第四章 DNA復(fù)制損傷與修復(fù)

第四章DNA的復(fù)制、損傷與修復(fù)

DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。

DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。

在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富了中心法則的內(nèi)容。

DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDPAgeneisexpressedintwostepsTranscription:RNAsynthesisTranslation:ProteinsynthesisDNA復(fù)制的基本過程：復(fù)制的起始(initiation)DNA鏈的延伸(elongation)復(fù)制的終止(termination)

第一節(jié)DNA復(fù)制概況

一、DNA復(fù)制的半保留性

DNA在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。

DNA以半保留方式進行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實驗所證明。該實驗首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：

二、復(fù)制起點的結(jié)構(gòu)特征DNA在復(fù)制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點（復(fù)制子）。3個連續(xù)的13bp序列，富含AT反向重復(fù)出現(xiàn)四次9bp序列酵母自主復(fù)制序列在原核生物中，復(fù)制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。

三、RNA引物

參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，通常為1－10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。

四、雙向復(fù)制

DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點為中心，向兩個方向進行復(fù)制。但在低等生物中，也可進行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。

五、DNA的半不連續(xù)復(fù)制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3'→5'。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。以3′→5′方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是連續(xù)進行的，其子代鏈的聚合方向為5′→3′，這一條鏈被稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。而以5′→3′方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5′→3′，這條鏈被稱為滯后鏈(laggingstrand)。由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時，由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。

半不連續(xù)復(fù)制Semi-discontinuousreplication

岡崎片段OkazakifragmentLeadingstrandLaggingstrandReplicationfork前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。TheshortdiscontinuoussegmentsarecalledOkazakiFragments.

?Inbacteriatheyareapproximately1000ntinlength;ineukaryotestheyareapproximately200ntinlength.DNA復(fù)制的一般特征(小結(jié)）（1）以原來的DNA母鏈為模板（template），復(fù)制產(chǎn)生新的子鏈。（2）作為模板的雙鏈DNA分子需要解鏈以暴露隱藏在雙螺旋結(jié)構(gòu)核心的堿基序列，然后才能作為模板。（3）復(fù)制的方式是半保留（semi-conservative）。（4）需要引物,一般是長度為6～15nt的短RNA，少數(shù)為蛋白質(zhì)。（5）復(fù)制的方向總是5′→3′（6）復(fù)制起始于特定的區(qū)域，但終止的位置通常不固定。原核生物和真核生物的DNA復(fù)制起始區(qū)數(shù)目不同，前者只有一個，而后者則有多個（7）一般為雙向復(fù)制（8）半不連續(xù)性（9）具有高度的忠實性

第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶、相關(guān)蛋白及酶學(xué)機制

在細胞中，雙螺旋DNA復(fù)制是DNA聚合酶催化的酶促反應(yīng)過程。但DNA聚合酶只能延長已有的DNA或RNA引物鏈，不能從頭起始DNA鏈的合成；而且在DNA復(fù)制中形成特殊的復(fù)制叉（或生長叉）結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，DNA雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋DNA解旋（unwinding），并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解

旋與重新形成，DNA聚合酶不能完成這一過程；在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段（Okazakifragment）的連接也是DNA聚合酶無法完成的。實際上，在復(fù)制叉處進行復(fù)雜的DNA復(fù)制過程中，需要許多相關(guān)的酶和蛋白因子參與。主要有：①DNA聚合酶；②DNA解旋酶；③使DNA雙股鏈在復(fù)制叉解開的解鏈酶；④在DNA復(fù)制前防止解開的DNA單鏈局部退火的DNA結(jié)合蛋白；⑤合成RNA引物的引發(fā)酶；⑥除去RNA引物的酶；⑦使岡崎片段共價連接的DNA連接酶等重要的酶與蛋白因子。一、DNA聚合酶與脫氧核糖核苷酸的聚合

（一）DNA聚合酶種類和生理功能：在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA聚合酶Ⅳ（polⅣ），DNA聚合酶Ⅴ（polⅤ）前三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是polⅢ和polⅠ。polⅡ最有可能參與DNA的修復(fù)。polⅠ為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩個片段，其中的大片段稱為Klenowfragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

polⅢ由十種亞基組成，其中α亞基具有5′→3′聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而ε亞基具有3′→5′外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它涉及DNA的錯誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)。當DNA受到較嚴重損傷時，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個酶，使修復(fù)缺乏準確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會殺死許多細胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細胞得以存活。

