第12章 分子發(fā)光分析法

2023/2/1

儀器分析王元蘭主編

第12章分子發(fā)光分析法molecular

luminescence

analysis

2023/2/1第一節(jié)概述、定義被測物質(zhì)處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并伴隨有光輻射，此種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光。通過測量輻射光的強度對被測物質(zhì)進行定量測定的分析方法稱為分子發(fā)光分析法。2023/2/1、分子發(fā)光的類型：根據(jù)分子受激時所吸收的能源性質(zhì)及輻射機理的不同，分子發(fā)光可分為：1.光致發(fā)光：當分子吸收了光能而被激發(fā)到較高能態(tài)，返回基態(tài)時發(fā)射出波長與激發(fā)光波長相同或不同輻射的現(xiàn)象。

2.熒光：分子受光能激發(fā)后，由第一電子激發(fā)單重態(tài)躍遷回到基態(tài)的任一振動能級時所發(fā)出的光輻射

3.磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一電子激發(fā)三重態(tài)躍遷回到基態(tài)所發(fā)出的光輻射。

4.化學(xué)發(fā)光：基于某些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時，由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)生的化學(xué)能而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物質(zhì)，當回到基態(tài)時發(fā)出光輻射。

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5.電致發(fā)光：吸收電能之后的發(fā)光現(xiàn)象。

6.生物發(fā)光：若化學(xué)發(fā)光是由生物體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的。

熒光和磷光是光致發(fā)光，是吸收受激分子處在不同類型的電子激發(fā)態(tài)時所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。兩者的區(qū)別在于熒光在光照停止后幾乎立即停止，而磷光壽命較長。2023/2/1三、熒光分析法

利用物質(zhì)的分子吸收光所產(chǎn)生的熒光光譜對物質(zhì)進行測定的方法。2023/2/1、熒光和磷光的產(chǎn)生

熒光和磷光是基于*，*n躍遷。第二節(jié)熒光和磷光分析基本原理1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜，在每個電子能級上又包含一系列振動能級和動能級，如圖。2023/2/12023/2/11.單重態(tài)S（singletstate):

一個所有電子自旋都配對的分子的電子態(tài)。2.三重態(tài)T（tripletstate）:分子中電子對的電子自旋平行的電子態(tài)。單重態(tài)與三重態(tài)分子的區(qū)別：1）S態(tài)分子在磁場中不會發(fā)生能級的分裂，具有抗磁性，而T態(tài)具有順磁性；2）電子在不同多重態(tài)間躍遷時需換向，不易發(fā)生；3）S1態(tài)的能量高于T1，S2的高于T2，且S2>T2>S1>T1>S0，T1是亞穩(wěn)態(tài)；4)S態(tài)，T2

態(tài)，T1的壽命不同。2023/2/13.振動弛豫在熒光和磷光分析的溶液體系中，溶質(zhì)和溶劑之間碰撞的概率很大，溶質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子可能將過剩的振動能量以熱能形式將多余的能量傳遞給周圍的溶劑分子，而自身從激發(fā)態(tài)的高振動能級失活，躍遷至同一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，這種現(xiàn)象稱為振動弛豫.4.內(nèi)部轉(zhuǎn)化和系間竄躍

內(nèi)部轉(zhuǎn)化（IC）：相同多重態(tài)間的無輻射去激。系間竄躍（ISC）：不同多重態(tài)間的無輻射躍遷。5.外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換是指溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱能的形式釋放，常常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中。外轉(zhuǎn)換常常會使熒光或磷光減弱或“猝滅”。2023/2/16.熒光發(fā)射和磷光發(fā)射處于S1或T1態(tài)的分子返回S0態(tài)時伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程為輻射去激，分子從S1態(tài)的最低振動能級躍遷至S0態(tài)各個振動能級所產(chǎn)生的輻射光稱為熒光。當受激分子降至S1的最低振動能級后，經(jīng)系間竄躍至T1態(tài)，并經(jīng)T1態(tài)的最低振動能級回到S0態(tài)的各振動能級所輻射的光稱為磷光。2023/2/1二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜1.激發(fā)光譜固定熒光的發(fā)射波長（即測定波長），不斷改變激發(fā)光（即入射光）波長，以所測得的改發(fā)射波長下的熒光強度對激發(fā)光波長作圖，就得到熒光（磷光）化合物的激發(fā)光譜。

