生物大分子分離純化技術(shù)

《生物大分子分離純化技術(shù)》生物大分子制備基本技術(shù)第一章概述生物大分子：蛋白質(zhì)酶核酸是生命現(xiàn)象基本體現(xiàn)者。是一切生命活動的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

生物大分子的制備是一件十分細(xì)致的工作，涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等多學(xué)科的知識。生物大分子、不能熔化、蒸發(fā)，所能分配的物相只限于固相和液相。

一、分離原理：

1.利用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個或幾個物相中。如鹽析、有機(jī)溶劑抽提、層析、結(jié)晶等。2.將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離目的。如離心、電泳、超濾等。二、生物大分子分離、純化方法類型

性質(zhì) 具體方法 分子大小和形態(tài)差速離心、超濾、分子篩、透析溶解度鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配、結(jié)晶電荷差異電泳、電滲析、等電點沉淀、離子交換層析、吸咐層析生物功能專一性親和層析色譜吸附＋＋＋＋＋＋＋＋分配＋＋＋＋＋＋＋＋＋離子交換樹脂＋＋＋＋＋＋－＋多聚糖±＋＋＋＋－分子篩＋＋＋＋＋±氣相＋＋＋＋＋＋＋＋＋逆流分配＋＋＋＋＋＋＋＋＋電泳

自由溶液＋＋＋＋＋＋＋聚乙烯介質(zhì)＋＋＋＋＋＋＋纖維素＋＋＋＋＋＋－凝膠＋＋＋＋＋＋±±等電聚焦±＋＋＋－－沉降＋＋＋＋－±膜穿透（透析）和擴(kuò)散＋＋＋＋＋±±溶解度＋＋＋＋＋＋＋＋＋方法分子大小分子電荷分子相互作用氫鍵結(jié)合疏水鍵結(jié)合

以溶質(zhì)物理性質(zhì)為基礎(chǔ)的各種分離方法

生化分離方法分類表

分離方法

推動力F1

阻滯力F2占優(yōu)勢的作用力分離主要的依據(jù)一．色譜（a）吸附

（b）離子交換

（c）分配

（d）分子篩二．逆流分配三．電場力（a）在自由溶液中（b）在多孔支持物中

（c）在凝膠支持物中

（d）等電聚焦（e）對流電泳

（f）電滲析

四．?dāng)U散方法（a）透析（b）超濾（c）在溶液中熱擴(kuò)散

五．結(jié)晶

六．沉降（a）動力學(xué)的（b）等密度的

流體動力

流體動力

流體動力

流體動力機(jī)械作用

靜電引力靜電引力

靜電引力

靜電引力靜電引力電動力靜電引力

電動力滲透力流體動力溫度梯度重力結(jié)晶格子能

重力、離心力離心力

表面能，范德瓦氏力位阻效應(yīng)

靜電引力，極化度分子篩效應(yīng)

擴(kuò)散，偶極作用，締合和解離效應(yīng)滲透作用,滲透，締合和解離效應(yīng)

分子摩擦力，極化度動電作用分子摩擦力，極化度動電作用，表面能分子篩效應(yīng)

分子摩擦效應(yīng)

分子篩效應(yīng)

電動力分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)，表面能（吸附）分子摩擦效應(yīng)

擴(kuò)散

分子摩擦效應(yīng)

F2

F2

F2

F2F2

F1F1

F1和F2

平衡作用F1

F1和F2

F2F2F2

F1

F1平衡作用

極性、位阻因素離子性質(zhì)分子大小極性因素

分子大小極性因素

離子性質(zhì)離子性質(zhì)

離子性質(zhì)分子大小離子性質(zhì)離子性質(zhì)

分子大小離子性質(zhì)

分子大小分子大小分子大小

分子大小形狀

分子大小分子大小介質(zhì)密度

（細(xì)胞外液）

（細(xì)胞內(nèi)液）發(fā)酵液→預(yù)處理→細(xì)胞分離→細(xì)胞破碎→碎片分離→提取→精制→成品制作

加熱過濾勻漿法離心沉淀（重結(jié)晶）濃縮調(diào)pH離心研磨法雙水相吸附離子交換干燥絮凝膜分離酶解法膜分離萃取色譜分離無菌過濾超濾膜分離成型結(jié)晶

圖1-1生物工業(yè)下游技術(shù)一般工藝過程

三．生物大分子的制備過程一般可分為五個階段（1）材料的選擇和預(yù)處理（2）細(xì)胞的破碎及固液的分離（3）提?。?）純化（包括鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、有機(jī)溶劑抽提、層析、超離心、結(jié)晶）（5）濃縮、干燥及保存

生物體內(nèi)某一組份，特別是未知結(jié)構(gòu)的組份的分離制備設(shè)計，大致可分為五個基本階段：1.確定制備物研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法。2.制備物物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗。3.材料處理及抽提方法的選擇。4.分離純化方法的摸索。5.獲得制備物以后，均一性的測定。

分離純化是整個生化制備過程的核心部分。生物體的組成成分千千萬萬種，分離純化的實驗方案也千變?nèi)f化。沒有一種分離純化方法可適用于所有物質(zhì)的分離純化，一種物質(zhì)也不可能只有一種分離純化方法。所以對于某一種物質(zhì)，究竟選用什么分離純化方法最理想，主要是根據(jù)該物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)和具體實驗條件而定。認(rèn)真參考借鑒前人經(jīng)驗可以避免許多盲目性，節(jié)省實驗摸索時間。即使是分離一個新的未知組分，根據(jù)分析和預(yù)試驗的初步結(jié)果，參考別人對類似物質(zhì)分離純化經(jīng)驗，也可以幫助少走彎路。

分析鑒定方法指導(dǎo)生物大分子分離制備工作的分析鑒定方法大致可分為三種類型：1.生物學(xué)測定方法2.理化測定方法3.理化方法與生物學(xué)方法結(jié)合測定1.生物學(xué)測定方法

對一個未知結(jié)構(gòu)的新物質(zhì)，生物學(xué)測定方法常常比一般理化學(xué)方法具有更大優(yōu)越性，且是實驗取得成功必不可少的一步，生物測定方法全面涉及生物學(xué)個科的實驗內(nèi)容，如微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、組織解剖學(xué)、藥理學(xué)及動植物形態(tài)分類學(xué)等。生物測定方法很多，而且每一測定方法具體規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)及條件各不相同，其詳細(xì)內(nèi)容的介紹可參看有關(guān)專著及資料。生物測定方法雖有很高特異性，但手續(xù)繁瑣，對于指導(dǎo)分離制備實驗的進(jìn)行，時間上太受限制。2.理化測定方法

