā)生變變化而而呈現(xiàn)現(xiàn)的DNA多態(tài)性性。1.限限制制性片片段長長度多多態(tài)性性的DNA基礎(chǔ)（1））識(shí)別部部位的的點(diǎn)突突變：：堿基基的替替換、、修飾（甲甲基化化）或或插入入與缺缺失。。（2））識(shí)別部部位間間的片片段插插入與與缺失失。（3））識(shí)別部部位間間的重重復(fù)序序列數(shù)數(shù)目的的變化化。2.DNA限制性性內(nèi)切切酶restrictionendonuclease能夠識(shí)識(shí)別特特定的的DNA序列，，與DNA分子結(jié)結(jié)合后后在特特定部部位將將DNA雙鏈切切斷的的核酸酸水解解酶。。（1））生物物學(xué)功功能：：水解解核酸酸的磷磷酸二二酯鍵鍵。（2））命名名：根根據(jù)微微生物物的種種（第第一個(gè)個(gè)字母母大寫）、、屬（（前二二個(gè)字字母小小寫））、變變種第第一個(gè)個(gè)字母大大寫））、發(fā)發(fā)現(xiàn)分分離的的順序序（羅羅馬數(shù)數(shù)字））。（3））分類類：A：ⅠⅠ型：遠(yuǎn)遠(yuǎn)離識(shí)識(shí)別部部位隨隨即切切割，，非特特異。。B：ⅡⅡ型：在在識(shí)別別部位位內(nèi)部部切割割，特特異。。C：ⅢⅢ型：在在識(shí)別別部位位后定定點(diǎn)切切割，，特異異。單位：：1U：在標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)條件件下，，1h完全水水解1μgλλ噬菌體體的酶酶量。。Ⅱ型DNA限制性性內(nèi)切切酶：：A：識(shí)別核核酸序序列數(shù)數(shù)目4-6個(gè)。。B：識(shí)別序序列為為回紋紋序列列。C：切割后后產(chǎn)生生的末末端分分為粘粘行末末端與與平末端。。例：PstⅠ5ˊ-C↓↓TGCAG-3ˊˊ3ˊ-GACGT↑↑C-5ˊˊHaeⅢ5ˊ-GG↓CC-3ˊˊ3ˊ-CC↑GG-5ˊˊ3.分分型法法：酶+緩緩沖液液+樣樣品----一一定的的溫度度----電泳泳檢測(cè)測(cè)。4.注注意事事項(xiàng)：：A：星號(hào)活活力。。B：消化時(shí)時(shí)間宜宜長不不宜段段。C：陽性可可肯定定序列列，陰陰性序序列不不定。。（二））等位位基因因特異異性寡寡核苷苷酸探探針雜雜交分分析法法allelespecificoligonucleotide,ASO根據(jù)鹼鹼基互互補(bǔ)的的原則則,制制備識(shí)識(shí)別特特定寡寡核苷苷酸序序列的的單鏈鏈DNA探針,并標(biāo)標(biāo)記示示蹤物物,在在高強(qiáng)強(qiáng)度條條件下下與變變性DNA樣品雜雜交,檢測(cè)測(cè)示蹤蹤物,陽性性者為為檢出出相應(yīng)應(yīng)的等等位基基因。。1.相關(guān)概概念：：A：雜交：：兩條條異源源寡核核苷酸酸單鏈鏈按照照鹼基基互補(bǔ)補(bǔ)的原原則復(fù)復(fù)性為為雙鏈鏈的過過程。。B：探針：：標(biāo)記記有示示蹤物物，能能夠識(shí)識(shí)別靶靶核苷苷酸序序列并并與之之退火火雜交交的具具有以以知序序列的的寡核核苷酸酸單鏈鏈。2.探探針針的條條件:A:長度為為20bp左右。B：具備高度度特異性性。C：容易標(biāo)記記示蹤物物。D：在雜交過過程中本本身性質(zhì)質(zhì)穩(wěn)定。。3.對(duì)示示蹤物的的要求A:高靈敏度度。B:不影響探探針的特特異性。。C:不影響探探針的雜雜交特性性。D：不改變本本身的特特性。E：檢測(cè)方法法特異。。F：安全可靠靠無公害害。G：檢測(cè)方法法簡(jiǎn)單，，重復(fù)性性好。4.示示蹤物的的種類A：放射性同同位素--靈敏敏度高，，有放射射性污染染。B：非放射性性同位素素：半抗抗原生物素?zé)晒馕镔|(zhì)質(zhì)酶—常見辣根根過氧花花物酶堿性磷酸酸酶5.檢測(cè)測(cè)方法—斑點(diǎn)印跡跡雜交dotblothybridization反向斑點(diǎn)點(diǎn)雜交reversedotblot6.