柿資源葉片中槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚的含量測定,林業(yè)論文

柿資源葉片中槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚的含量測定,林業(yè)論文柿(DiospyroskakiL.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物,廣泛分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū),我們國家柿屬有64種和變種(型),華而不實(shí)尤以柿資源最為豐富,是我們國家南北各地普遍栽培的食用品種,約有1058份柿品種資源。柿葉、花、皮、根和蒂等均可入藥或有可能成為藥物,華而不實(shí)柿葉入藥始見于(滇南本草〕,謂經(jīng)霜葉敷臁瘡,為中國傳統(tǒng)的中藥材[1]。柿葉味苦、性寒,有抗菌消炎、下氣平喘、生津止渴、清熱解毒、潤肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌等作用,當(dāng)代藥理學(xué)研究表示清楚,柿葉還有軟化血管、降脂降壓、抗氧化、止血、療瘡等多種成效[2],柿葉中含有豐富的維生素C、蘆丁、膽堿、黃酮苷、胡蘿卜素、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的營養(yǎng)成分[3]。當(dāng)前為止,以柿葉為原料開發(fā)飲品、藥品、化裝品、飼料、食品包裝等領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)呈明顯上升趨勢。產(chǎn)品主要有配方中藥風(fēng)干葉、單方成藥腦心清片、柿葉茶、柿葉飲料、美白祛斑化裝品、配方養(yǎng)殖飼料、日本壽司包裝等[4]。當(dāng)前研究表示清楚,不同(品)種植物資源間總黃酮和多酚含量存在顯著的基因型差異[5],關(guān)于柿種質(zhì)資源葉片中維生素C含量變異幅度較大已有報(bào)道外[6],而槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚等柿葉有效成分卻鮮有報(bào)道,且當(dāng)下柿葉中黃酮和多酚主要研究方向?yàn)槠淇寡趸退幚碜饔肹7]。柿資源葉片這一傳統(tǒng)中藥材的試驗(yàn)材料種類逾千種,且藥材原料對藥物有效成分的影響至關(guān)重要,而柿葉中主要有效成分為多酚和黃酮類化合物[2]。因而,本研究通過對111份柿資源葉片中槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚的含量測定和分析,旨在研究柿(品)種槲皮素,山奈酚,粗黃酮和多酚含量的多樣性,不同柿(品)種間含量的差異性,以期挑選出高含量優(yōu)良育種資源,為愈加充分利用我們國家豐富的柿葉資源,并為進(jìn)一步研究和開發(fā)柿葉醫(yī)藥保健品提供參考。1材料與方式方法1.1材料參試材料均采自中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心原陽試驗(yàn)基地(3455.30~3456.45N,11346.24~11347.59E),柿屬資源圃3年生未結(jié)果的柿屬(DiospyrosL.)植物,華而不實(shí)包括金棗柿、油柿(D.OleiferaC)、浙江柿(D.glaucifolia)、美洲柿(D.viriginiana)和君遷子(D.lotusL.)5份柿近緣種、10份野柿(D.kakiThunb.Var.silvestrisM)資源,96份具有代表性的柿(D.kakiL.)栽培品種,共計(jì)111份試驗(yàn)材料,華而不實(shí)所采用柿栽培品種資源我們國家典型的地理區(qū)域,也基本涵蓋我們國家各地區(qū)主栽優(yōu)良品種以及日本甜柿資源。1.2方式方法1.2.1樣品處理每份試驗(yàn)材料選取3~5株樹,每株樹隨機(jī)采集枝條中部無病蟲害的典型葉片,采集時(shí)間為2020年8月28日;低溫冷藏保存帶回實(shí)驗(yàn)室,60℃烘干后粉碎,并過60目篩。1.2.2柿葉中槲皮素、山奈酚提取及含量的測定采用HPLC法[8],稱取試樣粉末3.0g參加甲醇-25%鹽酸(4∶1)90mL,90℃回流5h,放冷,搖勻過濾,置于100mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,過0.45m濾膜,即得供試品溶液;以甲醇溶液作為陰性對照溶液。采用SyncronisC1815m,250mm4.6mm),流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸(V∶V=55∶45),流速1.0mL/min,檢測波長360nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量為10L。