這是最常用最方便的分析測定方法，因此，對于一個未知化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如生物反應(yīng)測定確定其存在后，應(yīng)立即著手建立理化測定方法。理化測定方法的建立一般是先進(jìn)行預(yù)試，初步肯定該物質(zhì)屬于哪一類有機(jī)物，然后按各類有機(jī)物質(zhì)的特殊物理化學(xué)性質(zhì)建立定性、定量鑒定方法，這類方法常有：（1）呈色法：包括染色和比色法。（2）色譜法：包括紙上色譜、薄層色譜、氣相色譜和高效掖相色譜等。（3）光譜法：包括紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜等。（4）電泳法：包括紙電泳、凝膠電泳等。（5）核磁共振波譜法。（6）其他：如電子顯微鏡觀察。理化測定方法的最大優(yōu)點是實驗操作簡便快速，能及時指導(dǎo)分離制備工作。3．理化方法與生物學(xué)方法結(jié)合測定

對于某些生物體內(nèi)含量較低，或所建立的理化測定方法的特異性和靈敏度不足以反映該物質(zhì)定性與定量的要求時，常需要結(jié)合生物學(xué)測定方法才能全面地準(zhǔn)確地反映該物質(zhì)的存在情況。理化分析方法與生物學(xué)測定方法相結(jié)合，用于各類抗菌素、信息素、激素、維生素和各種具有生理活性的生化藥物的定性及定量相當(dāng)普遍。

制備物均一性的鑒定

對一個新分離的物質(zhì)是否純，常用“均一性”表示，均一性即指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分。蛋白質(zhì)均一性常用的幾種鑒定方法：1.溶解度法：2.電泳均一性的測定法：3.高速離心沉淀法：1.溶解度法：這是主要根據(jù)Gibb相律理論而建立的一種經(jīng)典方法。Gibb相律理論認(rèn)為，一個單一成分的物質(zhì)在一定條件下其溶解度是一定的。因此，當(dāng)某一物質(zhì)在溶劑中的溶解度達(dá)到飽和時，其溶解曲線有著非常明顯的轉(zhuǎn)折點。在實際應(yīng)用時，常選擇幾個不同PH和離子強(qiáng)度的條件進(jìn)行，使所得結(jié)果更加準(zhǔn)確。溶解度測定法操作簡單，方法也很靈敏。它不僅用于蛋白質(zhì)，也可用于其他物質(zhì)的純度測定。但因需要大量的樣品，現(xiàn)在已很少應(yīng)用。2.電泳均一性的測定法：早期在自由溶液中，測定在不同PH及離子強(qiáng)度條件下帶電物質(zhì)的電泳遷移率，以表示電泳的均一性，但在實際操作中常存在許多影響因素，難以達(dá)到理想程度。前沿電泳法則主要由于分辨率較低及使用的儀器和操作都比較復(fù)雜，所以使用的人不多。此外，以上兩種方法樣品用量也比較多，故已漸漸被凝膠電泳所代替。凝膠電泳不僅具有電泳作用，同時還具有分子篩作用。因此有極高的分辨能力。如SDS可以檢測出10-9至10-12克樣品的含量，含量10-15微克分子的蛋白質(zhì)或5-10微克左右的核酸在一定的PH下能做出很漂亮的均一性實驗結(jié)果。凝膠電泳在測定樣品均一性的同時，還可以分析鑒定樣品分子大小和形狀。是目前許多生物大分子普遍采用的均一性鑒定的方法。用凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)均一性測定時，一般都需要變換二至三種PH值進(jìn)行實驗，才能對所得結(jié)果是否均一加以評定.近年來，還發(fā)展了各種免疫電泳和最近流行專門檢驗糖蛋白使用的親和電泳。它們都是由凝膠電泳衍生出來的。具有更專一，操作更簡便的優(yōu)點。3.高速離心沉淀法：是一個測定蛋白質(zhì)及其他生物大分子均一性的經(jīng)典方法，在理論上這一方法是完善的。主要問題是離心設(shè)備本身的缺陷，以至每個組分在離心管中所能移動的距離很短。如果每個組分的分子大小、形狀、帶電性質(zhì)差別不大時，由于影響分子移動的各種因素綜合平衡的結(jié)果，往往使各組分所受的力場作用相等，于是就很難區(qū)分。所以使用高速離心沉降方法測定物質(zhì)的均一性，其精確度的提高受到一定限制。但由于其具有測定時間短，樣品用量少等優(yōu)點，現(xiàn)仍是經(jīng)常使用的方法之一。A：溶解性能

1.在水或各種稀鹽溶液中的溶解性能；2.在弱極性溶劑中溶解性能（如甲醇、乙醇、丙酮等）3.在各種非極性溶劑中的溶解性能（如氯仿和各種烴類等）B：溶液穩(wěn)定性

1.PH穩(wěn)定范圍2.溫度效應(yīng)3.各種緩沖溶液的影響4.有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮等）的影響C：固態(tài)時穩(wěn)定性1.溫度影響；2.水分含量的影響；3.低壓凍干效應(yīng)D：物理性質(zhì)

1.透過不同大小孔徑膜的能力；2.在固體上的吸附作用；3.在電場中每一PH變化的遷移值；4.在超離心力場中的沉淀作用。E：化學(xué)性質(zhì)

1.對胰蛋白酶及其他蛋白水解酶作用的穩(wěn)定性；2.對Dnase和Rnase作用的穩(wěn)定性；3.對糖類分解酶作用的穩(wěn)定性；4.在溫和條件下乙?；饔玫姆€(wěn)定性；5.對亞硝酸作用的穩(wěn)定性；6.在溫和條件下酯化作用的穩(wěn)定性。四.生物大分子分離制備方法的特點

（1）生物材料組成非常復(fù)雜。一種生物材料常包括數(shù)種甚至數(shù)千種化合物，各種化合物的形狀，大小、分子量和理化性質(zhì)都不相同，其中有些分子化合物至今還是未知物質(zhì)，而且在分離時仍在代謝變化中。

（2）有些化合物在材料中含量極微。

1/萬—1/100萬。

（3）許多具有生物活性的化合物穩(wěn)定性差。

一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境，很易失活。因此，在分離過程中要十分小心保護(hù)這些化合物的生理活性。

（4）生物大分子的分離方法經(jīng)驗性強(qiáng)。實驗幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種參數(shù)（T、pH值、離子強(qiáng)度）構(gòu)成的綜合影響常常無法固定，以致許多實驗的設(shè)計理論性不強(qiáng)，實驗結(jié)果常常有很大經(jīng)驗成份。因此，一種分離技術(shù)的建立，從材料到方法直至各種環(huán)境條件，使用的試劑藥品等都必須嚴(yán)格地加以規(guī)定。（5）生物大分子分離方法多采用溫和的“多階式”方法進(jìn)行。

一個生物分子的分離制備常常少則幾個，多至十幾個步驟，并不斷變換各種分離方法，以達(dá)到純化目的。（6）對其均一性的評定常常是有條件的，與化學(xué)上純度的概念并不完全相同。（7）嚴(yán)格防止污染。外界污染、體系中重金屬離子、細(xì)胞自身酶系及其他有毒物質(zhì)的污染。五．工藝次序的選擇策略

