高三一輪復(fù)習(xí)【高效課堂+備課精研】基因工程課件

一輪復(fù)習(xí)

基因工程基因工程按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。操作對象及環(huán)境操作水平操作原理結(jié)果生物體外基因DNA分子水平按照人類的需要定向改造生物的遺傳特性基因重組優(yōu)點：能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙；定向改造生物的遺傳特性。重組DNA分子胰島素基因DNA限制酶限制酶DNA連接酶載體重組DNA分子大腸桿菌導(dǎo)入考點一：重組DNA技術(shù)的基本工具1.來源：2.功能：3.作用的化學(xué)鍵：磷酸二酯鍵“分子手術(shù)刀”——限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）主要從

中分離純化出來，目前分離出數(shù)千種。識別特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵原核生物（專一性）EcoRⅠATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵限制酶只切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵注意：限制酶是一類酶，而不是一種酶。幾種常見的限制酶的識別序列及切割位點：大多數(shù)限制酶的識別序列由

個核苷酸組成，少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。6EcoRⅠBamHⅠTaqⅠHindⅢ限制酶所識別的序列有什么特點？EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’能被限制性酶特異性識別的序列一般都是回文序列：即正反讀順序相同，圍繞一條軸線對稱排列。讀：5’→3’EcoR

Ⅰ限制酶的切割

只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。AAGTTCCTTAAG

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。CTTAAGGAATTCSma

Ⅰ限制酶的切割

只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ:EcoRⅠ:Hind

Ⅲ:BglⅡ:GATCAATTAGCTGATC【思考】同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？

不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？相同可能會相同根據(jù)你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中作用是什么？旁欄思考細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌限制性內(nèi)切酶

限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。拓展思維：要想從一個DNA分子中獲得某個特定的基因需要有幾個酶切位點？產(chǎn)生幾個末端？

24CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT使用EcoRⅠ酶剪切目的基因識別序列GAATTC在切割含目的基因的DNA分子時，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內(nèi)切酶切割，會產(chǎn)生4個末端。請結(jié)合限制酶的作用特點，回答以下問題：（1）限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能（2）請結(jié)合右圖，推斷限制酶切一次可斷開

個磷酸二酯鍵，產(chǎn)生

個游離的磷酸基團，產(chǎn)生

個黏性末端，消耗

分子水。

限制酶只能識別并切開雙鏈DNA分子兩22兩為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？

通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。下圖甲是一個DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點，

據(jù)圖回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（3）只用PstⅠ酶切，最多能得到

種DNA片段。235（4）同時用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；52.DNA連接酶的種類：種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源功能特性相同點大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來；既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端；恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵不能連接具有平末端的DNA片段。又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）。“分子縫合針”——將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。1.作用:DNA連接酶E·coliDNA連接酶的縫合作用兩個DNA片段要具有互補（相同的）黏性末端才能連接起來把兩個DNA片段黏性末端間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接兩個雙鏈DNA片段中的DNA單鏈缺口，但不能直接連接兩條單鏈的DNA！DNA連接酶作用部位？是磷酸二酯鍵不是氫鍵DNA連接酶將兩個雙鏈DNA片段“縫合”連接起來，形成一個雙鏈DNA分子，恢復(fù)被限制酶切開的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。T4DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率相對較低。T4DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATT連接兩個DNA片段DNA連接酶和DNA聚合酶的比較CAATTGAGTATCDNA聚合酶以DNA母鏈為模板，連接單個脫氧核苷酸形成單鏈DNA聚合酶作用示意圖比較DNA連接酶和DNA聚合酶種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點作用實質(zhì)催化

加到已有脫氧核苷酸片段上，形成

.

催化兩個

之間形成

.

作用結(jié)果催化形成與模板鏈互補的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有

黏性末端或平末端的

連接起來，形成

.

模板

.

.

