第06章 免疫沉淀試驗

臨床免疫學檢驗技術

第六章免疫沉淀試驗

秦雪目錄第一節(jié)免疫沉淀試驗的基本原理第二節(jié)液相免疫沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗第四節(jié)免疫沉淀試驗的臨床應用第五節(jié)臨床常用免疫沉淀試驗試劑方法特點第六節(jié)影響免疫沉淀試驗的主要因素第一節(jié)免疫沉淀試驗的基本原理一二三免疫沉淀試驗的特點免疫沉淀試驗的分類

基本原理

第一節(jié)免疫沉淀試驗的基本原理一、基本原理：沉淀反應將可溶性抗原與相應抗體置于溫度、酸堿度適宜的一定電解質(zhì)溶液中，兩者按適當比例形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)，并根據(jù)所形成的沉淀物計算待測抗原或抗體的含量。

二、免疫沉淀試驗的分類

液相沉淀試驗

凝膠內(nèi)沉淀試驗

環(huán)狀免疫沉淀試驗絮狀免疫沉淀試驗透射免疫比濁試驗散射免疫比濁試驗免疫擴散試驗免疫電泳技術

第一節(jié)免疫沉淀試驗的基本原理三、免疫沉淀試驗的特點1.階段性免疫沉淀試驗分兩個階段，第一階段為抗原抗體特異性結合，形成不可見的可溶性免疫復合物；第二階段則形成可見的免疫復合物。2.特異性免疫沉淀試驗為抗原與相應抗體發(fā)生特異性結合反應的過程，因此具有特異性。3.抗原性質(zhì)參與免疫沉淀試驗的抗原必須為可溶性抗原。4.抗體的選擇多克隆抗體與抗原多個表位結合，易形成沉淀，故非常適用于免疫沉淀試驗；單克隆抗體只與抗原一個表位結合，不易形成交聯(lián)。若抗原表面有兩個以上相同的表位，單克隆抗體也可用于免疫沉淀試驗。第一節(jié)免疫沉淀試驗的基本原理第二節(jié)液相免疫沉淀試驗一二免疫濁度測定