2.發(fā)射光譜使激發(fā)光的強度和波長固定不變（通常固定在最大激發(fā)波長處），測定不同發(fā)射波長下的熒光強度，即得到發(fā)射光譜

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3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

①Stokes位移在溶液的熒光光譜中，熒光波長總是大于激發(fā)光的波長，這種波長移動的現(xiàn)象稱為Stokes位移。

原因:

a.激發(fā)分子在發(fā)射熒光前，通過振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換去活過程損失了部分激發(fā)能；b.輻射躍遷可能使激發(fā)分子下降到基態(tài)的不同振動能級，然后通過振動弛豫進一步損失能量；c.溶劑與激發(fā)態(tài)分子發(fā)生碰撞導(dǎo)致能量損失.2023/2/1②

發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)③

鏡像規(guī)則

熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。原因：吸收光譜的形狀取決于第一電子激發(fā)態(tài)的各振動能級的分布，而發(fā)射光譜的形狀取決于基態(tài)各振動能級的分布。而基態(tài)和第一激發(fā)態(tài)的各振動能級分布極為相似。2023/2/1三、熒光效率1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)，能吸收激發(fā)光；（2）吸收了與其本身特征頻率相同的能量后，具有一定的熒光量子產(chǎn)率。2.熒光效率(熒光量子產(chǎn)率)是指熒光物質(zhì)吸收光后發(fā)射出的熒光光量子數(shù)與其所吸收激發(fā)光光量子數(shù)之比.熒光效率越高，輻射躍遷概率就越大，物質(zhì)發(fā)射的熒光也就越強。2023/2/1四、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系強熒光分子都具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)、給電子取代基和剛性平面結(jié)構(gòu)等，而飽和的化合物及只有孤立雙建的化合物，不呈現(xiàn)顯著的熒光。1.共軛π鍵體系發(fā)熒光的物質(zhì)分子中必須含有共軛雙鍵這樣的強吸收基團，且共軛體系越大，π電子的離域性越強，越易被激發(fā)而產(chǎn)生熒光。大多數(shù)能發(fā)射熒光的物質(zhì)為含芳香環(huán)或雜環(huán)的化合物。隨共軛芳環(huán)增大，熒光效率提高，且熒光光譜向長波長方向移動。2023/2/12.剛性平面結(jié)構(gòu)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機分子具有較強的熒光。由于它們與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用比較小，通過碰撞去活的可能性較小，有利于熒光的發(fā)射。3.取代基效應(yīng)芳香化合物的芳香環(huán)上的取代基不同，則物質(zhì)的熒光光譜和熒光強度不同。通常，給電子取代基如—OH、—NH2、—NR2和—OR等可使共軛體系增大，導(dǎo)致熒光增強。而吸電子取代基，如—COOH、—NO、—NO2、鹵素離子等，將減弱甚至?xí)鐭晒狻?.電子躍遷類型電子躍遷為型，熒光很弱或不發(fā)熒光.

