探討肺腺癌組織mRNA在信號通路中的調(diào)控作用,腫瘤學(xué)論文

探討肺腺癌組織mRNA在信號通路中的調(diào)控作用,腫瘤學(xué)論文肺腺癌是肺癌當(dāng)中最常見的一種，也是死亡率很高的一種癌癥，通常5年生存率只要15%[1].通過對肺腺癌發(fā)生與進(jìn)展中一些關(guān)鍵信號通路的研究，能夠幫助尋找到高效的分子靶向抗癌藥物。我們利用全基因組表示出譜芯片，挑選肺腺癌與癌旁組織中差異表示出的mRNA,并分析其介入的信號通路變化，討論mRNA在信號通路中的調(diào)控作用。1材料與方式方法1.1標(biāo)本來源所有6例肺腺癌組織標(biāo)本均來源于2018年4月到2018年5月武漢大學(xué)中南醫(yī)院胸心外科手術(shù)切除標(biāo)本，所有病人標(biāo)本均為術(shù)前未行放療或化療，術(shù)后病理確診為肺腺癌的腫瘤組織〔T〕和癌旁正常組織〔N〕的液氮凍存標(biāo)本。所有標(biāo)本采集均經(jīng)過患者家屬簽屬知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。所有標(biāo)本均于腫瘤離體后15min內(nèi)獲取。1.2一般材料TRIzol試劑〔Invitrogen生命科技公司〕，ds-cDNA合成試劑盒〔Invitrogen生命科技公司〕，單色DNA標(biāo)記試劑盒〔美國NimbleGen公司〕，含有19000條mRNA的全基因組表示出譜芯片〔上海康成生物技術(shù)公司〕。1.3實驗方式方法①RNA制備使用TRIzol試劑相位分離并提取組織總RNA.②RNA含量和質(zhì)量控制：使用紫外光吸收測定法，利用NanoDropND-1000測定RNA濃度和純度。使用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完好性。③雙鏈cDNA合成、洗脫及析出：使用Invitrogen試劑盒，根據(jù)講明書將提取的5g總RNA合成為ds-cDNA.參加4g的RNA酶A溶液，輕度振蕩后在37℃下孵育10min,向含有RNA酶A的ds-cDNA中參加163l苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液，渦旋機上渦旋。將上述試劑轉(zhuǎn)移到相位鎖定管中，12000g下離心5min.小心轉(zhuǎn)移上清液至干凈的1.5ml離心管中，即得到無RNA的ds-cDNA.以冷無水乙醇析出沉淀并用NanoDropND-1000定量。④樣品標(biāo)記：將1吸光度單位的Cy3-9熒光素加到1g雙鏈cDNA中，98℃下孵育10min.參加100pmoldNTP和100U克列諾片段并混勻，37℃孵育2h,參加0.1體積EDTA終止反響，異丙醇純化已標(biāo)記的ds-cDNA.⑤雜交和洗滌：取4g已標(biāo)記ds-cDNA參加Nim-bleGen雜交緩沖液，于42℃下在雜交系統(tǒng)中反響16-20h.之后用沖洗緩沖液洗滌。⑥掃描結(jié)果：AxonGenePix4000B掃描雜交后所得芯片，Gene-PixproV6.0讀取原始圖像。所得圖像輸入Nim-bleScansoftware〔version2.5〕進(jìn)行表示出數(shù)據(jù)分析，用分位數(shù)和強多芯片平均法對基因表示出數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。所有mRNA數(shù)據(jù)由AgilentGeneSpringGX軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。對基因表示出數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督分層聚類分析〔UnsupervisedHierarchicalCluste-ring〕，并對基因進(jìn)行信號通路分析。2結(jié)果2.1總RNA、ds-cDNA與標(biāo)記DNA的質(zhì)量與純度通過NanoDropND1000分析，6組樣品中總RNA、ds-cDNA與標(biāo)記DNA的OD260/OD280Ratio值均在1.8-2.0之間，OD260/OD230Ratio值均大于1.8〔表1〕。瓊脂糖凝膠電泳示總RNA的28S、18S條帶清楚明晰，且28S條帶亮度在18S條帶的兩倍以上，5S條帶模糊。該結(jié)果顯示所得RNA質(zhì)量和純度可知足實驗要求，用于下步實驗。2.2mRNA非監(jiān)督分層聚類分析圖1顯示，根據(jù)mRNA的表示出情況，6例標(biāo)本被分為兩大類，與肺癌組織和癌旁組織的分類相符，講明差異表示出的mR-NA具有腫瘤組織特異性，即有大量的mRNA在腫瘤中發(fā)生了高表示出或低表示出。