相同點①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)；②都是催化形成

.兩個DNA片段磷酸二酯鍵不需要互補DNA片段重組DNA分子單個脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵需要DNA連接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比較項目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用對象作用結(jié)果磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵DNA片段DNA單個的脫氧核苷酸DNADNA將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”1.作用：將目的基因送入受體細(xì)胞

（

能在受體細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制）2.最常用的載體——質(zhì)粒質(zhì)粒：一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。大腸桿菌細(xì)胞擬核DNA質(zhì)粒思考：質(zhì)粒有___個游離的磷酸基團0①有一個至多個限制酶切割位點供外源DNA片段（基因）插入其中②在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制，以擴增外源基因的數(shù)量思考：質(zhì)粒為什么適合作為載體？作為載體需要具備那些條件？（1）作用:①

．

②

．（2）作為運載體需具備的條件:

①

．

②

．

③

．

④

等．（3）種類將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去利用運載體在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存有1個至多個限制酶切點，以便與外源基因連接具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選對受體細(xì)胞無害種類用途不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”1：λ噬菌體的衍生物或某些動植物病毒作為運載體利用的原理是

.病毒對宿主細(xì)胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異2：若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶3：霍亂弧菌中含有質(zhì)粒，但

（填“能”、“不能”）用來做載體，因為選擇的載體應(yīng)該

。對受體細(xì)胞無害不能4：質(zhì)粒是一種獨立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的

（化學(xué)本質(zhì)）雙鏈環(huán)狀DNA分子5：標(biāo)記基因的作用是

。用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞

質(zhì)粒的自身環(huán)化

由于用同種限制酶切割，會產(chǎn)生相同黏性末端，則可能導(dǎo)致目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接。思考：(1)獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了

。但是使用該法缺點是容易發(fā)生

以及

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質(zhì)粒反向連接目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運載體(2)獲取一個目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個游離的磷酸基團。兩4(3)選擇限制酶切割位點的基本原則：①切割目的基因時：

。②切割質(zhì)粒時：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個完整的標(biāo)記基因，便于篩選總結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E·coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單，大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個或多個限制酶切位點具標(biāo)記基因質(zhì)粒、噬菌體

、動植物病毒1．如圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列敘述錯誤的是(

)A．構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶B．終止子位于基因的下游，使翻譯在所需要的地方停止下來C．構(gòu)建成功后可使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代D．抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因2．(2021·全國乙卷改編)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點如圖所示。回答下列問題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中_____________________________________________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是_______________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能________________________；質(zhì)粒DNA分子上有_____________________________________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是______________

_______________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動子，啟動子是指____________________________

_______________________________________________________________。磷酸二酯鍵

自我復(fù)制

一至多個限制酶切割位點

用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞

位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程

【探究?實踐】DNA的粗提取與鑒定一、實驗原理1.粗提取DNA的原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對DNA進(jìn)行提取。①在酒精溶液中的溶解性：②在NaCl溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。2.鑒定DNA的原理在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。二、材料用具1.選材：【思考】能否選用牛、羊、馬、豬等哺乳動物的紅細(xì)胞做實驗材料？不能哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中無細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA?！舅伎肌磕芊襁x用雞血細(xì)胞做實驗材料？能雞是鳥類動物1.取材、研磨：稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨研磨的目的？破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中三、方法步驟2．去除濾液中的雜質(zhì)方案一方案二在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。低溫放置幾分鐘的作用？抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解。3.DNA的析出方案一方案二在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。攪拌時應(yīng)輕緩、并沿一個方向？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子?；?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。4.DNA的鑒定實驗組對照組水浴加熱取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。藍(lán)色材料的獲取與研磨去雜，析出DNADNA的鑒定DNA鑒定的結(jié)果方法步驟3．下列關(guān)于“DNA的粗提取和鑒定”實驗的原理的敘述，錯誤的是(