基本本操作過過程A：固相濾膜膜印跡-打點(diǎn)、、Southern轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移移、電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移。常常用尼龍龍膜。B：DNA變性—堿變性、、紫外線線照射、、真空烘烤。。C：預(yù)雜交交—封閉D：雜交：：高強(qiáng)度雜雜交-溫溫度高，，離子強(qiáng)強(qiáng)度低。。特異不利利于復(fù)性性。低強(qiáng)度雜雜交-溫溫度低，，離子強(qiáng)強(qiáng)度高。。利于復(fù)性性不特異異。E：漂洗F：示蹤物顯顯示。三、等位位基因特特異性PCR（（序列特異異性引物物PCR））allelespecificPCR，ASPCR（sequencespecificprimers,SSP-PCR）基本原理理：根據(jù)據(jù)待測(cè)等等位基因因的堿基基差異設(shè)設(shè)計(jì)3條條特異性性引物，，其中2條引物物為上游游（或下下游）引引物，其其3端第第1個(gè)堿堿基（或或第2、、3個(gè)堿堿基）分分別與等等位基因因特異性性堿基互互補(bǔ)，作作為等位位基因特特異性引引物；1條下游游（或上上游）引引物作為為共通引引物。分分為兩個(gè)個(gè)體系同同時(shí)PCR擴(kuò)增，對(duì)對(duì)比電泳泳，依據(jù)據(jù)PCR產(chǎn)物的有有無判定定等位基基因的型型別，有有PCR產(chǎn)物者為為陽性，，證實(shí)該該等位基基因存在在。方法：1.設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)3條引引物，2條等位位基因特特異性引引物，其其5端長長度有差差異（5端差4-6bp），，與共通引引物引物物在1個(gè)個(gè)體系中中同時(shí)PCR擴(kuò)增，電電泳后，，依據(jù)PCR產(chǎn)物片段段的有無無與譜帶帶的位置置判定等等位基因因的型別別。2.同同一片段段多等位位基因同同時(shí)檢測(cè)測(cè)：依據(jù)據(jù)片段上上等位基基因數(shù)目目，設(shè)計(jì)計(jì)兩組多多條等位位基因特特異性引引物，分分別與共共通引物物在1個(gè)個(gè)體系中中同時(shí)PCR擴(kuò)增，對(duì)對(duì)比電泳泳后，依依據(jù)PCR產(chǎn)物片段段的有無無與譜帶帶的位置置判定等等位基因因的型別別。3.不不同染色色體上多多等位基基因同時(shí)時(shí)檢測(cè)：：設(shè)計(jì)兩兩組多條條等位基基因特異異性引物物及相應(yīng)應(yīng)的共通通引物，，并在引引物的5端人工工設(shè)計(jì)10bp左右堿基基序列，，PCR產(chǎn)物對(duì)比比電泳后后，依據(jù)據(jù)PCR產(chǎn)物片段段的有無無與譜帶帶的位置置判定等等位基因因的型別別。技術(shù)關(guān)鍵鍵點(diǎn)：1.引物物特異性性堿基設(shè)設(shè)計(jì)的位位置。2.多位位點(diǎn)復(fù)合合擴(kuò)增的的PCR反應(yīng)條件件。四、隨機(jī)機(jī)引物PCRrandomprimerPCR特點(diǎn)：1.PCR反應(yīng)僅1條引物物。2.引物物堿基序序列隨機(jī)機(jī)。3.引物物長度10bp左右。4.復(fù)性性溫度低低。5.擴(kuò)擴(kuò)增片段段多,但但符合孟孟德爾遺遺傳規(guī)律。。6.可多多引物復(fù)復(fù)合擴(kuò)增增,增加加信息含含量。7.重復(fù)復(fù)性欠佳佳。五、PCR單鏈構(gòu)型型多態(tài)性性分析PCR-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP1、基本原理：PCR產(chǎn)物熱變性后后形成單鏈DNA，在非變性凝膠膠中，因DNA片段堿基排列列順序的不同同，單鏈DNA形成不同的（（空間構(gòu)型，，導(dǎo)致電泳遷移率率的差別而呈呈現(xiàn)多態(tài)性，根據(jù)譜帶帶的位置判定定型別。