配制20g/mL槲皮素和山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液,依次進(jìn)樣5.0、10.0、15.0、20.0和25.0L標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別重復(fù)3次,測定峰面積,得槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=4.1465x-0.1069(R2=0.9995)和y=4.1709x-0.0935(R2=0.9998)。1.2.3柿葉粗黃酮和多酚提取及含量的測定稱取試樣粉末2.0g加入60%乙醇溶液90mL,即料液比為1∶45,95℃索氏提取5h,冷卻過濾,定容100mL,備用。粗黃酮的測定,采用三氯化鋁顯色法[9],取200L樣品溶液,參加5%AlCl3溶液1mL,再用無水乙醇定容至10mL,搖勻,靜置15min后,在420nm處測定其吸光度。以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,配制0.05mg/mL蘆丁60%乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到回歸方程y=25.298x+0.0052,R2=0.9995。樣品中的粗黃酮以蘆丁的含量表示,mg/g。多酚的測定,采用Folin-Ciocalteu法[10]稍加改良。80L樣品溶液,加1.42mL蒸餾水稀釋,然后加1.5mL福林酚試劑,放置3min后,參加15%Na2CO3溶液3.0mL。混合溶液放置3h后測A765nm。以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=11.468x+0.0872,R2=0.9989。樣品中的多酚以沒食子酸的含量表示,mg/g。1.3數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS20.0對柿資源葉片中槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚含量進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等基本描繪敘述,并計(jì)算其多樣性指數(shù)[11]和繪制分布直方圖;對不同地域來源和不同柿類型間進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比擬;同時(shí)采用組內(nèi)歐式平方距離法對111份柿種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析。2結(jié)果與分析2.1柿資源葉片中黃酮和多酚含量的差異性及其分布特征111份柿種質(zhì)資源葉片中黃酮和多酚含量的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)和極值等結(jié)果見表1。由表1可知,柿資源葉片中黃酮和多酚含量的多樣性指數(shù)較高,除粗黃酮的為1.959外,其他成分均在2.0以上,講明柿資源存在豐富的多樣性。不同柿種質(zhì)資源葉片中槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚的變異系數(shù)和極差較大,表示清楚柿資源葉片的黃酮和多酚含量存在明顯的基因型差異。進(jìn)一步分析柿種質(zhì)資源黃酮和多酚含量的種質(zhì)分布,結(jié)果表示清楚(圖1),槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚均符合正態(tài)分布,華而不實(shí)約89.19%種質(zhì)資源的槲皮素含量在0.20~1.98mg/g;約89.19%種質(zhì)資源的山奈酚含量在0.53~1.99mg/g;粗黃酮含量在15.29~24.99mg/g種質(zhì)資源占總資源的82.88%;多酚含量在10.39~64.93mg/g種質(zhì)資源占總資源的86.49%。【1-2】2.2不同來源柿資源間黃酮和多酚含量分析111份柿種質(zhì)資源根據(jù)來源地被分成12個(gè)組群,方差分析及Duncan多重比擬表示清楚(表2)。除槲皮素外,不同來源間山奈酚、粗黃酮和多酚含量均存在顯著的差異性;固然不同來源間槲皮素含量差異不顯著,但仍存在一些差異不同,華而不實(shí)山西資源含量最低(0.75mg/g),僅為最高浙江資源的46.9%;山奈酚含量最高的是我們國家江蘇的品種,平均到達(dá)1.83mg/g(P0.05)顯著高于山西和兩廣地區(qū),最低的山西品種,均值為0.78mg/g(P0.05)顯著低于江蘇地區(qū);粗黃酮含量最高的江蘇品種,均值為26.94mg/g,顯著(P0.05)高于陜西、河南等9個(gè)地區(qū)的品種,并極顯著(P0.01)高于陜西、河南、河北以及國外地區(qū),而國外柿資源的含量最低,僅有19.18mg/g;多酚含量最高的是兩廣地區(qū),均值為70.85mg/g,顯著高于陜西、河南、河北、浙江和陜西地區(qū),并極顯著(P0.01)高于陜西、河南和河北地區(qū),且河北地區(qū)含量最低(29.52mg/g)僅為兩廣地區(qū)的41.7%?！?】2.3不同柿類型間黃酮和多酚含量分析供試材料按柿類型分成柿近緣種、野柿、澀柿品種和甜柿品種4個(gè)類型,方差分析及Duncan多重比擬表示清楚(表3)。