(1)工藝流程應(yīng)由不同機(jī)理的分離單元組成。(2)盡快分離、去除含量多的雜質(zhì)。通常運(yùn)用非特異、低分辨率的操作單元，如沉淀、超濾和吸咐等，盡快縮小樣本體積，提高產(chǎn)物濃度。(3)盡早采用高效分離手段。(4)將最昂貴、最費時的分離單元放在最后階段。（一）

分離純化的早期使用方法的選擇早期分離純化使用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法比較有利。這些方法不僅負(fù)荷能力大，一次分離的量多，同時可以除去大部分理化性質(zhì)相差較大的雜質(zhì)，兼有分離提純和濃縮的作用，可為以后的分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。離子交換樹脂有時用于早期純化，纖維素離子交換色譜也常直接用于粗抽提中進(jìn)行多種蛋白質(zhì)的制備，沒有出現(xiàn)明顯的同位效應(yīng)，且具有較高的負(fù)荷能力。親和色譜法由于具有極高的生物特異性，分離目的物受到理化性質(zhì)相似的雜質(zhì)干擾極少，能從比較復(fù)雜的組織抽提液或細(xì)菌發(fā)酵液中一步提取分離出所需的物質(zhì)，提純倍數(shù)可達(dá)一百倍以上。早期分離提純的方法，選擇的原則一般是從低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大為合適。但隨著許多新技術(shù)的建立，一個特異性方法其分辨能力越高，便意味著提純步驟的簡化，提純步驟的減少，回收率越高，具有生理活性物質(zhì)變性的危險性就越少。

（二）各種分離純化方法的使用程序分離方法常根據(jù)分離物質(zhì)的分配系數(shù)、分子量大小、離子電荷性質(zhì)及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素構(gòu)成不同分離方法的基礎(chǔ)。而每一種分離方法又都在特定條件下發(fā)揮作用的。因此，在相同或相似的條件下連續(xù)作用同一種分離方法就不大適宜。各種分離方法的交叉使用對于除去大量理化性質(zhì)相近的雜質(zhì)也較為有效。某些雜質(zhì)在各種條件下帶電性質(zhì)可能與制備相似，但在某種條件下與制備物相差較大；而另一些雜質(zhì)的分子大小形狀可能與制備物相似，但在某種條件下與制備物帶電性質(zhì)不同。在這樣的情況下，先用分子篩、超速離心沉降或膜過濾方法除去分子量相差較大的雜質(zhì)，然后在一定PH值和離子強(qiáng)度范圍下使制備物變成有利的離子狀態(tài)，便能有效地進(jìn)行色譜分離。當(dāng)然，這兩種步驟的先后秩序反過來應(yīng)用也會得到同樣效果。純化方法順序先后的安排，還考慮到有利于減少工序，提高效率。如在鹽析法后采取吸附法，必然因為鹽離子過多影響吸附效果。中間增加透析脫鹽一步，則使操作大大復(fù)雜化。如倒過來先吸附，后鹽析，吸附洗脫時的含鹽洗脫液即可直接進(jìn)行鹽析，則可達(dá)到操作簡化節(jié)省原料時間的目的。此外，分離體積過大時使用鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀都能達(dá)到濃縮效果，但使用鹽析法成本就低得多。某一具體產(chǎn)品的分離、提取工藝與下列情況有關(guān)：

1）是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物；2）原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度；3）產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異；

4）產(chǎn)品用途和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；5）產(chǎn)品的市場價格；

6）廢液的處理方法等。

（三）對分離純化每一步驟方法的優(yōu)劣進(jìn)行綜合評價

每一個分離純化步驟方法的好壞，除了從分辨本領(lǐng)和重視性二方面考慮外，還注意方法本身的回收率的高低，特別是制備某些含量很少的物質(zhì)時，回收率的高低十分重要。

一些常用的分離純化方法的幾項特性方法

分辨本領(lǐng)

重現(xiàn)性

回收率

色譜吸附＋＋＋＋＋分配＋＋＋＋＋＋離子交換樹脂＋＋＋＋＋＋＋＋分子篩＋＋＋＋＋＋＋

逆流分配＋＋＋＋＋＋電泳

自由溶液＋＋＋＋＋＋＋聚乙烯介質(zhì)＋＋＋＋＋＋

纖維素＋＋＋＋＋＋＋＋

凝膠＋＋＋＋＋＋＋等電聚焦＋＋＋＋＋＋＋＋＋沉降＋膜穿透（透析）和擴(kuò)散＋＋＋＋＋＋＋＋溶解度＋＋＋＋＋

長春花中Strictosidine合成酶的提純

步驟

總蛋白比活性總活力單位產(chǎn)率提純倍數(shù)

（毫克）

nKat/毫克蛋白

（nKat）

%

（Ⅰ）粗抽提液6540.0085.21001（Ⅱ）硫酸銨沉淀4660.0115.1981.3（Ⅲ）DEAE-纖維素柱38.70.103.97512.5（Ⅳ）羥基磷灰石柱590.643.87380（Ⅴ）SephadexG-750.722.82.038350(Ⅵ)等電焦點0.085.90.510737.5第一節(jié)

原材料的選擇和預(yù)處理

一、原料選擇

動物、植物及微生物都是制備生物大分子的材料。根據(jù)實驗?zāi)康淖⒁膺x擇含量高，來源豐富，制備工藝簡單，成本低的原材料。選擇時，應(yīng)注意微生物的生長期；植物的季節(jié)性；動物的生理狀態(tài)。

對于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高的含量。以微生物為材料時有兩種情況；①利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；②利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料與其他材料的不同：

①在植物材料里，常含有大量的纖維素，很堅韌；②細(xì)胞破碎后的提純過程中，酚類物質(zhì)被氧化為暗棕色，它與其他物質(zhì)混在一起很難除去；③由于植物品種和生長狀況不同，其中所含的生物大分子的量變化很大；④植物材料和季節(jié)有關(guān)；⑤各器官、組織所含的成分不大相同。

