第二次課第二章-DNA重組的克隆操作

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DNA重組克隆的單元操作絕大多數(shù)分子克隆實驗所使用的載體是DNA雙鏈分子，其功能是：（1）為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力。（2）為外源基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。（3）為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。2.1DNA重組的載體基因工程載體必需具備的4個基本條件具有對受體細胞的可轉移性或親和性，以提高載體導入受體細胞的效率。具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點。具有多種單一限制性內切酶位點。具有合適的選擇標記基因。2.1DNA重組的載體2.1DNA重組的載體2.1.1

質粒載體質粒（Plasmid）是一類存在于細菌和真菌細胞中能獨立于染色體DNA而自主復制的共價、閉合、環(huán)狀

DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA），也稱為cccDNA，其大小通常在1-100kb范圍內。2.1DNA重組的載體2.1.1質粒載體2.1.1.1質粒的基本特性1、自主復制性已知的絕大多數(shù)質粒都是雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。除了酵母的殺傷質粒是一種RNA分子外，其他已知的所有質粒無一例外地都是DNA分子。質粒DNA含有自己的復制起始位點（Origin，簡稱ori）以及控制復制頻率的調控基因，有些質粒還攜帶特定的復制因子編碼基因，形成一個獨立的復制子結構（Replicon）。2、可擴增性3、不相容性嚴緊型質粒：在宿主細胞中的拷貝數(shù)較少，一般只有1～5個

松馳型質粒：其拷貝數(shù)較多，一般30～50個，多的可達200～300個。具有相同或相似復制子結構及調控模式的兩種不同的質粒不能穩(wěn)定地存在于同一受體細胞內，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性。在細胞增殖過程中，其中必有一種會被逐漸稀釋、排斥掉。具有不同復制子結構的相容性質粒，盡管它們由于復制機制不同而造成各自的拷貝數(shù)有差異，但在細胞分裂時，每種質粒在兩個子細胞中均可保持等同的拷貝數(shù)，因而它們可以穩(wěn)定地存在于同一受體細胞中。

4、可轉移性結合型質粒（conjugativeplasmid）又叫自我轉移型質粒，其分子量一般都比較大，除攜帶自主復制所必需的遺傳信息外，還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此能從一個細胞自我轉移到另一個細胞中。

非接合型質粒(nonconjugativeplasmid)又叫不能自我轉移型質粒，其分子質量較小，雖然攜帶自主復制所必需的遺傳信息，但不攜帶控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此不能從一個細胞自我轉移到另一個細胞中。2.1.1.2質粒的改造與構建

（1）刪除不必要的DNA區(qū)域，盡量縮小質粒的分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。大于20Kb的質粒很難導入受體細胞，而且極不穩(wěn)定；（2）滅活某些質粒的編碼基因，如促進質粒在細菌種間轉移的mob基因，杜絕重組質粒擴散污染環(huán)境，保證DNA重組實驗的安全，同時滅活那些對質粒復制產生負調控效應的基因，提高質粒的拷貝數(shù)；（3）加入易于識別的選擇標記基因，最好是雙重或多重標記，便于檢測含有重組質粒的受體細胞；（4）在選擇性標記基因內引入具有多種限制性內切酶識別及切割位點的DNA序列，即多克隆接頭（Polylinker），便于多種外源基因的重組，同時刪除重復的酶切位點，使其單一化，以便環(huán)狀質粒分子經酶處理后，只在一處斷裂，保證外源基因的準確插入；（5）根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達調控元件。理想質粒載體的必備條件1、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。2、具有若干限制性內切酶的單一酶切位點。3、具有兩種以上的選擇標記基因。4、缺失mob基因。5、插入外源基因的重組質粒較易導入宿主細胞并復制和表達。2.1.1.3常用的質粒載體（一）克隆質粒用于克隆和擴增外源基因。具有更小的分子量（2686bp）具有多克隆位點1、pBR322質粒及其派生質粒2、pUC系列質粒載體具有更高的拷貝數(shù)?？捎媒M化方法篩選重組體，更方便、更省時。（二）測序質粒這類質粒通常高拷貝復制，并含有多酶切口的接頭片段，便于各種DNA片段的克隆與擴增，在多酶切口接頭片段的兩端鄰近區(qū)域，設有兩個不同的引物序列，使得重組質粒經堿變性后，即可進行DNA測序反應，如pUC18/19系列；另一種測序質粒是M13噬菌體DNA與質粒DNA的雜合分子，如M13mp系列，它們在受體細胞中復制后，可以特定的單鏈DNA形式分泌到細胞外，克隆在這種質粒上的外源基因無需變性即可直接用于測序反應。（三）整合質粒含有整合酶編碼基因以及整合特異性的位點序列，克隆在這種質粒上的外源基因進入受體細胞后，能準確地重組整合在受體細胞染色體DNA的特定位點上。（四）穿梭質粒這類質粒分子上含有兩個親緣關系不同的復制子結構以及相應的選擇性標記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞中復制并檢測，如大腸桿菌鏈霉菌穿梭質粒、大腸桿菌酵母菌穿梭質粒等?？寺≡诖祟愘|粒上的外源基因可以不用更換載體直接從一種受體菌轉入另一種受體菌中復制并且遺傳。