)A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質(zhì)能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質(zhì)分離B．利用高溫能使蛋白質(zhì)變性，卻對DNA沒有影響的特性，可將DNA與蛋白質(zhì)分離C．在用預(yù)冷的酒精沉淀DNA時，要用玻璃棒沿一個方向攪拌，防止DNA斷裂D．利用DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，可將提取的絲狀物或沉淀物溶解于NaCl溶液中4．多種實驗材料都可以用于DNA的粗提取與鑒定，用香蕉也可以取得較好的實驗效果。下列敘述錯誤的是(

)A．將粗提取的DNA加入到2mol/L的NaCl溶液的目的是溶解DNAB．冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精可以溶解某些蛋白質(zhì)，得到粗提取的DNAC．向剪碎的香蕉果肉組織中加入蒸餾水并研磨，以釋放核DNAD．將DNA溶于NaCl溶液后加入現(xiàn)配的二苯胺試劑，沸水浴后會出現(xiàn)藍(lán)色考點二

基因工程的基本操作程序一輪復(fù)習(xí)

基因工程抗蟲棉的培育過程基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)（1）原核生物基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)

組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游

功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄起始的信號終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成一.目的基因的篩選與獲取---基因的結(jié)構(gòu)信使RNA加工mRNA前體成熟mRNA不能編碼蛋白質(zhì)的序列=內(nèi)含子+非編碼區(qū)序列編碼序列=外顯子12345一.目的基因的篩選與獲取---基因的結(jié)構(gòu)（2）真核生物基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄初級RNA成熟mRNA3啟動子真核細(xì)胞基因編碼區(qū)中的內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，但表達(dá)時是否轉(zhuǎn)錄？

剪切、拼接不完全相同原因：基因的選擇性表達(dá)。同一個體不同體細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的起點是否相同

一、目的基因的獲取和篩選1.目的基因概念：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)基因。主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因1.從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。如：Bt基因的篩選蘇云金桿菌制成殺蟲劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲發(fā)現(xiàn)殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。2.目的基因獲取方法從基因文庫中獲取通過DNA合成儀直接合成利用PCR獲取和擴增目的基因基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）基因文庫：從基因文庫中直接獲取：基因組文庫：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。部分基因文庫：含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。與載體連接導(dǎo)入受體菌群用適當(dāng)限制酶切割（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA許多DNA片段該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA（某一發(fā)育時期）逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈cDNA(cDNA)與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫基因組文庫中的基因含有啟動子、終止子、內(nèi)含子。cDNA文庫中的基因不含以上結(jié)構(gòu)人工合成：DNA合成儀（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因提取蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因？快速獲得大量抗蟲基因利用PCR獲取和擴增目的基因：PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，通過在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。體內(nèi)DNA復(fù)制要點回顧:條件原料：游離的脫氧核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的兩條鏈酶：解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP復(fù)制原則:堿基互補配對原則（保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？利用PCR獲取和擴增目的基因：PCR擴增儀知道目的基因的兩端核苷酸序列，基因又比較大前提：CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子鏈CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶形成磷酸二酯鍵子鏈延伸合成的方向？只能從5′－端→3′－端延伸CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶1.體外PCR的條件：dATPdGTPdCTPdTTP3′5′子鏈的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈因為DNA聚合酶不能直接將單個的核苷酸聚合成鏈DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端子鏈合成需要引物引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個核苷酸。在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。a.什么是引物1.體外PCR的條件：

在DNA復(fù)制時，DNA聚合酶不能直接從模板鏈的一端直接開始臺成子鏈，必須由引物提供3’端之后才能開始連接脫氧核苷酸。3’3’3’3’5’5’5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’DNA解鏈為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過程可以在PCR擴增儀(PCR儀)中自動完成。2.PCR擴增目的基因的過程：第1步：變性當(dāng)溫度超過90℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈。2.PCR擴增目的基因的過程：5’3’3’5’5’3’3’5’955072℃預(yù)變性90℃以上增加大分子模板DNA徹底變性的概率長度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高。當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。5’3’3’5’第2步：復(fù)性5’3’3’5’當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第3步：延伸第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’每次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即形成指數(shù)式擴增(2n)。利用PCR獲取和擴增目的基因用于PCR擴增的DNA片段往往為了保證目的基因的完整，經(jīng)切割后目的基因的兩端會有一小段非基因序列，其也可能隨目的基因一起擴增。PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？AACGGCTTAATT第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循環(huán)5’3’5’5’3’5’高溫變性、低溫復(fù)性中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性第三次循環(huán)3’5’中溫延伸第三次循環(huán)3’5’PCR擴增過程中產(chǎn)生等長的目的基因片段的分析（1）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過1次循環(huán)后產(chǎn)生等長的目的基因片段有