對動物組織，必須選擇有效成分含量豐富的臟器組織為原材料，同時必須考慮到是否便于提取，使分離精制工藝簡化。動物臟器必須進(jìn)行絞碎、脫脂等預(yù)處理。絞碎的目的是使有效成分能夠很快被提取。固體物料用脂溶性有機(jī)溶劑脫脂，液體料液可以用油脂分離器。動物臟器可以用丙酮處理制成丙酮粉。丙酮粉含水量很低，性質(zhì)穩(wěn)定，可以密封保存。同時，進(jìn)行了脫脂處理，對分離提純十分有利。二、預(yù)處理動物剔除結(jié)締組織、脂肪。植物去殼除脂。微生物分離菌體和發(fā)酵液。所用材料不能立即進(jìn)行實驗時，則應(yīng)冷凍保存。體內(nèi)易被分解的生物大分子，一般宜用新鮮材料。三、原材料的粉碎和固液的分離（一）機(jī)械法主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎。1.勻漿器2.研缽、研磨3.電磨機(jī)、球磨機(jī)、萬能粉碎機(jī)和絞肉機(jī)(1)研磨珠敲打式均質(zhì)器（珠磨式均質(zhì)器，珠磨式勻漿機(jī)），珠子高速敲打用途：動、植物組織（含甲殼類、單細(xì)胞藻類等）及的破碎細(xì)菌、真菌類微生物、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器甚至是小分子化合物的分離提?。恢饕放疲悍▏鳥ertin，美國Biospec，美國MPbio，美國SPEX，瑞士Roche，德國Retsh，德國Qiagen用途：動、植物組織（含甲殼類、單細(xì)胞藻類等）及的破碎細(xì)菌、真菌類微生物、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器甚至是小分子化合物的分離提??；主要品牌：法國Bertin，美國Biospec，美國MPbio，美國SPEX，瑞士Roche，德國Retsh，德國Qiagen(2)研磨式均質(zhì)器（勻漿機(jī)），研磨杵、研磨管高速摩擦用途：動、植物組織及細(xì)菌、真菌等的破碎、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白質(zhì)的分離提取，小型研磨管/杵適合實驗室微量生物樣品，大型研磨管/杵適合工業(yè)類樣品主要品牌：德國Schuett，寧波新芝，德國Retsh，日本Microtec(3)探頭式均質(zhì)器（勻漿機(jī)），定子、轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)形成剪切力

用途：動、植物組織以利于DNA/RNA、蛋白質(zhì)的分離提?。淮笮驮O(shè)備可以用戶工業(yè)樣品的乳劑、霜劑制備主要品牌：美國Biospec，美國Talboys，德國IKA（廣州產(chǎn)），瑞士Kinematica(4)超聲波均質(zhì)器（超聲波破碎），氣穴原理

用途：細(xì)菌、真菌、單細(xì)胞藻類的破碎、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白質(zhì)的分離提取。工業(yè)上用戶樣品的破碎、乳化、混勻等主要品牌：美國Misonix，美國Sonics，美國Branson(中國產(chǎn))(5)刀片式均質(zhì)器（刀片式勻漿機(jī)），刀片高速切割

用途：樣品的進(jìn)行細(xì)碎、勻化、分散、強(qiáng)烈攪拌、溶解有機(jī)物等主要品牌：美國Talboys，美國Waring，德國IKA，瑞士Consul，諸多國產(chǎn)品用途：樣品的進(jìn)行細(xì)碎、勻化、分散、強(qiáng)烈攪拌、溶解有機(jī)物等主要品牌：美國Talboys，美國Waring，德國IKA，瑞士Consul，諸多國產(chǎn)品(6)拍打式均質(zhì)器（拍打式勻漿機(jī)），樣品在無菌袋中被慢速敲打

用途：活細(xì)菌、寄生蟲/卵的提取，及活組織細(xì)胞的分離培養(yǎng)。多用于食品（水果、蔬菜、肉類）的檢驗檢疫，以及土壤、環(huán)境行業(yè)的研究。主要品牌：法國Interscience，英國Seward，天津恒奧(7)高壓均質(zhì)器（高壓勻漿機(jī)），高壓促使細(xì)胞破碎用途：細(xì)菌、真菌等的破碎、裂解。制藥行業(yè)的乳劑、擦劑/霜劑、脂質(zhì)制備等。中試級以上的實驗室，更多的直接用于生產(chǎn)主要品牌：各國品牌種類繁多，不再列舉（二）物理法

主要通過各種物理因素的作用使組織細(xì)胞破碎。1.反復(fù)凍融法：把待破碎樣品在低溫下冰凍，室溫下溶解，反復(fù)操作，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

2.冷熱交替法：操作時，將材料投入沸水中，90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。在細(xì)菌或病毒中提取蛋白和核酸時可使用此法。3.超聲波處理法Ultrasonication：是利用超聲波(10-15kHz)的機(jī)械振動產(chǎn)生空化作用(Cavitation)導(dǎo)致液體局部,瞬間的壓力變化,從而引起液體內(nèi)部發(fā)生流動,旋滑生成與消失時產(chǎn)生巨大的拉力,使液體拉伸,破裂并出現(xiàn)切變力而促進(jìn)細(xì)胞破裂.此法多用于微生物材料。處理效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。應(yīng)注意溶液中氣泡的存在，一些對超聲波敏感的核酸及酶宜慎重使用。用超聲波破碎細(xì)胞時,其蛋白質(zhì)含量應(yīng)低于30mg/ml.連續(xù)超聲時間長,則樣品溫度升高.因此,通常超聲30秒至1分即停止,待樣品溫度下降后，再次超聲.每次超聲時間,間隔時間及總的超聲次數(shù)取決于:保持樣品低溫的前提下,盡可能徹底地將細(xì)胞粉碎(首次超聲破碎細(xì)胞,一定要在顯微鏡下觀察,確定超聲波條件).探頭的選擇,取決于處理樣品的量及容器大小.處理微生物細(xì)胞時，,其濃度可取50-100mg(菌體)/mL.4.加壓破碎法：一般加氣壓或水壓使每平方英寸達(dá)20.59-34.32Mpa(210-350Kg/cm2)千磅壓力。此法多用于工業(yè)上微生物酶制劑的制備。(三）酶解法及化學(xué)法

1.自溶法Autolysis:

將已破碎的新鮮生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來的方法。動物材料常在0℃-4℃，微生物材料常在25℃室溫條件下進(jìn)行，并加入少量防腐劑。2.酶解法：Enzymaticlysis用外源溶菌酶或細(xì)胞壁分解酶（如：蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶等）在一定條件下作用于細(xì)胞而使細(xì)胞壁破碎。3.表面活性劑處理法：表面活性劑分子中兼有親脂性基團(tuán)和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。在適當(dāng)?shù)臏囟?，pH及低離子強(qiáng)度下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。此法對膜結(jié)合的酶的提?。ㄈ纾号c呼吸鏈有關(guān)的一些酶及乙酰膽堿脂酶）是相當(dāng)有效的，但對其他蛋白質(zhì)則易使其變性，甚至切斷肽鏈。較常用的SDS十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶，去氧膽酸鈉等，對細(xì)胞膜有一定破壞作用。

（四）細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分為材料；或為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后，常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離。

細(xì)胞器的分離，一般采用差速離心，即在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中，利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。介質(zhì)的選擇十分重要，早期常用生理鹽水，易發(fā)生聚集作用，結(jié)成塊狀沉淀，分離效果不理想?，F(xiàn)在常用蔗糖、Ficoll或葡聚糖一聚乙二醇。鼠肝臟組織

