血液系統(tǒng)研究中斑馬魚的具體運用,人體生理學(xué)論文

血液系統(tǒng)研究中斑馬魚的具體運用,人體生理學(xué)論文摘要：斑馬魚為一種硬骨淡水魚,其胚胎透明、發(fā)育和繁衍快,且70%以上的基因與人類一樣。當(dāng)前廣泛地應(yīng)用于遺傳、發(fā)育、毒理、環(huán)境污染以及藥物挑選等方面的研究。本文歸納整理斑馬魚血液系統(tǒng)常用的實驗技術(shù)和檢測方式方法,同時介紹與斑馬魚血液系統(tǒng)研究相關(guān)的常用斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系,以期為本領(lǐng)域的研究提供參考,促進(jìn)斑馬魚在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。本文關(guān)鍵詞語：斑馬魚;血液系統(tǒng);應(yīng)用;Abstract：Zebrafishisabonyfreshwaterfish,itsembryoistransparent,developsandreproducesquickly,andmorethan87%ofitsgenesarethesameashumans.Atpresent,itiswidelyusedintheresearchofgenetics,development,toxicologyandenvironmentalpollution,anddrugscreening.Thisarticlesummarizesthecommonlyusedexperimentaltechniquesanddetectionmethodsofthezebrafishbloodsystem.Theavailabletransgeniclinesofzebrafishhavebeenutilizedtothestudyofthehematologicalsystem,whichprovidereferencesfortheresearchinandpromotetheapplicationofzebrafishinthefieldoflifescience.Keyword：zebrafish;hematologicalsystem;application;斑馬魚是一種微小的熱帶硬骨魚，最早用于發(fā)育和遺傳學(xué)研究，近年在生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究中獲得了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。斑馬魚繁衍力強，養(yǎng)殖成本低，遺傳資源豐富，易于轉(zhuǎn)基因品系的開發(fā)，適于中量挑選，是基礎(chǔ)和應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)研究的重要形式生物。通過對斑馬魚和人類參考基因組的比擬發(fā)現(xiàn)，70%以上的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚同源基因與之對應(yīng)[1]。斑馬魚也是研究血液系統(tǒng)和造血功能非常合適的模型，斑馬魚幼魚身體透明能夠清楚地看到血液流動和心臟跳動，應(yīng)用原位雜交技術(shù)，固藍(lán)染色等技術(shù)可視化地觀察血液細(xì)胞和造血相關(guān)基因的表示出，同時斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系資源豐富，能夠用于對血液系統(tǒng)和造血功能的研究。下文將對常用的研究方式方法和實驗技術(shù)進(jìn)行介紹。1、流式細(xì)胞術(shù)分析血液系統(tǒng)1.1、流式分析斑馬魚腎髓細(xì)胞群流式細(xì)胞術(shù)前向角散射光(ForwardScatter,FSC)與細(xì)胞大小有關(guān)，側(cè)向角散射光(SideScatter,SSC)與細(xì)胞內(nèi)部的精細(xì)構(gòu)造和顆粒性質(zhì)有關(guān)。成年斑馬魚的腎髓相當(dāng)于哺乳動物的骨髓，是造血器官。利用FSC和SSC參數(shù)對斑馬魚的腎髓細(xì)胞進(jìn)行分群，可觀察到明顯的5群。成熟的紅細(xì)胞處于FSC低象限，髓系單核細(xì)胞(myelomonocyticcells)群中包括中性粒細(xì)胞(neutrophils，又稱嗜異質(zhì)粒細(xì)胞heterophilicgranulocytes)、單核細(xì)胞(monocytes)、巨噬細(xì)胞(macrophages)和嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，又稱嗜酸堿粒細(xì)胞eo/basophils)，處在FSC高、SSC高象限細(xì)胞群中;淋巴細(xì)胞群(lymphoidcells)位于FSC中間、SSC低象限;未成熟的前體細(xì)胞位于FSC中間、SSC低象限;成熟的紅細(xì)胞處于FSC低象限，沿SSC象限明顯地分為兩群，以分選后的華而不實一群細(xì)胞再進(jìn)行流式檢測仍可得到與原來類似的兩群細(xì)胞，這可能是由于紅細(xì)胞為橢圓形的緣故。利用微球?qū)?xì)胞平均大小進(jìn)行測量，各群細(xì)胞的大小分別為髓系單核細(xì)胞15.2前體細(xì)胞13.8淋巴細(xì)胞8.3紅細(xì)胞6.2m[2]。