2、特點(diǎn)：A：樣品需要充分分變性（加樣樣品緩沖液，，沸水浴10min），并保持至電泳泳前。B：電泳凝膠為非非變性凝膠。。C：泳動(dòng)過程中溫溫度保持恒定定。D：分辨率高，可可檢測(cè)出單一一堿基變異，，檢出率90%以上。E：重復(fù)性稍差，，多用于篩選選實(shí)驗(yàn)。F：不能確定突變變堿基的種類類與位置。G：樣品片段應(yīng)短短于500bp。H：電泳譜型可能能出現(xiàn)四條片片段（1處變變異）：同源源雙鏈；異源雙鏈鏈；兩種堿基基排列順序不不同的單鏈DNA。六、擴(kuò)增片段段長度多態(tài)性性檢測(cè)法amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AMP-PCR1、基本原理：應(yīng)應(yīng)用一對(duì)特異異性引物，選選擇VNTR或STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于基基因座不同等等位基因串聯(lián)聯(lián)重復(fù)次數(shù)的的差異，導(dǎo)致致PCR產(chǎn)物DNA片段數(shù)目與長長度不同，經(jīng)經(jīng)電泳后，依依據(jù)譜帶的數(shù)數(shù)目和位置判判定型別。2、特點(diǎn)：A：操作簡(jiǎn)單，重重復(fù)性好。B：泳動(dòng)中根據(jù)等等位基因標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品認(rèn)定型別別。C：可檢測(cè)的基因因座數(shù)量多。。D：可將多基因座座復(fù)合擴(kuò)增。。[復(fù)合擴(kuò)增要要求]：A：引物間無互補(bǔ)補(bǔ)序列。B：基因座不在同同一染色體上上，或距離足足夠遠(yuǎn)。C：不同基因座PCR產(chǎn)物片段長度度分布不交叉叉。D：不同基因座PCR擴(kuò)增條件相近近。E：片段長度差異異不宜過大。。（優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增增）F：變性膠檢測(cè)測(cè)效果好。3、用于檢測(cè)測(cè)的STR基因座選擇條條件：A：重復(fù)序列堿基基數(shù)目3-5之間，易于于分辨。B：等位基因數(shù)目目適中，10個(gè)左右。C：各等位基因頻頻率分布均勻勻。D：雜合度高。E：擴(kuò)增片段長度度小于300bp。F：突變率低。G：避免檢測(cè)連鎖鎖的基因座.（影響計(jì)算結(jié)結(jié)果）七、小衛(wèi)星重重復(fù)單位變異異分型ministatellitevariantrepeatmapping,MVR-PCR1、基本原理：部部分VNTR基因座的重復(fù)復(fù)序列存在堿堿基變異，據(jù)據(jù)此設(shè)計(jì)相應(yīng)應(yīng)的序列特異異性引物，與與共通引物分分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分泳道道對(duì)比電泳檢檢測(cè)PCR產(chǎn)物，根據(jù)譜譜帶的有無與與位置編碼后后判定型別。。2、特點(diǎn)：A：DNA片段數(shù)目多，，類似DNA指紋圖。B：分辨率高，個(gè)個(gè)人識(shí)別能力力高。C：編碼分型，不不需標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照照。D：普通檢測(cè)手段段不能夠反映映全基因狀況況。E：反映了基因座座長度多態(tài)性性與已知序列列多態(tài)性的性性質(zhì)。