↓0.25M蔗糖磷酸緩沖液肝勻漿（10%W/V）

1，000g，10/（γ平均8厘米）

沉淀

上清液

①0.25M蔗糖洗三次

②1，000g，10/（γ平均8厘米）

上清液沉淀3，300g,10/（γ平均8厘米）

（細(xì)胞核）

沉淀上清液

①0.25M蔗糖洗三次

②3，000g，10/（γ平均8厘米）

上清液沉淀（溶酶體）

100，000g,30/（γ平均6厘米）

沉淀上清液（微粒體）

各種細(xì)胞器的純度鑒定采用形態(tài)觀察法（電子顯微鏡）、免疫學(xué)法，標(biāo)志酶活力測定法等。

肝細(xì)胞核——DNA合成酶。細(xì)胞質(zhì)膜——5’—核苷酸酶，堿性對硝基苯磷酸酶，

Na+K+—ATP酶。微粒體——葡萄糖—6—磷酸酶、細(xì)胞色素C還原酶、NADPH。線粒體——琥珀酸脫氫酶，琥珀酸—細(xì)胞色素C還原酶。溶酶體——酸性磷酸酶第二節(jié)提取Extraction

提取：也稱抽提、萃取，其含義基本相同，就是利用一種溶劑對物質(zhì)的不同溶解度從混合物中分離出一種或幾種組分的過程。一般地說，提取在分離純化的前期進(jìn)行，將經(jīng)過處理或破碎的細(xì)胞置一定條件下的溶劑中讓被提取的生物大分子以溶解狀態(tài)釋放出來。。提取方法分兩類：一類為固體的處理，也稱液-固萃取一類為液體的處理，也稱液-液萃取

一、提取條件的選擇

1.溶劑常用水、稀鹽、稀堿和稀酸溶液，有的用不同比例的有機(jī)溶劑，如乙醇、丁醇、丙酮、氯仿、四氯化碳等，常用丁醇，因為其親酯性強(qiáng)兼親水性，提取效果較好。（1）可取代與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂質(zhì)位置，（2）阻止脂質(zhì)重新與蛋白質(zhì)分子結(jié)合（3）使蛋白質(zhì)在水中的溶解能力加強(qiáng)丁醇提取法要求的pH、溫度范圍較廣：pH:3-6,溫度：-2℃-40℃，適用于動植物和微生物原料。

2.pHpH選擇很重要，與溶解度、穩(wěn)定性密切相關(guān)。一般在穩(wěn)定范圍內(nèi)選擇偏離等電點兩側(cè)，如細(xì)胞色素C和溶菌酶均為堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取。（1）pH選3-6范圍，對分離離子鍵有利。（2）注意測定pH的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確誤差±0.1。

3.溫度

一般溫度在5℃以下，但對溫度耐受力較高的生物大分子適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離，有利于提取和下步純化，如胃蛋白酶、酵母脫氫酶以及許多肽類激素選擇37℃50℃效果比低溫提取好。

總之，影響提取的因素較多，要根據(jù)經(jīng)驗結(jié)合具體實驗條件，特別是溶劑的性質(zhì)、pH、pI、介電常數(shù)、提取溫度等主要因素靈活地加以運(yùn)用，選擇最佳條件和方法達(dá)到最佳提取效果。二、影響提取的因素

1.被提取物質(zhì)溶解度的大小

一種物質(zhì)在某一種溶劑中其溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般遵守“相似相溶原理”

2.擴(kuò)散作用的影響

由固體溶解于液體擴(kuò)散方程式各種因素的關(guān)系可得到說明，常表示為：

c

G=DFt

xG:已擴(kuò)散的物質(zhì)量D：擴(kuò)散系數(shù)，隨溫度升高而增大，隨溶劑和黏度增加而降低，物質(zhì)的相對分子質(zhì)量越大，擴(kuò)散系數(shù)越?。籉：擴(kuò)散面積；c：兩相界面溶質(zhì)濃度之差，為擴(kuò)散過程的推動力，c越大，擴(kuò)散越快；x:溶質(zhì)擴(kuò)散的距離，x越大，物質(zhì)擴(kuò)散到溶劑中速度越慢。t:擴(kuò)散時間從上式可看出，G與c、t、F成正比，而與x成反比。D則取決于物質(zhì)的種類、溶劑的溫度及粘度，物質(zhì)擴(kuò)散速率隨溫度升高而升高（對生化藥物溫度升高是有限度的）。減少溶劑的粘度，攪拌以保持兩相界面之最大濃度差，提高細(xì)胞破碎程度以增大擴(kuò)散面積，減少擴(kuò)散距離，延長提取時間及采用分次提取等方法，都可以大大提高物質(zhì)擴(kuò)散速度，增加提取效果。3.分配作用的影響

被提取的物質(zhì)，在二個互不相溶的液相中，分配定律起著主要作用。分配定律表示為在恒溫、恒壓和比較稀的濃度下，某一溶質(zhì)在二個不相混合的液相的濃度分配比是個常數(shù)。

c1恒溫恒壓下=K

c2c1:表示分配達(dá)到平衡后溶質(zhì)在上層有機(jī)相中的濃度

c2：表示分配達(dá)到平衡后溶質(zhì)在下層水相中的濃度

K：為分配常數(shù)，不同溶質(zhì)在不同溶劑中有不同的值。K值越大，則在上層有機(jī)相中溶解度越大；反之，K越小，在下層水相中溶解度越大。當(dāng)混合物中各組分K值彼此接近時，只有不斷更新溶劑，多次抽提才能彼此分開。三、超臨界氣體萃取技術(shù)以氣體為萃取劑，當(dāng)氣體處于超臨界溫度和臨界壓力時，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性，如密度接近液體，粘度接近氣體，具有良好的溶劑性質(zhì)。氣體萃取必須具備：1.臨界壓力低；2.臨界溫度接近于室溫；3.化學(xué)穩(wěn)定性好；4.價廉易得。主要有二氧化碳、氮氣、乙烯等，二氧化碳最常用。

本技術(shù)應(yīng)用于酶、不飽和脂肪酸的提取、精制和回收，與減壓干燥法比較，耗能少，且縮短脫溶的時間。1．超臨界流體萃取的簡介

超臨界流體萃取(Supercriticalfluidextraction，簡稱SFE)是用超臨界條件下的流體作為萃取劑，由液體或固體中萃取出所需成分(或有害成分)的一種分離方法。超臨界流體(Supercriticalfluid，簡稱SCF)是指操作溫度超過臨界溫度和壓力超過監(jiān)界壓力狀態(tài)的流體。

在超臨界狀態(tài)下的流體，具有接近于液體的密度和類似于液體的溶解能力，同時還具有類似于氣體的高擴(kuò)散性、低粘度、低表面張力等特性。因此SCF具有良好的溶劑特性，很多固體或液體物質(zhì)都能被其溶解。常用的SCF有二氧化碳、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷和氨等．其中以二氧化碳最為常用。由于SCF在溶解能力、傳遞能力和溶劑回收等方面具有特殊的優(yōu)點．而且所用溶劑多為無毒氣體．避免了常用有機(jī)溶劑的污染問題。