個；（2）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過2次循環(huán)后產(chǎn)生等長的目的基因片段有

個；（3）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過3次循環(huán)后產(chǎn)生等長的目的基因片段有

個；（4）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過4次循環(huán)后產(chǎn)生等長的目的基因片段有

個；（5）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過5次循環(huán)后產(chǎn)生等長的目的基因片段有

個；（6）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過n次循環(huán)后產(chǎn)生等長的目的基因片段有

個。0028222n–2n要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列。如果循環(huán)n次，則共需消耗

個引物。

則共需消耗

對引物。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2如果循環(huán)n次，則共需消耗

個引物。

則共需消耗

對引物。2n－12n+1－2兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的

端；脫氧核苷酸連接在引物的

端進(jìn)行延伸。3’設(shè)計引物的依據(jù)是？已知目的基因兩端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根據(jù)該序列合成引物。

3’3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2呈指數(shù)形式擴增（n次擴增后，DNA數(shù)量約為2n）PCR結(jié)果：①n代后，DNA分子有_____個

②n代后，DNA鏈有_____條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因

④n代后，含引物的DNA分子有_____個⑤n代后，共消耗_____個引物

⑥第n代復(fù)制，消耗了______個引物⑦n代后，完整的目的基因有____個2n2n+132n2n+1-22n2n-2n如何對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。思考?瓊脂糖凝膠電泳梳子模具根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，一般配置質(zhì)量體積比為0.8%~1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。1將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。2待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。3點樣孔電泳槽樣品將電泳緩沖液加入電泳槽中，電容緩沖液沒過凝膠1mm為宜。4將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。5接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為

1～5V/cm2。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。6取出凝膠，至于紫外燈下觀察和照相。7PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式場所引物酶溫度結(jié)果聯(lián)系解旋酶催化，邊解旋邊復(fù)制高溫變性解旋，全部解旋后再復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主要在PCR擴增儀內(nèi))RNA通常是DNA解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）細(xì)胞內(nèi)溫和條件在不同溫度(較高)下進(jìn)行合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板③原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）②酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3’端合成子鏈1.目的基因的獲取和篩選【三點提醒】①在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。脫氧核苷三磷酸PCR技術(shù)是分子生物學(xué)實驗室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA的半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖所示)，在很短的時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。(1)PCR的全稱是_________________________94℃高溫使DNA雙鏈打開，這一步是打開______鍵，稱為_______。而這一過程在細(xì)胞內(nèi)是通過______酶實現(xiàn)的。(2)當(dāng)溫度降低時，引物與模板_____端結(jié)合，在___________________的作用下，DNA單鏈沿模板延伸，此過程中原料是_______________，遵循的原則是________________________。(3)PCR技術(shù)的必要條件除模板、原料、ATP、酶以外，至少還需要三個條件，即液體環(huán)境、適宜的_______和________，前者由PCR儀自動調(diào)控，后者則靠_________來維持。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)氫變性解旋耐高溫的DNA聚合酶脫氧核苷酸堿基互補配對原則溫度pH緩沖液(4)DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是__________________________

___________________________________________________。引物的實質(zhì)是_______________________________，若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖溶液中至少加入__________個引物。單鏈RNA或者單鏈DNA分子