原核生物中的三種DNA聚合酶

在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)15種DNA聚合酶，但最重要的是最早發(fā)現(xiàn)的五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，參與染色體DNA復(fù)制的是polα（延長滯后鏈）和polδ（延長前導(dǎo)鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補缺口有關(guān)，polβ只在其他聚合酶無活性時才發(fā)揮作用。

真核細胞DNApolα、β、γ、δ和ε的比較性質(zhì)DNApolαDNApolβDNApolγDNApolδDNApolε亞細胞定位細胞核細胞核線粒體基質(zhì)細胞核細胞核引發(fā)酶活性有無無無無亞基數(shù)目4143~5≥4內(nèi)在的進行性中等低高低高在PCNA存在時的進行性中等低高高高3′-外切酶活性無無有有有5′-外切酶活性無無無無無生物功能細胞核DNA復(fù)制細胞核DNA修復(fù)線粒體DNA復(fù)制細胞核DNA復(fù)制細胞核DNA復(fù)制和修復(fù)分裂細胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）為聚合酶δ的輔助蛋白，可提高聚合酶δ的進行性（二）DNA復(fù)制的保真性：為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時的保真性主要與下列因素有關(guān)：

1．遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；

2．DNA聚合酶在復(fù)制時對堿基的正確選擇；

3．對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進行校正。

二、DNA解旋酶與DNA超螺旋的松馳

天然DNA的負超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復(fù)制的進行，復(fù)制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復(fù)制中需要DNA解旋酶去除解鏈酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。大腸桿菌中的DNA解旋酶（gyrase）又稱拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ），

由四個亞基組成四聚體α2β2，而真核的呈αβ二聚體。DNA解旋酶的作用機制如圖所示。ActionoftopoisomeraseatthereplicationforkTopoisomeraserapidlyremovethepositivesupercoilsaccumulateinfrontofthereplicationfork.

DNA解旋酶每作用一次產(chǎn)生兩個負超螺旋，因此可以消除復(fù)制叉向前移動所產(chǎn)生的正超螺旋，并且復(fù)制完的兩個子代DNA雙鏈的分離也需要DNA解旋酶的催化功能。當加入DNA解旋酶的抑制劑如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixicacid）等時均能抑制細菌DNA的合成。可見DNA解旋酶是DNA復(fù)制所必不可少的。

DNA解旋酶對真核細胞有絲分裂也是非常重要，如果不解開纏繞，在任何細胞周期中姐妹染色體都將無法分離。此外，DNA解旋酶在轉(zhuǎn)錄、同源重組及可移動元件的轉(zhuǎn)座中都起重要作用。三、DNA解鏈酶和單鏈結(jié)合蛋白

復(fù)制過程中，復(fù)制叉在不斷前進，復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復(fù)制能夠順利進行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔上述任務(wù)是DNA解鏈酶（DNAhelicase）和單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA解鏈酶作用模型

（single-strandbindingprotein,SSB）。

DNA解鏈酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱（又稱解螺旋酶）。原核生物大腸桿菌為DnaB和Rep蛋白，DnaB結(jié)合于滯后鏈模板DNAhelicasesseparatethetwostrandsofthedoublehelixDNA雙螺旋的解旋

沿5‘→3’方向前進，Rep蛋白結(jié)合于前導(dǎo)鏈模板沿3‘→5’方向移動（見圖）。真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen,T-ag）具解開雙鏈的功能。此外也在一些真核生物中分離純化出多種DNA解鏈酶，其功能還在鑒定證實中。

圖2-7DNA雙螺旋的解旋BindingofSSBtoDNAinhibitstheformationofintramolecularbasepairsDNA雙螺旋的解旋

單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）在細胞內(nèi)行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能（如同源重組）。在復(fù)制中，這包括穩(wěn)定熔解起點，維持解旋酶活性，從DNA模板上去除二級結(jié)構(gòu)以及抑制核酸酶活性。即SSB與DNA單鏈相結(jié)合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展狀態(tài)，以保證復(fù)制順利進行。在E.coli中SSB為