早在100多年前，人們就觀察到臨界流體的特殊溶解性能，但在相當(dāng)長時間內(nèi)局限于實驗室研究及石油化工方面的小型應(yīng)用。直到20世紀(jì)70年代以后才真正進(jìn)入發(fā)展高潮。1978年召開了首屆專題討論會，1979年首臺工業(yè)裝置投入運(yùn)行，標(biāo)志著超臨界萃取技術(shù)開始進(jìn)入工業(yè)應(yīng)用。超臨界萃取之所以受到青睞，是由于它與傳統(tǒng)額液-液萃取或浸取相比，有以下優(yōu)點：①萃取率高；②產(chǎn)品質(zhì)量高；③萃取劑易于回收；④選擇性好。

2．超臨界萃取的基本原理2．1．超臨界流體特性所謂超臨界流體（SCF），是指一類壓強(qiáng)高于臨界壓強(qiáng)Pc,溫度高于臨界溫度Tc，的流體，這種流體既不是液體，也不是氣體，是一類特殊的流體。ρ(Kg·m-3)D(m2·s-1)μ(Pa·S)氣體（0.1Mpa,15～30℃）0.6～2(0.1～0.4)×10-4(0.1～0.3)×10-4液體（0.1Mpa,15～30℃）600～1600(0.02～0.2)×10-8(0.02～0.3)×10-2超臨界流體，P=Pc，T=Tc200～5007×10-8(0.1～0.3)×10-4P=4Pc，T=Tc400～9002×10-8(0.3～0.9)×10-4表1超臨界流體的物性及與普通流體物性的比較表1將超臨界流體的這些物性與氣體、液體的相應(yīng)值作了比較。從表中可以看出：

①超臨界流體的密度接近于液體密度，而比氣體密度高得多。另一方面．超臨界流體是可壓縮的，但其壓縮性比氣體小得多；②超臨界流體的擴(kuò)散系數(shù)與氣體的擴(kuò)散系數(shù)相比要小得多，但比液體的擴(kuò)散系數(shù)又高得多；③超臨界流體的粘度接近于氣體的粘度，而比液體粘度低得多。2.2．超臨界萃取原理超臨界流體萃取分離過程是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的。當(dāng)氣體處于超臨界狀態(tài)時，成為性質(zhì)介于液體和氣體之間的單一相態(tài)，具有和液體相近的密度，粘度雖高于氣體但明顯低于液體，擴(kuò)散系數(shù)為液體的10～100倍；因此對物料有較好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力，能夠?qū)⑽锪现心承┏煞痔崛〕鰜怼?．3．萃取溶劑的選擇并非所有溶劑都適宜用作超臨界萃取，超臨界萃取對溶劑有以下要求:①有較高的溶解能力．且有一定的親水—親油平衡；②能容易地與溶質(zhì)分離，無殘留，不影響溶質(zhì)品質(zhì)；③無毒，化學(xué)上為惰性，且穩(wěn)定；④來源豐富，價格便宜；⑤純度高。在所研究的超臨界物質(zhì)中，只有幾種適用于超臨界萃取的溶劑：二氧化碳、乙烷、乙烯，以及一些含氟的氫化合物，其中最理想的溶劑是二氧化碳，它幾乎滿足上述所有要求，它的臨界壓強(qiáng)為7.38MPa，臨界溫度為31.16℃，目前幾乎所有的超臨界萃取操作均以二氧化碳為溶劑。

其的主要特點是：①易揮發(fā)，易于與溶質(zhì)分離；②粘度小，擴(kuò)散系數(shù)高，有很高的傳質(zhì)速率；③只有分子量低于500的低分于化合物才易溶于二氧化碳；④中、低分子量的鹵化物、醛、酮、酯、醇、醚易溶于二氧化碳；⑤極性有機(jī)物中只有低分子者才溶于二氧化碳；⑥脂肪酸和甘油三酯不易溶于二氧化碳，但單酯化作用可增加溶解度；⑦同系物中溶解度隨分子量的增加而降低；⑧生物堿、類胡蘿卜素、氨基酸、水果酸、氯仿和大多數(shù)無機(jī)鹽不溶于二氧化碳3．超臨界流體萃取的特點

1．萃取和分離合二為一

當(dāng)飽含溶解物的二氧化碳超臨界流體流經(jīng)分離器時，由于壓力下降使得CO2與萃取物迅速成為兩相(氣液分離)而立即分開，不存在物料的相變過程，不需回收溶劑，操作方便；不僅萃取效率高，而且能耗較少，節(jié)約成本。2．壓力和溫度都可以成為調(diào)節(jié)萃取過程的參數(shù)

臨界點附近，溫度壓力的微小變化．都會引起CO2密度顯著變化，從而引起待萃物的溶解度發(fā)生變化?？赏ㄟ^控制溫度或壓力的方法達(dá)到萃取目的。壓力固定，改變溫度可將物質(zhì)分離；反之溫度固定，降低壓力使萃取物分離；因此工藝流程短、耗時少。對環(huán)境無污染，萃取流體可循環(huán)使用，真正實現(xiàn)生產(chǎn)過程綠色化3．萃取溫度低CO2的臨界溫度為31.16℃。臨界壓力為7.38MPa，可以有效地防止熱敏性成分的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸點、低揮發(fā)度、易熱解的物質(zhì)在其沸點溫度以下萃取出來。4．無毒、無污染

臨界CO2流體常態(tài)下是氣體，無毒，與萃取成分分離后，完全沒有溶劑的殘留，有效地避免了傳統(tǒng)提取條件下溶劑毒性的殘留。同時也防止了提取過程對人體的毒害和對環(huán)境的污染。5．超臨界流體的極性可以改變

一定溫度條件下，只要改變壓力或加入適宜的夾帶刑，即可提取不同極性的物質(zhì)，可選擇范圍廣。5．超臨界萃取技術(shù)的應(yīng)用在食品工業(yè)中用于茶葉、咖啡豆脫咖啡因；食品脫脂；酒花有效成分提取；植物色素的萃??；植物及動物油脂的萃取。在醫(yī)藥工業(yè)中用于酶、維生素等的精制；動植物體內(nèi)藥物成分的萃??；醫(yī)藥品原料的濃縮、精制；糖類與蛋白質(zhì)的分離以及脫溶劑脂肪類混合物的分離精制等。在化妝品工業(yè)中用于天然香料的萃??；合成香料的分離精制；化妝品原料的萃取、精制。超臨界萃取流程6．應(yīng)用前景