絮狀免疫沉淀試驗液相免疫沉淀試驗（liquidphaseimmunoprecipitationtest）是指可溶性抗原與相應抗體在含有電解質(zhì)的液相介質(zhì)中反應，形成肉眼可見的沉淀物。根據(jù)實驗方法和所形成的免疫復合物呈現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象的不同，可將液相免疫沉淀試驗分為環(huán)狀免疫沉淀試驗、絮狀免疫沉淀試驗和免疫濁度測定。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗（flocculation）是可溶性抗原與相應抗體特異結合，在電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見的絮狀沉淀物。此方法受抗原抗體比例的影響非常明顯，常用來作測定抗原抗體反應的最適比例。有抗原稀釋法、抗體稀釋法和方陣滴定法三種操作方法。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗二、免疫濁度測定（immunoturbidimetry）原理：可溶性抗原與相應抗體特異性結合，兩者在比例合適和增濁劑作用下，可快速形成較大的免疫復合物，使反應液出現(xiàn)濁度；當反應液中保持抗體過量且濃度固定時形成的免疫復合物隨抗原量增加而增加，反應液的濁度也隨之增加，即待測抗原量與反應液的濁度成正相關；與標準曲線比較，即可計算出待測抗原的含量。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗（一）透射免疫比濁試驗1.原理可溶性抗原與相應抗體在一定緩沖液中結合形成免疫復合物，使反應液濁度發(fā)生改變，當一定波長的光線通過反應液時，被其中的免疫復合物反射、吸收而引起透射光減少，可用吸光度表示，吸光度與免疫復合物的含量成正比，在保持抗體過量的條件下，吸光度與抗原量成正比。2.方法學評價（1）優(yōu)點：操作簡便、快速、結果準確性較好、能用全自動或半自動儀器進行測試、敏感度比單向免疫擴散試驗高5倍～10倍。（2）缺點：1）抗體用量大；2）耗時長；3）抗原或抗體極度過剩時易導致免疫復合物分離；4）不宜用于藥物半抗原的檢測。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗（二）散射免疫比濁試驗1．原理利用抗原抗體在液相中特異性結合后產(chǎn)生一定大小的免疫復合物，當一定波長的光通過該反應液遇到免疫復合物時光線發(fā)生散射現(xiàn)象，散射光的強度與免疫復合物的含量和散射夾角成正比，與入射光波長成反比。當散射夾角和入射光波長一定時，散射光的強度與免疫復合物的含量成正比，當反應體系中保持抗體過量時，形成的免疫復合物含量又與抗原含量成正比。應用標準品制作標準曲線，通過檢測散射光強度即可計算出待測標本中的抗原含量。根據(jù)散射光檢測時間及檢測方式的不同，散射免疫比濁試驗又分為終點散射比濁試驗和速率散射比濁試驗兩種。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗2.終點散射比濁試驗所謂“終點”是指在抗原抗體反應達到平衡時測定散射光強度。在抗原抗體反應的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，計算出的結果會產(chǎn)生較大的誤差。散射免疫比濁試驗是避開了抗原抗體反應的不穩(wěn)定階段，在抗原抗體反應的最佳時段讀數(shù)，將誤差降到最低，且必須在免疫復合物相互聚合形成絮狀沉淀前完成測定，否則光散射值降低，得出偏低的結果。終點散射比濁試驗是在免疫反應進行到一定時間時測量其濁度，故亦稱定時散射比濁試驗。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗2.終點散射比濁試驗終點散射比濁試驗是在抗原抗體反應達到平衡時測定散射光強度。其檢測敏感度較高，達μg/L水平，高于透射免疫比濁試驗，但低于速率散射比濁試驗，可用自動化分析；在抗原抗體反應的第一階段，反應時間較長，不合快速檢測，計算時需減去本底值，在微量測定時，本底的干擾會影響準確測定。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗3.速率散射比濁試驗所謂“速率”是指單位時間內(nèi)抗原與抗體反應的速度或免疫復合物形成的量，而不是免疫復合物累積產(chǎn)生的量?？乖c抗體混合后瞬間即發(fā)生反應，在抗體過量的情況下，抗原抗體反應速度由慢到快，在單位時間內(nèi)產(chǎn)生的免疫復合物不斷增多，隨后逐漸減慢，在此變化過程中，在某一時間點抗原抗體反應速率最快，單位時間內(nèi)產(chǎn)生的免疫復合物含量達到最大值，散射光強度變化亦最大，此即為速率峰。速率峰的峰值與抗原濃度成正相關。選取速率最大，且與被測抗原濃度變化呈線性關系的速率峰值，制作劑量-反應曲線，即可計算出被測抗原的濃度。速率散射比濁試驗具有速度快、靈敏度和精密度高、特異性強、穩(wěn)定性好、檢測范圍寬、自動化程度高、節(jié)省試劑等優(yōu)點；但儀器試劑比較貴、對抗體的質(zhì)量要求較高。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗（三）膠乳增強免疫濁度測定將抗體吸附在大小合適、均勻一致的膠乳顆粒上，當遇到相應抗原時，使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波長范圍內(nèi)不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時透射光減少，減少的程度與膠乳顆粒凝聚程度成正比，同時與待測抗原含量成正比。通過檢測光強度變化即可計算出待測樣品中抗原的含量。第二節(jié)液相免疫沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗一二三免疫電泳技術雙向免疫擴散試驗