八、DNA序列分析（雙雙脫氧核苷酸酸末端終止法法）1、基本原理理：在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加加入四種2，，3-雙脫氧氧單核苷酸，由由1條引物進(jìn)進(jìn)行PCR反應(yīng)，在正常常的模DNA復(fù)制同時(shí)，當(dāng)當(dāng)有2，3-雙脫氧單核核苷酸結(jié)合到到產(chǎn)物3端后，下一個(gè)單單核苷酸不能能夠與之形成成磷酸二酯鍵鍵，使DNA片段延伸終止止于該2，3-雙脫氧單單核苷酸處，，根據(jù)不同長度含有有2，3-雙雙脫氧單核苷苷酸片段的檢檢測(cè)結(jié)果判定PCR產(chǎn)物的單核苷苷酸序列。2、特點(diǎn)：A：完全忠實(shí)地反反映靶片段核核苷酸排列順順序。B：測(cè)序反應(yīng)為1條引物（濃濃度低于常規(guī)規(guī)PCR反應(yīng)）。C：根據(jù)方法學(xué)，，一次反應(yīng)可可測(cè)200-500bp。D：產(chǎn)物分析分別別有手工與機(jī)機(jī)器自動(dòng)化方方法。第五部分DNA遺傳標(biāo)記的特特殊意義一、線粒體DNA遺傳標(biāo)記的法法醫(yī)學(xué)意義1.線粒體體DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)點(diǎn)環(huán)形雙鏈；無無組蛋白而裸裸露；全長16569bp；除基因區(qū)域外外有5%-7%的D-環(huán)區(qū)（displacementloop），多態(tài)性高；單單倍體無重組組。2.線粒體體DNA的特征與法醫(yī)醫(yī)學(xué)意義A：穩(wěn)定的母系遺遺傳：母系血血緣親屬具有有完全相同的的mtDNA。。適合特殊類型的親權(quán)鑒鑒定（母-子子；同胞兄妹妹；母系血緣緣）。B：拷貝數(shù)多：有有利于微量檢檢材；檢測(cè)敏敏感度高。C：片段短：抗降降解，有利于于降解檢材，，如角化組織織（毛發(fā)等））。D：突變率高：多多態(tài)性高，個(gè)個(gè)人識(shí)別能力力強(qiáng)。E：屬于序列多態(tài)態(tài)性，檢測(cè)方方法RFLP；ASPCR；；PCR-ASO；測(cè)序等。F：?jiǎn)伪扼w型具有有民族特征。。G：?jiǎn)伪扼w型具有有種屬特征。。3.線粒體體DNA法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的的問題點(diǎn)A：遺傳的特殊性性帶來的個(gè)人人識(shí)別局限性性。B：異質(zhì)性；同一一個(gè)體不同器器官或同一器器官出現(xiàn)序列列不同的mtDNA。。二、Y染色體DNA遺傳標(biāo)記的法法醫(yī)學(xué)意義1.Y染色體DNA特征與法醫(yī)學(xué)學(xué)意義A：父系伴性遺傳傳：父系血緣緣男性具有完完全相同的Y染色體DNA遺傳標(biāo)記。適適合特殊類型型的親權(quán)鑒定定（父-子；同胞兄弟弟；父系血緣緣）。B：男性僅有：適適合于含有男男性成分的混混合斑檢驗(yàn)。。C：?jiǎn)伪扼w型具有有民族特征。。D：同時(shí)進(jìn)行性別別鑒定。E：多態(tài)性種類以以STR為主，并2.線粒體體DNA法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的的問題點(diǎn)A：遺傳的特殊殊性帶來的個(gè)個(gè)人識(shí)別局限限性。B：其他男性成成分地污染。。C：約5%的X染色體重組區(qū)區(qū)的STR基因座的X染色體共有。。三、DNA分子水平的性性別與種屬鑒鑒定1.DNA分子水平的性性別鑒定DNA分子水平的性性別鑒定的基基本原理是X與Y染色體的特異異基因的檢檢測(cè)。A：牙釉基因（amelogenin,AMG）-X染色體的特異異編碼牙釉蛋蛋白基因；類類牙釉基因（（amelogenin-like,AMGL））-Y染色體的特異異編碼牙釉蛋蛋白基因，與與AMG基因有90%同源性，AMG基因有一段插插入序列，導(dǎo)導(dǎo)致基因片段段長度長。由由1對(duì)引物可可同時(shí)擴(kuò)增出出X與Y染色體的相應(yīng)應(yīng)基因片段。。X染色體-977bp產(chǎn)物；Y染色體-977bp與788bp兩個(gè)產(chǎn)物。