我國資源豐富，用超臨界萃取有廣泛的應(yīng)用前景。許多都可以用超臨界流體技術(shù)進(jìn)行加工，如：銀杏葉、魚油、卵磷脂、沙棘油、川芎等。大力開展這方面的研究，能獲得很高的經(jīng)濟(jì)效益。超臨界萃取技術(shù)的應(yīng)用，除對環(huán)境污染少、操作簡便、溫度低、省時、提高收率外，還能得到許多種常規(guī)法得不到的成分，這也為我國中藥材化學(xué)成分的提取和分離提供了一種有效方法。相信隨著人們對環(huán)境保護(hù)的日益重視和綠色時代的要求，超臨界流體技術(shù)將促進(jìn)其進(jìn)一步的開發(fā)和利用第三節(jié)分離純化生物大分子的特點是成分復(fù)雜，含有各種同類或異性物質(zhì)，必須進(jìn)行純化，才能獲得精制的純品。主要應(yīng)用的方法有

鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、pI沉淀法、膜分離法、層析法、凝膠過濾法、離子交換法等。一、鹽析法Saltingout利用不同的蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度不同程度的降低來進(jìn)行分離純化。

原理：蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間電荷的極性基團(tuán)的靜電引力造成的，由于水中加入少量鹽，增加了溶液的極性，減弱了蛋白質(zhì)分子間的作用力，促使其溶解度增大，鹽濃度增加到一定程度時，水的活度被降低，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀析出。鹽析機(jī)理示意圖鹽析的機(jī)理①鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降；②鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降；③鹽離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周圍有序排列的水分子的極化，使水活度降低。

SLog━━=—KsI

①

S0S0——蛋白質(zhì)在純水（離子強(qiáng)度I=0）中的溶解度。S——蛋白質(zhì)在溶液的離子強(qiáng)度為I時的溶解度。Ks——鹽析常數(shù)。

1I=━━εmiZi

2

②2mi——溶液中各種離子克分子濃度（物質(zhì)量濃度）

Zi——各種離子的價數(shù)①式中當(dāng)T為一定時，So對于某一蛋白質(zhì)在某一溶液中的溶解度為一常數(shù)，故①式可改寫為LogS=β—Ks×I

③

式②中β=LogSo也為一常數(shù)，β值主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，溶液的pH和溫度。

Ks值主要和鹽的性質(zhì)（包括鹽離子價數(shù)和平均半徑）有關(guān)，也和蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)。一般來說蛋白在某一鹽溶液中Ks越大，鹽析效果越好，根據(jù)③式分離純化蛋白質(zhì)和酶，可以在一定的pH及溫度下改變鹽的I值，稱為“Ks分段鹽析法”，提純前期常應(yīng)用此法。在一定I值時，改變pH及溫度稱為“β分段鹽析法”，常用于提純后期，特別是使某些蛋白質(zhì)結(jié)晶析出時。

S2—S1V=Vo━━━━1—S2

V：所需飽和度硫酸銨溶液體積Vo：原溶液體積S2：所需達(dá)到的飽和度S1：原溶液的飽和度

若蛋白質(zhì)溶液中已有一定飽和度的鹽，為了分段鹽析，需要增高飽和度時，應(yīng)用下列公式計算：

所需達(dá)到飽和度較高，而液體的體積又不能過分增大，可直接加入固體硫酸銨，其加入量可按下式計算：

G（S2—S1）X=━━━━━1—AS2X是將一升飽和度為S1溶液提高到飽和度為S2時所需的硫酸銨的重量，G及A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。

G在0℃為707A0℃為0.2720℃為75620℃為0.29鹽析時注意以下問題1.鹽飽和度的影響由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，鹽析要求的飽和度也不同，只有正確計算飽和度，才能達(dá)到鹽析的目的。2.pH值選擇蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，最易從溶液中析出沉淀，要選擇在蛋白質(zhì)的等電點附近。3.蛋白質(zhì)濃度的影響

在相同的鹽析條件下蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度極限也愈低。4.溫度

一般可在室溫下進(jìn)行，某些蛋白質(zhì)對溫度敏感，如尿激酶最好在低溫下進(jìn)行。5.脫鹽

蛋白質(zhì)、酶用鹽析法沉淀分離后常需脫鹽才能獲得純品，脫鹽常用的方法是透析法。二、有機(jī)溶劑沉淀方法在同一或相鄰蛋白質(zhì)分子中相互作用的力由于水的介電常數(shù)很高（在200C、為79）而降低，同時蛋白質(zhì)分子的極性基因與水分子卻發(fā)生了相互作用，因而有利于蛋白質(zhì)的溶解。乙醇和丙酮沉淀能力強(qiáng)，是最好的常用的有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑沉淀法比鹽析法分辨力強(qiáng)，易干燥，沉淀好過濾，但易引起失活，注意防止溶劑揮發(fā)和火災(zāi)1.控制工藝過程的溫度2.防止溶劑局部濃度過高3.及時處理沉淀物4.pH的選擇5.比鹽析法條件嚴(yán)格

有機(jī)溶劑沉淀原理圖三、等電點沉淀法

利用蛋白質(zhì)在pI時溶解度最低，而各種蛋白具有不同pI的特點進(jìn)行分離的方法。1.單獨使用效果不理想。2.分辨率也差。3.多用于提取后去除雜蛋白。

四、膜分離法膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電滲析、微孔過濾和精密過濾，在醫(yī)藥領(lǐng)域較為常用。

1.超濾法Ultrafiltration

根據(jù)溶質(zhì)分子和懸浮粒子是否通過多孔膜來進(jìn)行篩分，在液壓驅(qū)動下能通過超濾膜的分離粒子的范圍，一般為0.001-0.01um，就是說，使用一種特制的薄膜可對溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇和濾過。也可在一定的壓力下（外源氮氣壓或真空泵壓），使溶劑和小分子濾過超濾膜，而大分子物質(zhì)受阻保留在原液中。流路膜表面普通過濾切向流速透過流速溶液濃度Cb膜表面超濾膜表面濃度Cw不溶有機(jī)物濾布和深層過濾器篩網(wǎng)和濾網(wǎng)微濾超濾納濾反滲透過濾工藝范圍紅細(xì)胞乳膠油乳劑油漆顏料細(xì)菌沙粒人發(fā)蛋白/酶碳粒病毒輻射原子可溶鹽類VOC抯,PCD,Susp.Oil金屬離子膜類型普通污染物的相對尺寸過濾/分離范圍顆粒尺寸10-410-310-210-11.010102103(微米)平均分子量10020020,000500,000

優(yōu)點：1.操作方便條件溫和，與蒸發(fā)凍干等比較，沒有物相的變化，對不穩(wěn)定酶的濃縮尤其適用。2.成本低，回收率高。3.在濃縮的同時還可除去一些低分子量的物質(zhì)。缺點：