四聚體，對單鏈DNA有很高的親和性，但對雙鏈DNA和RNA沒有親合力。它們與DNA結(jié)合時有協(xié)同作用，即有一個SSB與DNA結(jié)合時，就會有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴展分布整個DNA單鏈，將DNA包被上蛋白聚合體。SSB有某些堿基組成的傾向性，但很少有順序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，可以周而復(fù)始地循環(huán)使用，在DNA的修復(fù)和重組中都有SSB的參與。單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

四、引發(fā)酶與引物RNA的合成

已經(jīng)證明，DNA的半不連續(xù)復(fù)制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3'端向前延伸。迄今為止，人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA，其長度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同，在大多數(shù)情況下為1～10個核苷酸（表2-3）?；蚪M引物長度主要的引物序列*T7T4φχ174大腸桿菌海膽果蠅多瘤病毒動物1～51～51～5大約101～8 大約9大約10大約9pppApCpC/ApN1～2(N主要為A和C)pppApCpN3pppApN0～4pppAC(N)7～10(p)ppA/GpN7pppA(N)7～9pppA/GpN9末測定表5-3DNA復(fù)制中滯后鏈前體片斷的RNA引物

催化RNA引物（RNAprimer）合成的酶叫引發(fā)酶（primerase）。引發(fā)酶識別DNA單鏈模板特異順序，以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3'-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。

引物與典型的RNA（如mRNA）不同，它們在合成以后并不與模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。E.coli的引發(fā)酶是一條肽鏈，分子量為60000，每個細胞中有50～100個分子，它是由大腸桿菌dnaG基因所編碼的。該酶單獨存在時是相當不活潑的，只有在與有關(guān)蛋白質(zhì)相互結(jié)合成為一個復(fù)合體時才有活性。這種復(fù)合體就稱為引發(fā)體。機體選擇RNA作為引物，其原因可能在于減少致死突變（lethalmutation）。DNA復(fù)制中，從模板拷貝最初的幾個核苷酸時，由于堿基堆集力很弱，其氫鍵結(jié)合能力也很弱，因而堿基對的錯配幾率就大很多，加上這幾個核苷酸還沒有與模板形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶3'→5'校對功能很難發(fā)揮作用。因此為了保證生物DNA復(fù)制的保真度，采用以RNA為引物這種過渡形式，既為DNA聚合酶提供3'-羥基端，又容易被DNA聚合酶Ⅰ識別而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶Ⅰ進行切口平移。切口平移過程中發(fā)生錯誤的幾率極少，因為DNA聚合酶Ⅰ（polI）有3'→5'外切核酸酶活性，具有校對功能。五、DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，而使兩段DNA連接起來。DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。

第三節(jié)DNA復(fù)制的幾種主要方式

DNA復(fù)制通常是從雙螺旋的特定位置——復(fù)制原點（ori）開始，一般是富含A-T的區(qū)段，該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強的呼吸作用（breathing），是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段（frequentlyopeningregion），由此產(chǎn)生的瞬時單鏈與SSB蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，SSB）結(jié)合，對復(fù)制的起始十分重要。

原核生物的復(fù)制原點通常為一個，而真核生物則有多個特定的復(fù)制原點。圖2-17DNA復(fù)制的不同方式

依DNA合成的起始方式，復(fù)制可分為從新起始與共價延伸兩種類型：一、復(fù)制叉式復(fù)制二、環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制

一、復(fù)制叉式復(fù)制

(一)、復(fù)制的起始

DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。

1、預(yù)引發(fā)：（1）．解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。對于雙向復(fù)制而言，形成的兩個復(fù)制叉向相反方向行進，每個復(fù)制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。圖5-12復(fù)制叉

（箭頭表示子鏈總的生長方向）

（2）．引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識別復(fù)制起始點，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。

2、引發(fā)：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

（二）、復(fù)制的延長

1、聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3′→5′方向的親代

DNA鏈為模板，從5′→3′方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長滯后鏈)和δ（延長前導(dǎo)鏈）。