1.2、電離輻射對斑馬魚造血功能的損傷電離輻射可引起放射病，呈現(xiàn)機體的全身性反響，幾乎所有器官、系統(tǒng)均發(fā)生不同程度的病理改變，而人體的血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)對損傷最為敏感。根據(jù)電離輻射對人體造成損害的方式，能夠分為直接作用和間接作用兩種途徑，直接作用是輻射的能量累積在DNA、蛋白質(zhì)、酶類、脂類、MicroRNA等生物大分子上引起電離和激發(fā)，使化學(xué)鍵斷裂、分子變性和細(xì)胞構(gòu)造毀壞[3]。而間接作用是電離輻射作用于有機體內(nèi)的水分子，并使其電離產(chǎn)生大量的自由基攻擊體內(nèi)的大分子物質(zhì)如DNA、蛋白質(zhì)等，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的構(gòu)造改變和功能損傷，造成細(xì)胞的氧化損傷[4]。由于血液細(xì)胞和造血組織對于電離輻射的敏感度高[5]，遭到電離輻射后人體的血液系統(tǒng)的細(xì)胞最先發(fā)生形態(tài)構(gòu)造上的變化，隨之功能遭到影響。David[6]等，研究了電離輻射對斑馬魚腎髓細(xì)胞的影響。他們給予成年斑馬魚20Gy的電離輻射照射，在1、4、8、10、14、30d利用FSC和SSC分群，觀察腎髓中紅細(xì)胞、髓系單核細(xì)胞、前體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例的變化和總數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)輻射后紅細(xì)胞的占比快速從50%左右增加到70%左右，在輻射后第4、7、10、14、30d，隨著時間的延長占比逐步減少;而髓系單核細(xì)胞、前體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞三群細(xì)胞的占比在電離輻射后1～8d逐步減少，8d之后細(xì)胞的比例逐步增加，表示清楚造血能力加強，到第30d，三群細(xì)胞逐步恢復(fù)，甚至超過電離輻射前的水平，十分是前體細(xì)胞大量增殖。而各群細(xì)胞的總數(shù)量也經(jīng)歷了從減少到增加的經(jīng)過。觀察斑馬魚電離輻射后腎髓細(xì)胞的整個動態(tài)變化經(jīng)過可知，髓系單核細(xì)胞、前體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對電離輻射特別敏感，電離輻射后細(xì)胞占比急劇下降，而輻射對紅細(xì)胞的影響相對較小。在電離輻射第30d，因輻射損傷死亡的細(xì)胞數(shù)量逐步被新生細(xì)胞所補充，甚至高于電離輻射前的水平。1.3、造血活性物質(zhì)挑選North[7]等研究了一系列生物活性化合物對電離輻射后的成年斑馬魚腎髓造血的影響。在斑馬魚遭到23Gy輻射后第2d，給予不同濃度的生物活性化合物，利用FSC和SSC進(jìn)行細(xì)胞分群，分別在藥物處理后的第4、7、10、14d觀察腎髓紅細(xì)胞、髓系單核細(xì)胞、前體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例的變化，實驗發(fā)現(xiàn)腎髓前體細(xì)胞的升高明顯，繼而髓系單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞逐步升高，表示清楚前列腺素E2(ProstaglandinE2,PGE2)能夠促進(jìn)輻射后受損傷的造血功能的恢復(fù)。2、固藍(lán)染色幼魚紅細(xì)胞2.1、紅細(xì)胞數(shù)量檢測紅細(xì)胞包含很多類似于肝臟和其他組織中催化異源代謝的酶，因而能夠催化典型的單加氧酶反響，包括O-和N-去甲基化以及芳族和脂肪族羥基化等，血紅蛋白在聯(lián)苯茴香胺和過氧化氫的體系中能夠催化其反響在血紅蛋白外表構(gòu)成鐵銹色沉淀，沉淀的面積和顏色的深淺能夠用來指示斑馬魚體內(nèi)血紅蛋白的含量，進(jìn)一步反映紅細(xì)胞的數(shù)量，可用來判定處理因素對紅細(xì)胞的影響[8]。2.2、藥物挑選Manali[9]等用0.5g/mL苯肼處理33hpf(hourspastfertilization)斑馬魚幼魚，造成斑馬魚幼魚溶血性貧血，在54hpf～96hpf給予不同的小分子藥物處理后進(jìn)行固藍(lán)染色，分析尾部造血組織(CaudalHematopoieticTissue,CHT)的平均光密度值，以指示CHT紅細(xì)胞的多少，進(jìn)而挑選對于溶血性貧血有保衛(wèi)作用的小分子化合物。3、熒光實時定量PCR檢測mRNA表示出3.1、實時熒光定量PCR技術(shù)實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR,qRT-PCR)是一種在DNA擴增反響中，以熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒错懷h(huán)后產(chǎn)物總量的方式方法。通過內(nèi)參或者外參法對樣品中的特定DNA序列的表示出量進(jìn)行定量分析[10]。從斑馬魚組織中提取RNA，將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qRT-PCR方式方法測定cDNA的含量，進(jìn)而完成對斑馬魚特定mRNA含量的測定，從mRNA的含量推斷特定DNA序列的表示出變化。