1.不能直接得到干粉制劑。

2.對于蛋白質(zhì)溶液一般只能得到10—50%的濃度，應(yīng)用超濾法時關(guān)鍵在于膜的選擇。壓力流道進(jìn)口出口體積超濾實驗室系統(tǒng)壓力進(jìn)口出口體積進(jìn)口，濃縮透出流道

循環(huán)透出制備規(guī)模的超濾系統(tǒng)超濾膜組件透出流進(jìn)料循環(huán)流膜進(jìn)口壓力回流壓力透出壓力進(jìn)料流道(涂膜的或開放式的)透出流道超濾的基本操作沖洗完整性測試緩沖液條件工藝

–濃縮工藝

–透析產(chǎn)品的回收CIP(SIP)水通量測試保存透析緩沖液初始進(jìn)液循環(huán)透出進(jìn)液罐泵膜沖洗2.反滲透

以高分子透過性的薄膜為分離介質(zhì)，在超過溶液滲透壓力的情況下使溶液中的溶劑透過薄膜，用于生產(chǎn)注射用水，氨基酸、激素的濃縮，如美國的Millpore公司專門設(shè)計反滲透裝置。此法與蒸餾、電滲比較具有能量消耗少、體積小等優(yōu)點。3.微孔濾膜法高分子材料制成的薄膜的微孔0.2-10um之間，廣泛應(yīng)用于濾除微粒和微生物、熱敏性藥物的除菌，如胰島素、ConA、ATP、血清蛋白、丙種球蛋白、激素等。4.超精密過濾以聚丙烯醇為主體的中空多孔濾膜，分級性能在超濾膜與微孔濾膜之間，為0.01-0.2um，用于水的精制（脫除鐵質(zhì)、菌和微粒）。五、層析

1.離子交換層析：20世紀(jì)40年代發(fā)展起來的采用不溶性的高分子化合物作為離子交換劑，分離各種生物物質(zhì)。2.凝膠層析：整個過程和過濾相似，又稱凝膠過濾、分子篩過濾，設(shè)備簡單，操作方便，回收率高，應(yīng)用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和酶等分離和提純。3.親和層析:生物活性物質(zhì)都有親和作用如酶與底物、激素與受體、核酸與互補(bǔ)鏈間，它的設(shè)計是利用生物大分子特異親和力而設(shè)計的一種層析技術(shù)，配基是可以可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)。

通過一次性處理，可獲得高純度的活性物質(zhì)可分離材料中極微的物質(zhì)，設(shè)備要求不高，操作簡單，適用范圍廣，特異性強(qiáng)，分離速度快，效果好，條件溫和等優(yōu)點。第四節(jié)濃縮濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑（包括水），變成高濃度溶液的過程，常在提取后和結(jié)晶前進(jìn)行，有時貫穿在整個生化制藥過程。沉淀（包括鹽析和有機(jī)溶劑沉淀）廣義上說也是一種濃縮方法。

一、蒸發(fā)法

蒸發(fā)是溶液表面的溶劑分子獲得的動能超過了溶液內(nèi)溶劑分子間的吸引力，脫離液面逸向空間的過程。

任何溫度下都在蒸發(fā)，蒸發(fā)的快慢首先與溫度有關(guān)。其次，與蒸發(fā)面積有關(guān)，表面積越大，單位時間內(nèi)氣化的分子越多，蒸發(fā)越快。還和液面蒸汽分子密度，即蒸氣壓大小相關(guān)。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓，當(dāng)液面上的溶劑蒸氣分子密度很小，經(jīng)常處于不飽和的低壓狀態(tài)，液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動態(tài)平衡狀態(tài)，溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化，逸出空間，以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此，根據(jù)上述原理，蒸發(fā)濃縮裝置常應(yīng)加熱，擴(kuò)大液體表面積，低壓和加速空氣流動等因素設(shè)計。二、薄膜蒸發(fā)濃縮

直接用蒸氣加熱的薄膜濃縮器液體溫度可達(dá)60—80℃，適于一些耐熱的酶、蛋白質(zhì)和小分子生化產(chǎn)品的制備。對溫度敏感及易受薄膜切力影響而變性的核酸大分子及其他生物大分子則不易使用，某些粘度很大容易結(jié)晶析出的物質(zhì)也不宜使用此法。三、減壓加溫蒸發(fā)濃縮

通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快。此法適用于一些不耐熱的生物大分子及生化制品的濃縮。轉(zhuǎn)動減壓蒸發(fā)器：適用于濃縮少量，不耐熱、粘度較大的物質(zhì)。四、空氣流動蒸發(fā)濃縮空氣流動可以使液體加速蒸發(fā)。將鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流，或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋置于冷室內(nèi)，通過流動的空氣使透過膜外的溶劑不斷蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮的目的。五、冰凍法生物大分子在冰凍時，水分子結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中。操作時，先將待濃縮的溶液冷卻使之成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融解點的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的，蛋白質(zhì)的鹽溶液，純冰結(jié)晶浮在液面，蛋白質(zhì)集中于下層溶液中。第五節(jié)蛋白質(zhì)和酶的結(jié)晶

概念：使溶質(zhì)呈晶態(tài)從溶液中析出的過程。對蛋白質(zhì)來講，結(jié)晶（1）可作為一種純化方法；（2）可作為一個均一性證據(jù)；（3）作為一個穩(wěn)定的保存方法；（4）長成單晶后，可提供做X射線衍射分析。

原理在合適的過飽和狀態(tài)下，溶質(zhì)分子通過擴(kuò)散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運(yùn)動方式，形成晶核，結(jié)晶時，溶質(zhì)分子通過適當(dāng)途徑在恰好成90°角時以相對碰撞作用方式有序而反復(fù)地堆砌到晶核上，于是晶核上長大晶體形成，晶體從溶液中析出。

生物大分子一般都是由許多相同或相似的單體微粒聚合而成的，故不少生物大分子，也具有形成晶體的能力，但不是所有生物大分子都能在溶液中形成晶體，只有大多數(shù)球蛋白、酶容易在溶液中結(jié)晶析出。生物大分子晶體由于WM大，結(jié)構(gòu)形狀比較復(fù)雜，與一般無機(jī)化合物和金屬所形成的晶體比較，有些性質(zhì)上的差別。

二、蛋白質(zhì)和酶結(jié)晶條件大多數(shù)為針狀、棒狀、片狀、八面體或立方體的菱狀結(jié)晶。1.純度：一般來說不應(yīng)低于50%，總的趨勢是制品越純越易結(jié)晶。大多數(shù)生物大分子第一次得到結(jié)晶后仍可以進(jìn)行多次的重結(jié)晶，每次重結(jié)晶純度均有一定提高，直到衡定為止。2.濃度：過飽和程度高，結(jié)晶容易形成，但過飽和濃度很高時，析出的結(jié)晶多數(shù)是微小晶體。欲獲較大晶體時，需經(jīng)適當(dāng)稀釋。通常球蛋白的濃度采用10—50