B：Y染色體的性別別決定區(qū)（sexdeteminationregionY,SRY）,位于Y染色體的著絲絲點(diǎn)近擬常染染區(qū)，一個(gè)外外顯子，約1kb，表達(dá)蛋白誘導(dǎo)導(dǎo)睪丸發(fā)育。。根據(jù)該基因因的一段保守守序列設(shè)計(jì)引引物，可以擴(kuò)擴(kuò)增出254bp的片段。分析要點(diǎn)：避避免擴(kuò)增失敗敗假陰性，應(yīng)應(yīng)加Alu序列作對(duì)照；；不等交換所所至性別異常常；基因突變變所至性別異異常。C：Y染色體的特異異STR基因座的檢出出。2.DNA分子水平的種種屬鑒定DNA分子水平的種種屬鑒定的基基本原理是染染色體上人類類特異基因(片段)的檢檢測(cè)。包括人人與動(dòng)物的鑒鑒別和動(dòng)物間間的鑒別。A：Alu序列；屬于散散在重復(fù)序列列短片段間隔隔型（shortinterspersedsegment,SINEs），具有人及靈長長類動(dòng)物特征征的SINEs片段長約300bp，300-900萬個(gè)，內(nèi)部存存在限制性內(nèi)內(nèi)切酶AluⅠ識(shí)別部位，稱稱之Alu序列。檢測(cè)法（1））Alu探針雜交斑點(diǎn)點(diǎn)法，基因組組DNA直接點(diǎn)膜。（2）PCR法：Alu片段特異性引引物，130bp的產(chǎn)物。B：28srRNA、SON基因3ˊ非編編碼區(qū)等，依依據(jù)不同種屬屬動(dòng)物相應(yīng)片片段內(nèi)部的堿堿基插入與缺缺失，PCR片段長度差異異鑒別動(dòng)物。。C：mtDNA細(xì)胞色素b基因：人與其其他哺乳動(dòng)物物細(xì)胞色素b基因內(nèi)部有AluⅠ識(shí)別部位；鳥鳥類有NcoⅠ識(shí)別部位，依依據(jù)不同種屬屬動(dòng)物細(xì)胞色色素b基因堿基序列列不同，其PCR產(chǎn)物酶切片段段長度與數(shù)目目產(chǎn)生差別而而鑒定種屬。。D：STR基因座的種屬屬差異。斑跡檢查一、血痕檢測(cè)測(cè)順序：肉眼觀觀察-預(yù)備試試驗(yàn)-確證試試驗(yàn)-種屬鑒鑒別-遺傳標(biāo)標(biāo)記檢測(cè)-其其他檢測(cè)。1、肉眼觀察察：數(shù)量、形形態(tài)、位置、、色澤、大小小等，案件發(fā)發(fā)生過程。2、預(yù)備實(shí)驗(yàn)驗(yàn)preliminarytest目的：是否為為血液。檢測(cè)指標(biāo)：血血紅蛋白或正正鐵血紅素-血液的主要要成分?；驹恚貉t蛋白或正正鐵血紅素具具有過氧化物物酶活性，使使過氧化氫分分解產(chǎn)生新生生態(tài)氧，0可可以氧化某種種化學(xué)物質(zhì)形形成有顏色的的新化學(xué)物質(zhì)質(zhì)，以證明可可能是血液。。特點(diǎn)：敏感性性高，特異性性差。陰性可可否定血痕，，陽性疑為血血痕。方法：聯(lián)苯苯胺試驗(yàn)---聯(lián)苯苯胺藍(lán)酚酞試驗(yàn)----在在堿性環(huán)境境中還原酚酚酞---酚酞（紅紅色）2、確證試試驗(yàn)conclusivetest目的：是否否為血液。。檢測(cè)指標(biāo)：：血紅蛋白白或其衍生生物-血液液的主要成成分。基本原理：：血紅蛋白白在酸（堿堿）性條件件下可分解解成血紅素素，血紅素素與某些化化學(xué)物質(zhì)反反應(yīng)可生成成血紅素結(jié)結(jié)晶。以證證明是血液液。特點(diǎn)：敏感感性較高，，特異性好好。陰性可可否定血痕痕，陽性為為血痕。方法：血色色原結(jié)晶試試驗(yàn)-含氮氮化合物（（吡啶）血血色原結(jié)晶晶桃紅色。。氯化血紅素素結(jié)晶試驗(yàn)驗(yàn)-氯化血血紅素結(jié)晶晶。血紅蛋白吸吸收光譜檢檢測(cè)，血細(xì)細(xì)胞涂片檢檢測(cè)。3、種屬鑒鑒別speciesidentification目的：是否否為人血或或何種動(dòng)物物血液。檢測(cè)指標(biāo)：：人及動(dòng)物物血紅蛋白白或血清蛋蛋白。