3.2、造血轉(zhuǎn)錄因子的檢測Kasem[14]等研究了一個斑馬魚的貧血模型。他們將幼年斑馬魚進(jìn)行兩周的17℃低溫培育，后正常26.5℃飼養(yǎng)1個月，未進(jìn)行低溫處理的斑馬魚作為對照組。取斑馬魚的腎髓提取RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)編碼造血轉(zhuǎn)錄因子(Runx1、scl、cmyb和gata2)，十分是促紅細(xì)胞生成素相關(guān)因子(klfd、hbaa1、ba1、gata1、EPO和EPOr)的表示出上調(diào)，而髓系造血相關(guān)因子(csf1a和csf3)在低溫條件下調(diào)。Paffett-Lugassy[12]等通過qRT-PCR對不同發(fā)育階段的斑馬魚的EPO的表示出進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，32hpf細(xì)胞期至24hpf檢測到EPO的低表示出，而在36hpf處出現(xiàn)一個微小的表示出峰，此后表示出水平不變，直到8～14dpf其表示出迅速增加。在成年魚體中，EPO轉(zhuǎn)錄本可在心臟高表示出，在大腦、肝臟和腎臟表示出較低，在脾和大腸沒有表示出。斑馬魚發(fā)育經(jīng)過和組織EPO的變化規(guī)律與哺乳動物特別類似，進(jìn)而證明斑馬魚的造血功能與哺乳動物類似，表示清楚在脊椎動物中造血調(diào)控具有高度保守性。4、原位雜交技術(shù)檢測mRNA表示出4.1、原位雜交技術(shù)在斑馬魚中使用全原位雜交(Whole-MountInSituHybridization,WISH)技術(shù)已經(jīng)有幾十年的歷史。斑馬魚幼體是光學(xué)透明的，使得對RNA的表示出進(jìn)行定位化、可視化觀察很容易，十分是對特定時期的RNA的表示出進(jìn)行定量觀察[13]。在原位雜交技術(shù)中，需要一個特定標(biāo)記的反義核酸探針根據(jù)堿基互補配對的原則與原始細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，構(gòu)成雜交體，雜交體經(jīng)過顯色反響能夠在顯微鏡下觀察其細(xì)胞或組織中的RNA，顏色的深淺表示RNA表示出的高低，進(jìn)而實現(xiàn)定量和定位[14]的觀察。4.2、藥物挑選North[7]等利用原位雜交技術(shù)研究了幾個代表性的前列腺素沖動劑和拮抗劑對3hpf斑馬魚胚胎的造血干細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)inoleicacid增加了runx1+/myb+干細(xì)胞的數(shù)量，celecoxib減少了這類干細(xì)胞的數(shù)量。5、轉(zhuǎn)基因斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心是將人工分離或修飾過的基因有目的性地導(dǎo)入到生物體基因組中，使得該基因表示出，且該基因和其造成的性狀改變能夠遺傳給下一代。在斑馬魚中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用實際上是通過顯微注射技術(shù)，將外源基因通過注射導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，再通過基因組挑選獲得穩(wěn)定遺傳外源基因的品系[15,16]。在轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型中，尤其值得注意的是表示出熒光蛋白的品系，由于斑馬魚幼魚魚體透明，非常易于在顯微鏡下觀察。表示出熒光蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系已被用于藥物發(fā)現(xiàn)挑選、安全性評估、發(fā)育生物學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)等眾多研究領(lǐng)域。而不同血液細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子或蛋白進(jìn)行標(biāo)記的熒光蛋白的品系，對于研究血液細(xì)胞的特化以及病理生理的變化非常重要，下面介紹幾種常見的表示出熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。5.1、紅系細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系gata1也稱紅系轉(zhuǎn)錄因子1，是gata轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在紅系細(xì)胞分化經(jīng)過中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在斑馬魚紅系細(xì)胞的發(fā)育經(jīng)過中，紅細(xì)胞和紅系骨髓祖細(xì)胞(erythromyeloidprogenitor,EMP)等紅系相關(guān)細(xì)胞高表示出gata1，所以在斑馬魚中g(shù)ata1是紅系細(xì)胞特化和維持的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[17]。