2、引發(fā)體移動：引發(fā)體向前移動，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進行鏈的延長。

（三）、復(fù)制的終止

1、去除引物，填補缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。

2、連接岡崎片段：在DNA連接酶的催化下，形成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。

二、環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制

(1)θ型

(2)滾環(huán)型(rollingcircle)(3)D-環(huán)型(D-loop)大腸桿菌質(zhì)粒DNA雙向復(fù)制的模式與實驗驗證。左：θ形復(fù)制模式圖；右：3H標記質(zhì)粒DNA合成圖。（一）環(huán)狀DNA雙鏈的θ型復(fù)制（二）、滾環(huán)式復(fù)制：環(huán)狀DNA可以通過這種方式產(chǎn)生多單元單鏈DNA雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制起始于某一條DNA鏈上新生DNA鏈延伸，不斷取代母鏈復(fù)制一圈，產(chǎn)生單位長度的線性DNA鏈若復(fù)制繼續(xù)進行，可產(chǎn)生多單元線性DNA鏈單向復(fù)制的特殊方式ФX174的雙鏈DNA復(fù)制型(RF)滾環(huán)式復(fù)制首先在動物線粒體中被發(fā)現(xiàn)。

一條短RNA與一條DNA互補，取代了該區(qū)域原來的互補的DNA鏈，使得兩條鏈的合成高度不對稱，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則為游離的單環(huán)。（三）Dloops單向復(fù)制的特殊方式

雙鏈環(huán)狀DNA中的一條前導(dǎo)鏈已經(jīng)引發(fā)并開始合成，與其模板形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而另一條親本鏈則被前導(dǎo)鏈置換出來成為單鏈狀態(tài)。這種由一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡狀結(jié)構(gòu)，叫做置換嚕噗或D-嚕噗（displacementloop）。只有前導(dǎo)鏈將另一條親本鏈（即滯后鏈的模板）的特別序列置換出來成為單鏈形式，才能產(chǎn)生滯后鏈前體的引發(fā)并合成其互補鏈。線粒體DNA的復(fù)制就是以這種有趣的不對稱方式進行復(fù)制，并由真核DNA聚合酶γ負責。

三、真核生物DNA的復(fù)制特點

(一）、真核生物有多處復(fù)制起始點。（二）、真核生物復(fù)制子相對較小，為40-100千堿基對。在全部完成復(fù)制之前，各個起始點上DNA的復(fù)制不能再開始。DNA復(fù)制只在S期進行。真核生物DNA的復(fù)制子被稱為ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，長約150bp左右，包括數(shù)個復(fù)制起始必需的保守區(qū)。真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始點識別復(fù)合物（originrecognitioncomplex，ORC）參與，ORC結(jié)合于ARS，它是由6種蛋白質(zhì)組成的啟動復(fù)合物。

（三）、真核生物DNA復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/秒，還不到大腸桿菌的1/20。因此，人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個復(fù)制起始位點。（四）、DNA聚合酶真核生物DNA聚合酶有15種以上，在哺乳動物細胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε

。真核生物DNA聚合酶的特性比較性質(zhì)DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞基數(shù)4122-3≥1在細胞內(nèi)分布核內(nèi)核內(nèi)線粒體核內(nèi)核內(nèi)(?)功能DNA引物合成損傷修復(fù)線粒體DNA復(fù)制主要DNA復(fù)制酶DNA復(fù)制(?)3'→5'外切無無有有有5'→3'外切無無無無無

DNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。DNA聚合酶δ主要負責DNA的復(fù)制。DNA聚合酶ε與后隨鏈合成有關(guān)，在DNA合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中起著重要的作用。DNA聚合酶在線粒體DNA的復(fù)制中發(fā)揮作用。

真核生物中還存在、、和等幾種DNA聚合酶，它們承擔著修復(fù)損傷的功能，但這些修復(fù)酶的忠實性都很低。（五）真核生物端粒和端粒酶：端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。

線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應(yīng)。端粒酶是一種參與真核生物染色體末端的端粒DNA復(fù)制的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，其本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進行延長。端粒酶(telomerase)的作用機制