單向免疫擴散試驗凝膠內(nèi)沉淀試驗（gelphaseprecipitation）利用可溶性抗原和相應抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。凝膠內(nèi)沉淀試驗可分為：單向免疫擴散試驗雙向免疫擴散試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗一、單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗：先將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測的抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑或面積的大小與抗原含量呈正相關。根據(jù)試驗形式可分為試管法和平板法兩種，試管法因沉淀環(huán)不易觀察及定量，目前較少應用。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗一、單向免疫擴散試驗（平板法）傾注平板→打孔→加樣→放置37℃→24～48h觀察沉淀環(huán)第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗一、單向免疫擴散試驗（平板法）抗原量與環(huán)直徑關系的兩種計算方法1.Mancini曲線：大分子抗原（IgM）長時間擴散＞48h常數(shù)K＝C∕d2普通坐標紙曲線（C為抗原濃度，d為沉淀環(huán)直徑）第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗2.Fahey曲線：小分子抗（IgG,IgA）擴散時間較短24h常數(shù)K＝logC∕d半對數(shù)坐標紙曲線（C為抗原濃度，d為沉淀環(huán)直徑)第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗一、單向免疫擴散試驗（平板法）抗原量與環(huán)直徑關系的兩種計算方法二、雙向免疫擴散試驗雙向免疫擴散試驗將抗原和抗體加在同一瓊脂板對應孔中，各自向對方擴散，在濃度比例恰當處形成沉淀線，觀察沉淀線的位置、形狀及對比關系，可對抗原或抗體進行定性分析。根據(jù)試驗形式可分為試管法和平板法。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗二、雙向免疫擴散試驗（平板法）平板法是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一?；静襟E是：打孔→在各對應孔中加入抗原或抗體→濕盒37℃18h～24h→觀察沉淀線。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗二、雙向免疫擴散試驗（平板法）

應用：

1.判斷抗原或抗體的存在以及估計相對含量

2.分析抗原或抗體相對分子量

3.分析抗原的性質(zhì)第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗4.抗體效價的滴定5.鑒定抗原或抗體純度第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗三、免疫電泳技術免疫電泳技術（immunoelectrophoresistechnique）是電泳分析與免疫沉淀試驗相結合的產(chǎn)物，是直流電場作用下的凝膠擴散試驗，是將抗原抗體反應的高度特異性與電泳技術的高分辨率及快速、微量等特性相結合的一種免疫化學技術。優(yōu)點：①加快了沉淀反應的速度；②抗原抗體的擴散方向固定集中，提高了靈敏度；③可先利用蛋白組分所帶電荷的不同而將其進行分離，再分別與抗體反應。分類：對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳、交叉免疫電泳和自動化免疫電泳等多項實驗技術。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗

雙向免疫擴散+電泳技術（負極）抗原等電點低，帶較強的負電荷，分子量小，在電場中向正極移動（正極）抗體等電點偏高，帶負電荷較少，且分子量較大，在電滲作用下，抗體移向負極抗原抗體濃度最適比處形成沉淀線比雙向免疫擴散法靈敏度提高8倍～16倍

第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（一）對流免疫電泳

原理：（一）對流免疫電泳結果分析：1.無沉淀線出現(xiàn)說明無相應的抗原2.沉淀線出現(xiàn)于抗原抗體孔中間，說明兩者比例適合3.沉淀線接近抗原孔，表明抗體濃度＞抗原，反之，則是抗體濃度＜抗原濃度對流免疫電泳結果圖第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（二）火箭免疫電泳單向免疫擴散與電泳相結合的定量檢測技術原理：將抗體混合于瓊脂中，電泳時，抗體不移動，抗原由負極向正極泳動，并隨抗原濃度的減少，抗原泳動的基底區(qū)也逐漸變窄，抗原抗體免疫復合物形成的沉淀線也越來越窄，形成一個火箭狀的不溶性復合物沉淀峰。當瓊脂中的抗體濃度保持不變時，沉淀峰的高度與抗原量呈正比例關系，用已知濃度標準抗原作對照，制作標準曲線，即可根據(jù)沉淀峰的高度從標準曲線中計算出待測抗原的濃度。反之，固定抗原的濃度，便可檢測抗體的含量（稱為反向火箭電泳）。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（二）火箭免疫電泳結果判斷：抗體濃度不變→沉淀峰高度與抗原量呈正相關抗原濃度不變→沉淀峰高度與抗體量呈正相關（反向火箭電泳）繪制標準曲線，就可根據(jù)沉淀峰的高度在標準曲線中計算出待測樣品濃度。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（二）火箭免疫電泳①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（三）免疫電泳區(qū)帶電泳＋雙向擴散基本原理：先將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中作區(qū)帶電泳，根據(jù)其所帶電荷、分子量和構型不同分成不可見的若干區(qū)帶，然后，沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應抗血清，進行雙向擴散，兩者比例適合處形成弧形沉淀線。通過對沉淀線的數(shù)量、位置和形態(tài)與已知標準抗原抗體生成的沉淀線比較，即可對待測樣品中所含成分的種類和性質(zhì)進行分析。應用：分析純化抗原和抗體的成分。正常異常免疫球蛋白的識別與鑒定。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗免疫電泳流程圖第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（三）免疫電泳免疫電泳結果示意圖第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（四）免疫固定電泳區(qū)帶電泳+沉淀反應原理：先將血清蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上經(jīng)區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清加在凝膠表面的泳道上，經(jīng)孵育后，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透并擴散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應，洗脫游離的抗體，形成的抗原抗體復合物則保留在凝膠中。經(jīng)漂洗和染色，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被著色，根據(jù)電泳移動距離分離單克隆組分，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。最大的優(yōu)勢：分辨率強，敏感度高，操作周期短，結果易分析。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（四）免疫固定電泳左圖為IgGκ型，中圖為IgGλ型，右為正常