金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計劃通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題：(1)設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳__________________________位點。設(shè)計引物時需要避免引物之間出現(xiàn)___________________，干擾引物與模板的結(jié)合。(2)圖中步驟1代表_____________，步驟2代表復(fù)性，步驟3代表____，這三個步驟組成一輪循環(huán)。(3)PCR擴增時，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過高會影響_________________________的堿基配對。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但_____________的引物需要設(shè)定更高的復(fù)性溫度。限制性內(nèi)切核酸酶切割堿基互補配對變性(解旋)延伸引物與模板GC含量高(4)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有_____。(填序號)①升高復(fù)性溫度②降低復(fù)性溫度③重新設(shè)計引物②③

一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，啟動轉(zhuǎn)錄過程。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，終止轉(zhuǎn)錄。篩選含目的基因(重組DNA分子)的受體細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作?；虮磉_(dá)載體的組成【說明】有時為了滿足應(yīng)用需要，會在載體上人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別

項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結(jié)束不編碼氨基酸編碼氨基酸啟動子與終止子位于DNA分子中，起始和終止轉(zhuǎn)錄過程。啟動密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，起始和終止翻譯過程。(1)基因工程中的基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了

。

目的基因(2)目的基因插入位點不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位注意:基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）①單酶切單酶切缺點:質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）②雙酶切的優(yōu)點:防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化請結(jié)合下圖，回答問題：

構(gòu)建基因表達(dá)載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因為SmaⅠ切割會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選?！竞诵臍w納】圖解限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。（2）保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或為了保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接），可選用什么限制酶？可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。下圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列敘述錯誤的是A.應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶GB.所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出

含重組質(zhì)粒的受體菌D.同時用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，電泳后可得到4個條帶注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因，TetR：四環(huán)素抗性基因C轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)方法：植物細(xì)胞：動物細(xì)胞：微生物細(xì)胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射技術(shù)Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)由于受體細(xì)胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會有差別；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞花粉外源DNA花粉管子房胚珠1.花粉管通道法：②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。我國科學(xué)家獨創(chuàng)的一種方法吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中雙子葉、裸子植物傷口分泌酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)受損將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞中，并且將其整合到該細(xì)胞染色體DNA上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法激活Vir區(qū)基因，導(dǎo)致T-DNA加工和轉(zhuǎn)移特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上；c.利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法：可轉(zhuǎn)移的DNA第一次拼接第二次拼接第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中兩次拼接、兩次導(dǎo)入的辨析a.兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的

上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞

上。b.兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入

第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基因的

導(dǎo)入受體細(xì)胞。T-—DNA染色體DNAT-—DNA農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；體細(xì)胞b.可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受精卵受體細(xì)胞為？受體細(xì)胞為？【說明】隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，利用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。表達(dá)載體提純受精卵胚胎雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)顯微注射早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植新性狀的動物發(fā)育3.顯微注射法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞病毒介導(dǎo)法（主要用于導(dǎo)入動物細(xì)胞）

科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對S蛋白的免疫記憶。轉(zhuǎn)基因動物Ca2+

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞吸收大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合表達(dá)載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化Ca2+處理法使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子