2.3mRNA在腫瘤組織中的差異表示出情況==在mRNA火山圖〔圖2〕中，以T-test顯著檢驗P值的負(fù)對數(shù)-log10〔P-Value〕為縱坐標(biāo)，以log2〔倍數(shù)變化〕為橫坐標(biāo)。則圖中紅點表示在統(tǒng)計學(xué)上為差異表示出2倍以上且P0.05的mRNA.檢測后發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)生顯著差異表示出〔大于2倍變化且P0.05〕的mRNA共832條，華而不實T相對N高表達(dá)的mRNA407條?；蛐蛱枮镹M-006926的mRNA在腫瘤中的表示出量為正常組織中的58.69倍〔P=0.026〕，序列號為NM-000900的mRNA在腫瘤組織中的表示出量為正常組織中的43.69倍〔P=0.026〕，序列號為NM-138455的mR-NA在腫瘤組織中的表示出量為正常組織中的28.75倍〔P=0.038〕。表2列舉了相對高表示出的407條mRNA中的20條的情況。T相對N低表示出的mR-NA有425條。其中基因序號為NM-057182的mRNA在癌旁組織中的表示出量為腫瘤組織中的17.49倍〔P=0.023〕，序號為NM-002639的mRNA在癌旁組織中的表示出量為腫瘤組織中的15.85倍〔P=0.049〕，序號為NM-153246的mRNA在癌旁組織中的表達(dá)量為腫瘤組織中的10.52倍〔P=0.023〕，序號為NM-214462的mRNA在癌旁組織中的表示出量為腫瘤組織中的10.33倍〔P=0.0231表3列舉了相對低表示出的425條mRNA中的20條的表示出情況。2.4信號通路分析==信號通路分析有助于研究者尋找在腫瘤中發(fā)生顯著變化的信號通路，并進(jìn)一步探尋求索華而不實被調(diào)節(jié)的基因和蛋白。分析軟件將所檢測到有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表示出mRNA與信號通路庫〔KEGG〕比照掃描，富集度分析發(fā)現(xiàn)有9種信號通路中的基因或蛋白發(fā)生了上調(diào)或下調(diào)表示出〔圖3〕〔P0.05〕。我們選擇以為與NSCLC相關(guān)的5條信號通路進(jìn)行描繪敘述。2.4.1同源重組信號通路Rad50、Rad54和DNA聚合酶〔pol〕表示出下降。2.4.2人轉(zhuǎn)化生長因子-信號通路凝血酶敏感素1基因〔thrombospondin-1,THBS1〕表示出上調(diào)，smad錨著受體激活蛋白〔Smadanchorforreceptoractivation,SARA〕表示出下降。2.4.3絲裂原活化蛋白激酶〔MAPK〕信號通路FGF、RasGFR、Rap1、FLNA、HSP72、NFAT-4和JunD等表示出上調(diào)；CACN、Cap1m、IKK、MNK1/2、MKP〔MAPKphosphatase,MAPK磷酸酶〕、GLK、JNK、MKP和MSK1/2表示出下降。2.4.4細(xì)胞周期信號通路Cdc14和磷酸絲氨酸/磷酸蘇氨酸結(jié)合蛋白等基因表示出上調(diào)；細(xì)胞周期蛋白E〔CycE〕，細(xì)胞周期蛋白依靠激酶1〔CDK1〕，起始辨別復(fù)合體〔originrecognitioncomplex,ORC〕、微小染色體維持基因〔mini-chromosomemainte-nance,MCM〕,Chk1,2,BubR1,Cdc25B,C等表示出下降。2.4.5p53信號通路IGF表示出上調(diào)；周期蛋白E和Cdc2、Maspin表示出下降。3討論肺癌是人類最常見的致死性惡性腫瘤。肺癌的發(fā)生有多種蛋白質(zhì)編碼基因和調(diào)控基因的介入，當(dāng)前對肺癌的編碼基因已經(jīng)有了較為深切進(jìn)入的了解，但對肺癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要進(jìn)一步研究[2,3].運用高通量人類基因表示出譜芯片檢測樣品中的基因表示出情況，隨后對其進(jìn)行基因語義分析、信號通路分析等，有助于分析肺癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而尋找到高效抗癌靶向藥物。這也是當(dāng)前常用的一種癌癥研究方式方法。在本次試驗中，我們收集了6例肺腺癌腫瘤標(biāo)本，采用高通量全基因組基因芯片，挑選出差異表示出〔大于2倍變化且P0.05〕的mRNA共832條。華而不實T相對N高表示出的mRNA407條，T相對N低表示出的mRNA有425條。這些差異表示出的mR-NA分子可能通過被激活或抑制，改變了一些腫瘤相關(guān)信號通路的作用，進(jìn)而促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生與發(fā)展。通過分層聚類分析，我們發(fā)現(xiàn)了差異表示出的mRNA分類與肺腺癌和癌旁組織分類相符。這也從另一個角度證明了差異表示出的mRNA與肺腺癌發(fā)生的相關(guān)性。