柿葉中山奈酚含量與4種類型表現(xiàn)出極顯著的差異性,柿近緣種含量最低,平均值為0.26mg/g,極顯著(P0.01)低于其他3種類型。柿葉中槲皮素、粗黃酮和多酚含量與4種柿類型間未表現(xiàn)出顯著的差異性,但仍存在一定的差異不同,如野柿的多酚含量比柿近緣種含量高,甜柿品種的槲皮素含量略高于柿近緣種。2.4柿資源葉片中黃酮和多酚含量的聚類分析所測數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后,采用組內(nèi)歐式平方距離的系統(tǒng)聚類法,在遺傳距離為15的水平,可將柿種質(zhì)資源分為4個(gè)類群(圖2)。各類群的品質(zhì)參數(shù)見表4。類群Ⅱ種質(zhì)數(shù)量最多為47份,分別占總種質(zhì)數(shù)的42.3%,類群Ⅰ、類群Ⅲ和類群Ⅳ數(shù)量相差無幾,分別為24、19和21份。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),柿資源葉片中黃酮和多酚含量聚類結(jié)果與地域來源和柿類型無關(guān)?！?】分析各類群各成分的均值和變異系數(shù)表示清楚,類群Ⅱ種質(zhì)的槲皮素、山奈酚、粗黃酮和多酚含量均最低,并且變異系數(shù)最大;類群Ⅳ種質(zhì)的槲皮素、山奈酚和粗黃酮和多酚含量均最高,除多酚外其他的變異系數(shù)均最小;類群Ⅰ種質(zhì)的槲皮素、山奈酚較類群Ⅲ偏高,且僅次于類群Ⅳ;類群Ⅲ種質(zhì)的粗黃酮和多酚比類群Ⅰ偏高,僅次于類群Ⅳ。綜合比擬看,4大類群的優(yōu)劣順序?yàn)?類群Ⅳ類群Ⅲ類群Ⅰ類群Ⅱ。【5】3結(jié)論與討論柿資源葉片中黃酮和多酚含量存在豐富的多樣性,即不同柿(品)種間含量存在很大差異。Koh等[5]以為不同基因型對西蘭花中槲皮素、山奈酚和多酚有顯著的影響,費(fèi)學(xué)謙等[12]以為不同柿種柿葉中維生素C和酚類物質(zhì)存在豐富的變異,本研究也有此一樣的結(jié)論。柿葉中黃酮類化合物和多酚含量與傳統(tǒng)中藥材中含量相當(dāng),甚至還要優(yōu)于某些藥材。本研究發(fā)現(xiàn)柿葉中槲皮素含量是金錢草的40多倍,山奈酚為金錢草的80多倍[13],這與覃冬杰等[14]對柿葉的研究結(jié)果相一致。柿葉中的主要成效成分是黃酮類化合物,本研究發(fā)現(xiàn)柿葉中黃酮與枸杞和參的含量相近,是白術(shù)的2倍左右[15]。Zhang等[15]對中國傳統(tǒng)草藥中多酚含量的研究發(fā)現(xiàn),槐花中含量最高為91.33mg/g,最低的半夏為1.09mg/g,柿葉中多酚含量與黃芩和大黃含量相當(dāng)。除槲皮素外,柿葉中山奈酚、粗黃酮和多酚均與地域來源有關(guān)。謝皓等[16]對北京地區(qū)大豆異黃酮含量研究發(fā)現(xiàn),來源地對黃豆黃素沒有顯著性影響,而大豆苷元和染料木素與來源地有極顯著的相關(guān)性。本研究也得到類似的結(jié)論,即除槲皮素與地域來源為表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性外,來源對山奈酚、粗黃酮和多酚均有顯著性影響。柿葉中僅有山奈酚含量與4種類型表現(xiàn)出極顯著的差異性,其他3種有效成分均為表現(xiàn)出相關(guān)性。費(fèi)學(xué)謙等[12]研究發(fā)現(xiàn)柿資源野生種葉片中黃酮含量明顯高于栽培種。本研究卻發(fā)現(xiàn)只要山奈酚含量與柿資源類型有顯著的相關(guān)性,且未表現(xiàn)出野生資源優(yōu)于栽培資源,這可能與參試材料數(shù)量的差異不同和栽植地域的不同有關(guān)。進(jìn)一步分析可知,不同類型柿資源變異系數(shù)較大,講明柿類型內(nèi)部存在豐富的差異性。除此之外,本試驗(yàn)對黃酮和多酚含量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果顯示,柿資源葉片黃酮類化合物和多酚含量與地域來源和種質(zhì)類型均無關(guān)。李穎睿等[17]對黃淮冬麥區(qū)小麥品種植酸含量與植酸酶活性聚類分析表示清楚,其聚類結(jié)果與品種來源無必然聯(lián)絡(luò),孫建等[18]對芝麻種質(zhì)資源葉綠素含量聚類分析發(fā)現(xiàn),聚類結(jié)果與種質(zhì)類型沒有明顯的規(guī)律性,這均佐證了本研究的結(jié)果。本文采用系統(tǒng)聚類法將柿種質(zhì)聚成4大類群,華而不實(shí)類群Ⅳ為黃酮類化合物和多酚高含量類群,共有21份柿種質(zhì)資源,占總種質(zhì)的18.92%,華而不實(shí)澀柿資源13份,甜柿資源4份,野柿資源4份。類群Ⅳ中甜、澀柿資源所占比例較高,這些資源可發(fā)展為柿葉用林資源,為優(yōu)良資源的選育提供