在Tg(gata1:dsRed)轉(zhuǎn)基因的斑馬魚胚胎中用熒光顯微鏡觀察斑馬魚胚胎紅系細(xì)胞會表示出特異性紅色熒光。Ferri-Lagneau[18]等利用Tg(gata1:dsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，研究了生姜提取物對體內(nèi)造血的影響，確認(rèn)了生姜提取物促進(jìn)了gata1在紅系細(xì)胞中的表示出，增加了造血祖細(xì)胞標(biāo)志物cmyb和scl的表示出。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)生姜提取物能通過增加表示出gata1紅系細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)苯肼所導(dǎo)致的斑馬魚急性溶血性貧血的造血功能恢復(fù)。Tg(gata1:dsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚標(biāo)記的是紅系的細(xì)胞群體，而華而不實包括紅細(xì)胞、紅系骨髓祖細(xì)胞、不成熟的早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞等[2]。對紅細(xì)胞不同發(fā)育階段的精細(xì)調(diào)控需要更多的階段特征性標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記。Lenard[19]等將Tg(gata1:dsRed)和Tg(globin:GFP)的兩個品系進(jìn)行交配，構(gòu)成具有雙色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。華而不實globin是在紅細(xì)胞中特異表示出的蛋白，通過共定位圖片能夠清楚地觀察到成熟的紅細(xì)胞高表示出gata1和globin，成功地將紅細(xì)胞從紅系細(xì)胞中區(qū)分出來。通過流式的紅色和綠色熒光通道進(jìn)行分群，可以以將紅細(xì)胞從紅系細(xì)胞中分離出來構(gòu)成兩群。Bertrand[20]等利用流式對Tg(gata1:dsRed)和Tg(lmo2:eGFP)共表示出的24-48hpf的斑馬魚胚胎中同時高表示出lmo2和gata-1的細(xì)胞群進(jìn)行分選。對分選后的細(xì)胞的基因表示出進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該群細(xì)胞是同時具有髓系和紅系的特征，該群細(xì)胞并非成熟的紅細(xì)胞而屬于EMP。5.2、髓系細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系斑馬魚中性粒細(xì)胞能夠特異性的表示出髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),MPO高表示出可作為鑒定斑馬魚中性粒細(xì)胞的標(biāo)志。早在18hpf胚胎，就能夠在中間細(xì)胞群檢測到斑馬魚MPOmRNA的表示出，在3dpf(dayspostfertilization)，循環(huán)血細(xì)胞中可以以檢測到MPO的表示出。Mathias[21]等成功構(gòu)建了Tg(mpx:GFP)斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系，并利用該品系研究炎癥反響下斑馬魚中性粒細(xì)胞的趨向性。當(dāng)組織損傷時引起強烈的炎癥反響，其特征是中性粒細(xì)胞迅速向傷口部位聚集。使用體內(nèi)延時成像觀察斑馬魚，可見炎癥誘發(fā)后中性粒細(xì)胞隨即表現(xiàn)為從血管系統(tǒng)向外的逆向趨化。斑馬魚幼魚時期溶菌酶C是由從髓系細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的，所以Hall[22]等將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入斑馬魚溶菌酶C基因的啟動子構(gòu)建了Tg(lyz:eGFP)斑馬魚品系，該品系能夠標(biāo)記部分巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。在上文介紹的斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系Tg(mpx:eGFP)中，表示出熒光信號高的一群細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，熒光信號較低的細(xì)胞亞群，其構(gòu)造特征是巨噬細(xì)胞。Lawson[23]等構(gòu)建的Tg(fli1a:eGFP)斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系被用來研究胚胎損傷的原始巨噬細(xì)胞的行為，但fli1a在原始白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均有表示出，所以此品系特異性較差。