被延長的TG鏈可以作為合成岡崎片段的模板，使端粒形成雙鏈。

端粒酶以自身的RNA作為端粒DNA復(fù)制的模版，合成出富含脫氧單磷酸鳥苷DeoxyguanosineMonophosphate(dGMP)的DNA序列后添加到染色體的末端并與端粒蛋白質(zhì)結(jié)合，從而穩(wěn)定了染色體的結(jié)構(gòu)。細胞發(fā)生癌變后，端粒酶活性比正常時明顯增高，端粒DNA這種漸進性縮短趨勢受到阻礙，使正常細胞轉(zhuǎn)化成具有無限分裂能力的永生化惡性細胞。端粒酶的活性是癌細胞的一種標志，可以作為癌癥治療中的一個靶子。

第四節(jié)DNA損傷與修復(fù)

作為一種能決定生命狀態(tài)存在和延續(xù)的生物大分子，DNA在遺傳過程中必需保持高度的精確性和完整性，而且這種性能是細胞中任何一種分子都無法與之相比的。盡管如此，在DNA復(fù)制過程中，仍難免會存在少量未被校正的差錯。此外，DNA還會受到各種物理和化學(xué)因素的損傷。這些差錯和損傷如果不被修復(fù)，將會

產(chǎn)生嚴重的細胞學(xué)后果，因為DNA分子本身是無法替代的，一個細胞通常只有1-2套基因組DNA，而不像蛋白質(zhì)和RNA分子那樣，能利用DNA中的遺傳信息不斷產(chǎn)生新的分子來替代受損傷的分子。所以，維護DNA遺傳信息的穩(wěn)定性對生物細胞來說是極其重要的。在漫長的生命進化過程中，生物體不僅演化出能糾正

復(fù)制錯誤的“校正”系統(tǒng)，而且在細胞中形成了多種多樣的DNA修復(fù)系統(tǒng)，能對各種DNA的損傷進行修復(fù)，恢復(fù)DNA正常的超螺旋結(jié)構(gòu)，以保持每個世代遺傳信息的穩(wěn)定性。極少數(shù)不能修復(fù)的DNA損傷將會導(dǎo)致基因的突變，其中一部分突變將有利于物種的進化，而另一部分突變將導(dǎo)致細胞發(fā)生變異和死亡。一、DNA的損傷由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。（一）引起DNA損傷的因素：

1．自發(fā)因素：

1)．脫嘌呤和脫嘧啶在生理條件下，DNA分子通過自發(fā)水解經(jīng)常發(fā)生脫嘧啶和脫嘌呤反應(yīng)，使嘌呤堿和嘧啶堿從DNA分子的脫氧核糖-磷酸骨架上脫落下來。Lindahl估計，一個哺乳動物細胞在37℃條件下，20小時內(nèi)通過自發(fā)水解可從DNA鏈上脫落約10000個嘌呤堿和500個嘧啶堿。

2）．堿基的脫氨基作用堿基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）都含有環(huán)外氨基，氨基有時會自發(fā)脫落，從而使胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ║），腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤（I）,鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤（X）。例如，胞嘧啶自發(fā)水解脫氨變成尿嘧啶后，如果未被修復(fù)，產(chǎn)生的尿嘧啶會在接下來的復(fù)制中與腺嘌呤配對，從而產(chǎn)生點突變。

3）．堿基的互變異構(gòu)

DNA中的四個堿基都可能自發(fā)地使氫原子改變位置而產(chǎn)生互變異構(gòu)體，從而使堿基的配對形式發(fā)生改變。如腺嘌呤的稀有互變異構(gòu)體與胞嘧啶配對，胸腺嘧啶的稀有互變異構(gòu)體與鳥嘌呤配對。當DNA復(fù)制時，如果模板鏈上存在著這樣形式的互變異構(gòu)體，在子鏈上就可以產(chǎn)生錯誤，造成DNA損傷。

4）．細胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷

在所有需氧細胞中，細胞呼吸作用產(chǎn)生的副產(chǎn)物超氧陰離子（O2-）和H2O2非?；钴S，由于這些超氧化物、羥基自由基（·OH）等活性氧的存在，導(dǎo)致DNA在正常條件下發(fā)生氧化損傷。

