第五章分子生物學(xué)研究法(上)2

分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)

第五章

扉頁(yè)：當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，否則，你對(duì)事物的觀(guān)察就會(huì)受影響；當(dāng)你翻開(kāi)書(shū)本的時(shí)候，你又必須盡可能展開(kāi)想象的“翅膀”，否則，你就不可能走在別人的前面。RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無(wú)冗余序列，通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)，可較快地分離到相關(guān)基因。5.3RNA基本操作技術(shù)5.3.1總RNA的提取5.3.2mRNA的純化5.3.3cDNA的合成5.3.4cDNA文庫(kù)的構(gòu)建5.3.5基因文庫(kù)的篩選5.3.1總RNA的提取細(xì)胞中的總RNA包括：mRNA1%~5%rRNA80%~85%tRNAsRNA15%~20%Trizol總RNA提取試劑

TIANGENrRNA電泳后的三條特征性條帶28S、18S、5S(特別是28S和18S特征性條帶)是鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。RNA的抽提方法1.實(shí)驗(yàn)室常用方法：異硫氰酸胍－苯酚抽提法Trizol試劑：苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的RNA，并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整。

Trizol提取步驟：首先在液氮中研磨材料，勻漿，加入trizol試劑，再加入氯仿抽提，分離水相，異丙醇沉淀。RNAExtractionbyTRIzol使用BioSpcetrometer分光光度計(jì)進(jìn)行快速檢測(cè)核酸mRNAExtractionfromCellCulturemRNAExtractionfromTissue2.硅膠膜純化柱法將含有目的RNA的細(xì)胞破碎液通過(guò)該柱，RNA吸附在硅膠膜上，然后在低鹽濃度下可從硅膠上直接洗脫RNA。RNA的濃度和純度的判斷：可通過(guò)測(cè)定其OD260和OD280OD260＝1時(shí)，相當(dāng)于濃度為40μg/mL，當(dāng)OD260/OD280＝1.8～2.0時(shí)，說(shuō)明RNA純度較好。5.32.mRNA的純化寡聚（dT）－纖維素柱色譜法：利用mRNA3’端含有PolyA+的特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性地結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過(guò)兩次此柱可得到較高純度的mRNA.PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場(chǎng)吸附通過(guò)寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA。圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖。每個(gè)OligotexKit包括用于結(jié)合polyA+mRNA的Oligotex樹(shù)脂，和用于洗滌、洗脫結(jié)合的mRNA的離心柱。OligotexmRNAKits可從總RNA中純化mRNA，回收polyA+體外轉(zhuǎn)錄子。OligotexDirectmRNAKits可從細(xì)胞和組織中純化mRNA。mRNAExtractionfromTotalRNA5.3.3cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：在體外以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶合成的一段雙鏈DNA。圖5-15cDNA合成過(guò)程示意圖。第一鏈cDNA的合成：以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，由反轉(zhuǎn)錄酶催化，需引物（常用oligodT）。第二鏈cDNA的合成：以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。圖5-16cDNA合成中的分子修飾。cDNA的合成5.3.4cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)：是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中，該群體就稱(chēng)該生物基因組的cDNA文庫(kù)。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的基本程序：①mRNA的提取和純化。②合成cDNA第一鏈。③將mRNA-cDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子。④將雙鏈cDNA重組到噬菌體載體或質(zhì)粒載體上。⑤將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導(dǎo)入到大腸桿菌寄主細(xì)胞中增殖。構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本程序：構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本程序：構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本程序：基因文庫(kù)的建立基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的差別基因組文庫(kù)中包含了所有基因，而cDNA文庫(kù)只包含表達(dá)的基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)控序列，在研究基因結(jié)構(gòu)時(shí)用處不大cDNA文庫(kù)代表了mRNA的來(lái)源，轉(zhuǎn)錄本在豐度上有差別，而基因組文庫(kù)在理論上均等地代表了所有基因序列不同細(xì)胞類(lèi)型制備的cDNA文庫(kù)包含一些共同序列和獨(dú)特序列，可用于分離差別表達(dá)的基因，基因組文庫(kù)中不能基因組文庫(kù)由于含有不表達(dá)序列，比cDNA文庫(kù)大mRNA在不同組織之間存在豐度差異，因此cDNA文庫(kù)在構(gòu)建時(shí)對(duì)于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫(kù)不存在這樣的問(wèn)題5.3.5基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆過(guò)程。核酸雜交法PCR篩選法前提：已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。步驟：（1）將文庫(kù)保存在多孔培養(yǎng)板上