在棉花細(xì)胞中，重組表達(dá)載體是否導(dǎo)入成功？是否可以穩(wěn)定維持并表達(dá)出Bt蛋白？表達(dá)出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？4.目的基因的檢測與鑒定檢測目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。1.目的：2.檢測內(nèi)容及方法：類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖分子水平的檢測——基因是否插入染色體DNA（存在）非轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉陰性對照Marker方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術(shù)DNA分子雜交結(jié)果圖分子水平的檢測——基因是否轉(zhuǎn)錄方法：RT-PCR或分子雜交技術(shù)RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖Bt基因在抗蟲棉中的表達(dá)從左至右依次是苗期葉片、花鈴期葉片，苞葉，花，雌雄蕊和鈴殼Bt抗蟲蛋白4.目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測——基因是否翻譯為蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交4.目的基因的檢測與鑒定個體生物學(xué)水平的鑒定——個體是否具有相應(yīng)性狀方法：抗蟲鑒定、抗病鑒定、抗蟲或抗病接種實驗與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較接種棉鈴蟲觀察性狀表現(xiàn)，或采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。個體生物學(xué)水平的鑒定具體方法舉例轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽堿植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病一定濃度的鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點，同時還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請回答下列問題：(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是_______；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為_________。該方法中農(nóng)桿菌的作用是______________________________________________________。Ti質(zhì)粒T－DNA感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入到煙草細(xì)胞的染色體DNA上(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是____________________________________________________________________。防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖，農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。為什么？__________________________________________。否含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞科學(xué)家通過利用PCR定點突變技術(shù)改造Rubisco酶基因，提高了光合作用過程中Rubisco酶對CO2的親和力，從而顯著提高了植物的光合作用速率，請回答下列問題：（1）PCR過程所依據(jù)的原理是_______________，該過程需要加入的酶是________________________。利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成_______________。（2）該技術(shù)不直接改造Rubisco酶，而通過對Rubisco酶基因進(jìn)行改造，從而實現(xiàn)對Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較，定點突變技術(shù)最突出的優(yōu)點是__________________________________，PCR定點突變技術(shù)屬于________________的范疇.（3）可利用定點突變的DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體，常用__________________將基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，將該細(xì)胞經(jīng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育成幼苗，從細(xì)胞水平分析所依據(jù)的原理是__________________________。DNA雙鏈復(fù)制耐高溫的DNA聚合酶（或Taq酶）引物能生產(chǎn)出自然界不存在的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，改造困難蛋白質(zhì)工程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法植物細(xì)胞的全能性5.DNA片段的擴增及電泳鑒定1.DNA體外擴增的原理：PCR利用DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2.DNA片段電泳鑒定的原理：DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。如何對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定嗎？瓊脂糖凝膠電泳PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1gp～1μg方法步驟

用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。1.PCR加樣：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min2.離心：3.擴增：將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。4.配制瓊脂糖溶液：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。

將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。

凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。5.制備凝膠：將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。

將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。6.電泳加樣：7.電泳、觀察：

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相?！舅伎肌坑肞CR技術(shù)可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程是：第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的使之變成單鏈DNA；第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA鏈，形成雙鏈DNA分子(圖3-1)。(2021·全國甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是______________(用數(shù)字序號表示)。(2)操作③中使用的酶是_____________________________。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是____________________________。④②③①

耐高溫的DNA聚合酶

延伸

引物結(jié)合到互補DNA鏈

(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與____________

______________特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指_______________________________

_________________________________________________________。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。病原菌的DNA解旋成的單鏈

在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)

新冠疫情的快速控制，離不開政府的科學(xué)決策和我國對新冠病毒(RNA病毒)的快速檢測能力。熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接受到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成(如圖)。Ct值(循環(huán)閾值)的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說法不正確的是(

)A．檢測新冠病毒時，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNAB．PCR每個循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)合)、延伸3個階段C．Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險性更高D．若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，檢測結(jié)果可能為陰性解析Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越少，患者危險性更低，C錯誤；若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，則逆轉(zhuǎn)錄無法得到相應(yīng)DNA，檢測結(jié)果可能為陰性，D正確。(2021·湖南選擇性考試節(jié)選)M基因編碼的M蛋白在動物A的肝細(xì)胞中特異性表達(dá)?，F(xiàn)設(shè)計實驗，將外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通過核移植、胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等技術(shù)獲得M基因失活的轉(zhuǎn)基因克隆動物A，流程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)在構(gòu)建含有片段F的重組質(zhì)粒過程中，切割質(zhì)粒DNA的工具酶是_____________________________，這類酶能將特定部位的兩個核苷酸之間的__________________斷開。(2)在無菌、無毒等適宜環(huán)境中進(jìn)行動物A成纖維細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)時，需要定期更換培養(yǎng)液，目的是_________________________________

__________________________________________________。(3)與胚胎細(xì)胞核移植技