基本原理：：應(yīng)用血紅紅蛋白或血血清蛋白特特異性抗體體，根據(jù)血血清學(xué)抗原抗體反應(yīng)應(yīng)原理，出出現(xiàn)免疫復(fù)復(fù)合物為陽陽性，判定定種屬。常用抗體：：抗人血紅紅蛋白抗體體—種屬、器官官雙特異性性?？谷搜宓暗鞍卓贵w—種屬特異性性。方法：沉淀淀反應(yīng)precipitation；環(huán)狀沉淀反反應(yīng)；瓊脂脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（單向與與雙向）；；對(duì)流免疫疫電泳；酶酶聯(lián)免疫試試驗(yàn)。注意：交叉叉反應(yīng)；種種屬特異性性。生物化學(xué)方方法：血紅紅蛋白等電電聚焦。4、遺傳標(biāo)標(biāo)記檢測(cè)A：ABO型檢測(cè)：吸吸收實(shí)驗(yàn)absorption-標(biāo)準(zhǔn)化抗體體1：32解離試驗(yàn)elution-高效價(jià)抗體體混合凝集試試驗(yàn)mixedagglutination-高親合力抗抗體。B：其他遺傳標(biāo)標(biāo)記檢測(cè)二、精斑檢檢驗(yàn)1、定性試試驗(yàn)1）.預(yù)備備試驗(yàn)：酸酸性磷酸酶酶檢出法法醫(yī)學(xué)意義義：酸性磷磷酸酶在前前列腺分泌泌物中含量量最高。酸性磷酸酶酶化學(xué)性質(zhì)質(zhì)穩(wěn)定。檢測(cè)方法簡(jiǎn)簡(jiǎn)單敏感，，萬余倍。。2）.確證證試驗(yàn)：A:精子檢出：：最可靠，，注意無精精子癥患者者。B:乳酸脫氫酶酶-X(lactatedehydrogenase,LDH)檢出：源于精子，，活性最高高。意義同同精子檢出出。3-4之間。C:γ-精漿蛋白(γ-seminoprotein,γγ-sm檢出：源于前列腺腺，為糖蛋蛋白，也稱稱作P30（分子量3萬），化學(xué)學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定定，無精子子癥患者無無影響。D：β-微精漿蛋白白(β-microseminoprotein,β-MSP檢出：源源于前列腺腺的蛋白，，無精子癥癥患者無影影響。E：精子黃遞酶酶（diaphorase,DIA）3多態(tài)性檢出出：源于精子，，意義同精精子檢出。。3）遺傳標(biāo)標(biāo)記檢測(cè)：：A：二步消化法法，檢測(cè)常常染色體遺遺傳標(biāo)記。。B：Y染色體遺傳傳標(biāo)記檢測(cè)測(cè)。C：常規(guī)血型檢檢測(cè)（ABO吸收、解離離；PGM1、、DIA3、GLOⅠ等酶型；GC、ORM1、、GM、KM等血清蛋白白型。）D：DIA3型檢測(cè)（無無精子癥，，精子對(duì)照照）。三、精液與與陰道液混混合斑的檢檢驗(yàn)1、定性試試驗(yàn)A：陰道脫落上上皮的檢出出。B：陰道肽酶（（vaginalpeptidase,Vp））的檢出。2、混合斑斑的男性遺遺傳標(biāo)記檢檢測(cè)。A：常規(guī)血型檢檢測(cè)結(jié)果對(duì)對(duì)比推斷法法：B：二步消化法法，檢測(cè)常常染色體遺遺傳標(biāo)記。。C：Y染色體遺傳傳標(biāo)記檢測(cè)測(cè)。D：男性成分分分離檢測(cè)法法；1）DIA3型檢測(cè)。2）α2-精漿糖蛋白白（α2-seminoglycoprotein,α2-SGP）檢測(cè)。源于精囊腺腺，為精液液ABH物質(zhì)，應(yīng)用用其抗體分分離混合斑斑的男性ABH物質(zhì)，檢測(cè)測(cè)ABO血型。3）抗人人精漿抗體體分離男性性成分ABO血型檢測(cè)。。一、基因型型頻率計(jì)算算基因型頻率率（genotypefrequency））：：在一一個(gè)個(gè)群群體體中中，，某某基基因因座座上上不不同同基基因因型型在在全全部部個(gè)個(gè)體體中中所所占占的的百百分分比比。。根根據(jù)據(jù)等等位位基基因因頻頻率率計(jì)計(jì)算算。。例：：MN系統(tǒng)統(tǒng)：：M=0.526；；N=0.474MM=M=0.526×