（2）用設(shè)計(jì)好的目的基因探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽(yáng)性孔（3）把陽(yáng)性孔中的克隆稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行PCR篩選。（4）重復(fù)以上程序，直至鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個(gè)克隆為止。免疫篩選法原理：抗原抗體特異性結(jié)合適用于對(duì)表達(dá)文庫(kù)的篩選文庫(kù)鋪于E.coli形成噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜保存原板加入一抗篩選膜上的噬菌斑印記吸收λ噬菌體中表達(dá)的外源蛋白洗去未結(jié)合的抗體加入酶偶聯(lián)的二抗E加底物顯色從保存板中挑出陽(yáng)性噬菌斑5.4SNP的理論與應(yīng)用SNP的定義定義：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。

是第三代遺傳標(biāo)記。5.4.1SNP概述單倍型：是指位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)。SNP分類(lèi)：cSNP同義cSNP非同義cSNPpSNPrSNP5.4.2SNP的檢測(cè)技術(shù)傳統(tǒng)的SNP檢測(cè)方法使用的技術(shù)主要有：限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）；PCR－單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR－SSCP）；毛細(xì)管電泳；變性高效液相色譜（DHPLC）等。目前獲得新的SNP最常見(jiàn)的方法是：通過(guò)DNA測(cè)序法基因分型（genotyping）：是指利用數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的SNP進(jìn)行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究。主要包括：基因芯片技術(shù)、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)焦磷酸測(cè)序法等?；蛐酒夹g(shù)是在固相支持介質(zhì)上進(jìn)行分子雜交和原位熒光檢測(cè)的一種高通量SNP分析方法。通過(guò)激光掃描，可根據(jù)熒光強(qiáng)弱或熒光的種類(lèi)檢測(cè)出被檢序列的堿基類(lèi)別。優(yōu)點(diǎn)：高通量一次可對(duì)多個(gè)SNP進(jìn)行規(guī)模性篩選被檢起始材料少操作步驟簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：芯片設(shè)計(jì)成本高若樣品復(fù)雜，有些SNP不能被檢出Taqman技術(shù)在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同的熒光標(biāo)記探針，分別與兩個(gè)等位基因完全配對(duì)。分子信標(biāo)技術(shù)分子信標(biāo)：是一種呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結(jié)合，莖干區(qū)由5～8個(gè)堿基組成，5’帶有熒光發(fā)生基團(tuán)，3’帶有熒光猝滅基團(tuán)。自由狀態(tài)時(shí)，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，無(wú)熒光；當(dāng)分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時(shí)可檢測(cè)到熒光。Taqman和分子信標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)對(duì)多個(gè)SNP進(jìn)行分析，操作簡(jiǎn)單，可自動(dòng)化；缺點(diǎn)：不能達(dá)到高通量分析，熒光探針費(fèi)用高。焦磷酸測(cè)序法

(Pyrosequencing)四種酶催化的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng):DNA聚合酶、硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)。反應(yīng)底物：APS和熒光素（luciferin）原理：DNA聚合酶在一種dNTP的存在下進(jìn)行引物延伸反應(yīng),而引物的成功延伸將伴隨焦磷酸的釋放,焦磷酸在熒光素酶的存在下能引發(fā)一種化學(xué)發(fā)光反應(yīng),通過(guò)發(fā)光計(jì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來(lái)達(dá)到檢測(cè)的目的?；静襟E1.測(cè)序引物和DNA模板雜交（PCR擴(kuò)增的、單鏈的），與酶和底物孵育。2.四種dNTP（dATPαS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入