為解決這一問題，Ellett[24]等利用巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物mpeg1構(gòu)建斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系Tg(mpeg1:eGFP),mpeg1最初被以為是一個在人類和小鼠巨噬細(xì)胞中特異表示出的基因，隨后被廣泛地用于哺乳動物和斑馬魚中標(biāo)記巨噬細(xì)胞，mpeg1轉(zhuǎn)基因品系的中性粒細(xì)胞不被標(biāo)記，進(jìn)而成功區(qū)分了中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。他們利用這一品系的斑馬魚，比擬了中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞損傷后的不同動態(tài)行為及其互相作用，這為炎癥、感染和白細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域提供了新的研究資源。斑馬魚作為一種新型的形式動物，與傳統(tǒng)的小鼠、大鼠模型相比具有眾多優(yōu)勢，十分是其可視化、高通量、給藥量小、遺傳背景清楚等特點，非常合適研究血液系統(tǒng)的發(fā)育、損傷和修復(fù)，為這一領(lǐng)域提供了一個新穎實用的動物模型。同時流式細(xì)胞技術(shù)、原位雜交技術(shù)、實時熒光定量PCR和固藍(lán)染色在斑馬魚模型的應(yīng)用，以及越來越多斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系的應(yīng)用，為研究血液系統(tǒng)的研究提供了有力的支持。以下為參考文獻(xiàn)[1]KONGE,SHUKC,KWANY.Zebrafishasaninvivomodeltoassessepigeneticeffectsofionizingradiation[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2021,17(12):2108.[2]TRAVERD,PAWBH,POSSKD,etal.Transplantationandinvivoimagingofmultilineageengraftmentinzebrafishbloodlessmutants[J].NatureImmunology,2003,4(12):1238-1246.[3]SINGHVK,GARCIAM,SEEDTM.Areviewofradiationcountermeasuresfocusingoninjury-specificmedicinalsandregulatoryapprovalstatus:partII.Countermeasuresforlimitedindications,internalizedradionuclides,emesis,lateeffects,andagentsdemonstratingefficacyinlargeanim[J].InternationalJournalofRadiationBiology,2021:1-15.[4]儀麗榮.丙二醇對小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用及其機制研究[D].北京:中國疾病預(yù)防控制中心,2022.[5]萇鳳錦,彭代銀.中藥抗輻射作用的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2018,15(07):902-905.[6]TRAVERD,WINZELERA,STERNHM,etal.Effectsoflethalirradiationinzebrafishandrescuebyhematopoieticcelltransplantation[J].Blood,2004,104(05):1298-1305.[7]NORTHTEGWWC.ProstaglandinE2regulatesvertebratehaematopoieticstemcellhomeostasis[J].Nature,2007,447(7147):1007-1011.[8]MIEYALJJ,STARKEDW.Hydroxylationanddealkylationreactionscatalyzedbyhemoglobin[J].MethodsinEnzymology,1994,231(03):573-598.[9]MANALID,JAYADEVJ,RINAC,etal.Todralazineprotectszebrafishfromlethaleffectsofionizingradiation:roleofhematopoieticcellexpansion.[J].Zebrafish,2021,40(01):8-15.[10]SINGHC,ROY-CHOWDHURIS.Quantitativereal-timePCR:recentadvances[M].NewYork:HumanaPress,2021.[11]KULKEAWK,ISHITANIT,KANEMARUT,etal.Coldexposuredown-regulateszebrafishhematopoiesis[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2018,394(04):864.[12]PAFF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