差異基因中有的是控制癌變的驅(qū)動基因，有的是驅(qū)動基因下游基因，挑選并確認(rèn)驅(qū)動基因有待進(jìn)一步工作完成。通過對這些差異表示出的mRNA與信號通路庫〔KEGG〕進(jìn)行比照掃描，我們發(fā)現(xiàn)與肺腺癌發(fā)生經(jīng)過中關(guān)系比擬密切的5條信號通路，并對一些關(guān)鍵性的差異表示出基因在5條信號通路中的作用進(jìn)行初步分析。如在人轉(zhuǎn)化生長因子-信號通路中，凝血酶敏感素1〔Thrombospondin-1,THBS1〕能夠作為TGF-通路的起始刺激物上調(diào)癌細(xì)胞的uPA和PAI1基因表示出，還能與TGF-共同作用于金屬蛋白酶并影響其活性。本研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中THSB1的表示出上調(diào)，提示其可能通過激活了TGF-通路而促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生；在p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期停止進(jìn)程中，細(xì)胞周期蛋白E的表示出是該經(jīng)過正常進(jìn)行的必要條件之一，CycE在細(xì)胞周期中的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞G1期的進(jìn)展，同時還在細(xì)胞凋亡中起正性調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示在NSCLC中，CycE的表示出下降，使p53抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展的作用失敗，引起了腫瘤細(xì)胞的增殖。通過我們的分析工作，一方面為將來尋找肺腺癌的靶向治療提供了捷徑，另一方面也為其他研究癌癥信號通路的工作者提供了豐富的研究素材。另外，我們之前已通過高通量基因芯片，研究了肺腺癌與癌旁組織標(biāo)本中長鏈非編碼RNA〔longnon-codingRNA,lncRNA〕的差異表達(dá)情況[4,5].結(jié)合本次的實驗結(jié)果，我們能夠得到一些新的啟示：lncRNA作為一種調(diào)控基因，能夠通過對mRNA編碼基因的調(diào)控作用，促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生。在本次發(fā)現(xiàn)的與肺腺癌發(fā)生密切相關(guān)的5個信號通路中，一些差異表示出的mRNA分子，無論是在位置和作用功能上，均與上次芯片分析所得的差異表示出lncRNA結(jié)果相偶合。結(jié)合兩次芯片分析結(jié)果，我們產(chǎn)生了一些這樣的假設(shè)：如在同源重組信號通路中，最上游的Rad50被某一lncRNA調(diào)控后表示出遭到抑制，進(jìn)而引起下游Rad54和DNA聚合酶表示出的下調(diào)。另外，可以能存在其他的一些lncRNA分子，通過抑制DNA聚合酶的活性或調(diào)整其構(gòu)象，進(jìn)而導(dǎo)致DNA聚合酶的下調(diào)表示出；在p53信號通路中，Maspin的表示出下降受IncRNA的調(diào)控，之前已有研究發(fā)現(xiàn)了Maspin的受p53依靠和非p53依靠的表觀遺傳學(xué)調(diào)控[6].因而我們以為，在肺腺癌的發(fā)生中，Maspin的抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移作用被抑制可能與lncRNA的表觀遺傳調(diào)節(jié)作用有關(guān)。以下為參考文獻(xiàn)[1]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin,2018,61〔2〕:69-90.[2]BootonR,LindsayMA.EmergingroleofMicroRNAsandlongnoncodingRNAsinrespiratorydisease[J].Chest,2020,146〔1〕:193-204.[3]周雪峰，王樂，張力，等.N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅴ在CD133+人肺腺癌細(xì)胞中的表示出和功能研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2018,32〔5〕:589-592.[4]周雪峰，但攀，朱明林，等.肺腺癌組織與肺癌組織長鏈非編碼RNA表示出譜的挑選[J]1中華實驗外科雜志，2020,29:1489-1490.[5]ZhangLi,ZhouXF,PanGF,etal.Enhancedexpres-sionoflongnon-codingRNAZXF