第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（四）免疫固定電泳應用：用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白輕鏈，尿液、腦脊液等微量蛋白，游離輕鏈，補體裂解產(chǎn)物等，目前已作為常規(guī)檢測。臨床最常用于M蛋白的鑒定。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（五）交叉免疫電泳區(qū)帶電泳+火箭免疫電泳定量檢測技術應用：適用于比較各種蛋白組分，定性分析蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)性、微小異質(zhì)性、裂解產(chǎn)物和不正常片段等。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗（六）自動化免疫電泳電泳系統(tǒng)（自動化電泳儀）光密度掃描系統(tǒng)+優(yōu)點：分辨率高、重復性好第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗第四節(jié)免疫沉淀試驗的臨床應用1.經(jīng)典的沉淀反應均可用于抗原抗體性質(zhì)、效價、純度及相對分子質(zhì)量和濃度的分析2.免疫濁度法目前主要用于蛋白質(zhì)的測定，如血液中的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ輕鏈、λ輕鏈，補體C3、C4，血漿蛋白，C-反應蛋白，類風濕因子等；尿及腦脊液微量蛋白和半抗原（激素、毒物、治療性藥物等；還可用于血漿藥物濃度的測定

第四節(jié)免疫沉淀試驗的臨床應用3.對流免疫電泳與火箭免疫電泳技術因存在電滲作用，目前已不推薦使用4.免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結果較難分析5.免疫固定電泳技術因分辨力強，敏感度高，結果易于分析，現(xiàn)常用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白輕鏈，尿液、腦脊液等微量蛋白，游離輕鏈，補體裂解產(chǎn)物等，臨床最常用于M蛋白的鑒定與分型，并已列入臨床實驗室的常規(guī)檢測工作第五節(jié)臨床常用免疫沉淀試驗試劑方法特點一、在全自動生化分析儀中的應用（一）單試劑單波長法（二）單試劑雙波長法（三）雙試劑單波長法（四）雙試劑雙波長法二、在血液凝固分析儀中的應用三、在半自動電泳儀中的應用四、在特種蛋白免疫分析儀中的應用第六節(jié)影響免疫沉淀試驗的主要因素一二反應環(huán)境因素

抗原抗體自身因素一、抗原抗體自身因素（一）抗原因素1.抗原的理化性狀參與免疫沉淀試驗的抗原必須為可溶性抗原，否則無法形成肉眼可見的沉淀現(xiàn)象2.抗原表位與種類天然抗原常為多價，參與免疫沉淀試驗的抗原表面相同表位越多，越容易與相應抗體相互交聯(lián)成立體網(wǎng)格狀聚集體，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物第六節(jié)影響免疫沉淀試驗的主要因素（二）抗體因素1.抗體的來源家兔等大多數(shù)動物的免疫血清較人和馬的免疫血清具有更寬的等價帶，與相應可溶性抗原結合更易出現(xiàn)可見的沉淀物。而單克隆抗體一般不適合用于免疫沉淀試驗，大多數(shù)情況下都是用多克隆抗體。2.抗體的質(zhì)量用于免疫沉淀試驗的抗