類型的躍遷,

發(fā)生熒光輻射強.2023/2/1五、影響熒光強度的因素

1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；2023/2/14.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；2023/2/15.溶液熒光的猝滅碰撞猝滅；氧的熄滅作用等。第三節(jié)熒光和磷光分析儀

2023/2/1一、熒光分析儀器利用熒光進行物質(zhì)定性定量分析的儀器有熒光計和熒光分光光度計，由激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器和信號記錄系統(tǒng)五部分組成。熒光分析儀器有兩個單色器，一個是激發(fā)單色器，置于樣品池前，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個是發(fā)射單色器，置于樣品池和檢測器之間，用于分出某一波長的熒光，消除其它雜散光干擾。2023/2/11.光源常用的光源是高壓汞燈和氙弧燈。2.單色器采用光柵作為單色器。3.樣品池用低熒光的石英材料制成，其形狀是四面透光的方形。4.檢測器檢測器位置與激發(fā)光成直角。熒光計采用光電管作檢測器，熒光分光光度計采用光電倍增管（PMT）作為檢測器。2023/2/1二、磷光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器和信號記錄系統(tǒng)五部分組成。1.樣品室測定低溫磷光一般在液氮溫度(77K)下進行，盛放試液的樣品池需放置在盛液氮的杜瓦瓶內(nèi)。固體表面室溫磷光分析則需特制的樣品室。2.磷光鏡有些物質(zhì)既產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。為了在有熒光現(xiàn)象的體系中測定磷光，常采用一種叫磷光鏡的機械切光裝置，利用熒光與磷光壽命的差異消除熒光干擾。

第四節(jié)熒光分析法和磷光分析法的特點與應(yīng)用

2023/2/1一、熒光和磷光分析法的特點1.熒光分析方法的優(yōu)點

(1)靈敏度高

(2)選擇性強

(3)提供比較多的物理參數(shù)2.磷光分析方法的特點（1）磷光輻射的波長比熒光長（2）磷光的壽命比熒光長二、熒光分析法和磷光分析法的應(yīng)用

2023/2/11.熒光分析法的應(yīng)用很多無機離子能與具有π電子共軛結(jié)構(gòu)的有機化合物形成熒光配合物，故可用熒光法測定。目前采用有機試劑進行熒光分析的元素已近70種，其中較常采用熒光法測定的元素有鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素等。2.磷光分析法的應(yīng)用磷光分析法在藥物分析、臨床分析及環(huán)境分析領(lǐng)域得到了一定的應(yīng)用。它與熒光法互相補充，已成為痕量有機物分析的重要手段。

3.聯(lián)用技術(shù)的檢測器第五節(jié)化學(xué)發(fā)光分析法

2023/2/1吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光分析是利用某些化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射現(xiàn)象而建立的一種分析方法。一、概述該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)、食品科學(xué)、藥物檢測、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)林科研等領(lǐng)域，可以測定數(shù)十種元素、大量無機物質(zhì)和有機化合物。2023/2/1二、基本原理principle1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應(yīng)持續(xù)進行；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2023/2/12.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時刻t的化學(xué)發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt分析物參加反應(yīng)的速率；2023/2/13.化學(xué)發(fā)光強度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學(xué)反應(yīng)：

dc/dt=Kc；K為反應(yīng)速率常數(shù)。定性依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：2023/2/14.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型（1）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；2023/2/1O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3；

氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：2023/2/1c.乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng/cm-3～1g/cm-3；2023/2/1（2）火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在富氫火焰中，也存在著很強的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；a.一氧化氮NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h發(fā)射光譜范圍：660～770nm；

最大發(fā)射波長：690nm；

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O該反應(yīng)十分迅速；2023/2/1b.硫化物揮發(fā)性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強的化學(xué)發(fā)光（藍色）：SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h發(fā)射光譜范圍：350～460nm；

最大發(fā)射波長：394nm；靈敏度：0.2ng/cm-3；

發(fā)射光強度與硫化物濃度的平方成正比。2023/2/1（3）液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

機理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.15～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：

該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。2023/2/15.化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用（1）該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可檢測低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測定某些生物試樣

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通過測定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2023/2/1

草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應(yīng)體系，可發(fā)出很強的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。2023/2/1生物發(fā)光分析應(yīng)用1

在pH7～8；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與磷酸三腺甙(ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺甙(AMP)熒光素和熒光素酸的復(fù)合物和鎂的焦磷酸鹽(ppi)：

ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8復(fù)合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)