常見的有：大腸桿菌-土壤農桿菌穿梭質粒載體、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體等。（五）探針質粒這類載體被設計用來篩選克隆基因的表達調控元件，如啟動子和終止子等。它通常裝有一個可以定量檢測其表達程度的報告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相應的啟動子或終止子，因此載體分子本身不能表達報告基因，只有當含有啟動子或終止子的外源DNA片段插入到載體合適的位點上，報告基因才能表達，而且其表達量的大小直接反映了被克隆的基因表達控制元件的強弱。（六）表達質粒表達載體應含有：（1）強啟動子。（2）SD序列。（3）強終止子。表達載體可分為非分泌型表達載體分泌型表達載體原核細胞表達載體真核細胞表達載體或2.1.1.4質粒的分離與純化

堿溶法：（1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液中；（2）加入溶菌酶裂解細菌細胞壁；（3）加入SDSNaOH混合液，去膜釋放細胞內含物；（4）加入高濃度的醋酸鉀緩沖液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質；（5）離心取上清液，用苯酚氯仿溶液處理，去除滅活痕量的蛋白質和核酸酶；（6）用乙醇或異丙醇沉淀水相的質粒；（7）用不含有DNase的RNase降解殘余的RNA小分子。

用此法制備的質粒DNA純度較高，制備規(guī)?？纱罂尚?，但操作繁瑣耗時，且質粒DNA中存在著一定比例的開環(huán)結構。沸水浴法：（1）用牙簽將生長在同體培養(yǎng)基上的菌體劃取少許，懸浮在含有EDTA、TritonX100和溶菌酶的緩沖液中；（2）沸水浴中保溫30-40秒鐘；（3）常溫離心，用牙簽挑去沉淀物；（4）乙醇或異丙醇沉淀質粒DNA。

用此法制備的質粒DNA純度不高，收率低且制備規(guī)模小，但速度快，一個工作日至少可處理200個克隆，而且抽出的質粒對酶切反應沒有大的影響。特別適用于重組質粒的快速篩選與鑒定。上述兩種方法分離得到的質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳中均呈現(xiàn)多條帶譜，這是由于質粒的空間結構不同所致。在正常的電泳條件下，各種結構的質粒DNA遷移率的相對大小順序為：cccDNA＞L-DNA（線性）＞OC-DNA（單鏈斷裂）＞D-DNA（二聚體）＞T-DNA（三聚體）。但經合適的限制性內切酶處理后，所有結構的質粒DNA都轉化為直線型分子。從細菌中提取質粒的方法

從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。采用強堿液、加熱可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而cccDNA的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細菌細胞內，共價閉環(huán)質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA，簡稱ocDNA）；如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA）。當提取的質粒DNA電泳時，同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。從細菌中分離質粒DNA的具體操作

材料、設備及試劑一、材料含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管（又稱eppendorf管），離心管架。二、設備微量取液器（20μl，200μl，1000μl），臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒（滅菌鍋），渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑

1、LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）：稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

2、LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。

3、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分裝成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一經使用后便予丟棄。

5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸調pH至5.2，加水定容至100ml，分裝后高壓滅菌，儲存于4℃冰箱。

6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1%SDS。

8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。

9、RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20℃。

10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA和DNA的交聯(lián)，應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羥基喹啉（作為抗氧化劑），并用等體積的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris·Cl（pH8.0）緩沖液反復抽提使之飽和并使其pH值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配于有機相。

11、氯仿：按氯仿：異戊醇=24：1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積=1：1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。

12、TE緩沖液：10mmo/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。

14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

15、電泳所用試劑：⑴TBE緩沖液（5×）：稱取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。⑵上樣緩沖液（6×）：0.25%溴酚藍，40%（w/v）蔗糖水溶液。操作步驟

一、細菌的培養(yǎng)和收集將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基（含50μg/mlAmp）中，37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基（含50μg/mlAmp）中，37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。二、質粒DNA少量快速提取質粒DNA小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。（一）、煮沸法

1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3、將菌體沉淀懸浮于120mlSTET溶液中，渦旋混勻。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），渦旋振蕩3秒鐘。

5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。

7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8、取20ml進行電泳檢查。

[注意]1.對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的質粒DNA中會含有RNA，但RNA并不干擾進一步實驗，如限制性內切酶消化，亞克隆及連接反應等。（二）、堿法

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液