2．物理因素：由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復(fù)制障礙。

3．化學(xué)因素：

(1)脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。

(2)烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。

(3)DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價結(jié)合引起損傷。

(4)堿基類似物：如5-FU，6-MP等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。

(5)斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。

二、DNA損傷的修復(fù)

生物體內(nèi)存在多種修復(fù)途徑：光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)切除修復(fù)系統(tǒng)重組修復(fù)系統(tǒng)錯配修復(fù)系統(tǒng)SOS修復(fù)系統(tǒng)等。

DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)是其損傷修復(fù)的重要基礎(chǔ)，因為DNA的互補雙鏈可保證其一股鏈上的損傷被切除后，能從另一股鏈上獲得修復(fù)所需要的信息。

（一）光復(fù)活修復(fù)（直接修復(fù)）（lightrepairing）：這是一種廣泛存在的修復(fù)作用。光復(fù)活能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。其修復(fù)過程為：光復(fù)活酶（photo-lyase)識別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物→在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開，使之完全修復(fù)→光復(fù)活酶從DNA上解離。

（二）切除修復(fù)(excisionrepairing)：切除修復(fù)（excisionrepair）需要先識別損傷部位，然后切除損傷的堿基或核苷酸，用正常的堿基或核苷酸填補缺口，用連接酶連接切口。1、堿基切除修復(fù)

堿基切除修復(fù)（baseexcisionrepair,BER）是在DNA聚合酶、DNA糖苷酶、內(nèi)切酶和連接酶等參與下完成的。DNA糖苷酶（DNA-glycosylase）可以特異性識別并將不正常的堿基水解切除，形成無堿基的AP位點（APsite），由AP核酸內(nèi)切酶在AP位點附近將DNA鏈切開，然后外切酶切除包括AP位點在內(nèi)的DNA鏈，聚合酶填補單鏈缺口，最后由連接酶將鏈連接。

BER特別適合于修復(fù)較輕的堿基損傷。堿基切除修復(fù)2、核苷酸切除修復(fù)

核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair,NER）主要用來修復(fù)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲并影響到DNA復(fù)制的損傷，如可造成DNA發(fā)生大約30o彎曲的嘧啶二聚體。主要由5步反應(yīng)組成：①由特殊的蛋白質(zhì)探測損傷，并引發(fā)一系列蛋白質(zhì)與損傷部位的有序結(jié)合。②由特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開DNA鏈。③去除2個切口之間的帶有損傷的DNA片段，形成缺口。④由DNApol填補缺口。⑤由DNA連接酶連接切口。（三）．重組修復(fù)(recombinationrepairing)：

其過程分為三個步驟：

1、復(fù)制，損傷的DNA仍然可以復(fù)制，但復(fù)制到損傷部位時，子鏈就出現(xiàn)了缺口。

2、重組，從完整的母鏈將相應(yīng)的片段移到缺口，而母鏈上形成缺口。

3、填補和連接，母鏈上的缺口由DNA聚合酶進行填補合成，最后由DNA連接酶連接。

重組修復(fù)是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯的修復(fù)方式。

修復(fù)過程中，DNA損傷并未除去，但隨著復(fù)制的不斷進行，損傷部位被逐漸稀釋，實際上消除了損傷的影響。（四）、錯配修復(fù)

DNA復(fù)制是一個高保真過程，但其正確性畢竟不是絕對的，復(fù)制產(chǎn)物中仍會存在少數(shù)未被校出的錯配堿基。通過對錯配堿基的修復(fù)將使復(fù)制的精確性提高102-103倍。現(xiàn)已在大腸桿菌、酵母和哺乳動物中都發(fā)現(xiàn)了錯配修復(fù)系統(tǒng)。復(fù)制

錯配中的錯配堿基存在于新合成的子代鏈中，錯配修復(fù)是按模板的遺傳信息來修復(fù)錯配堿基的。因此，該修復(fù)系統(tǒng)必須有一種能在復(fù)制叉通過之后識別模板鏈與新合成DNA鏈的機制，以保證只從新合成的DNA鏈中去除錯配堿基。在大腸桿菌中主要通過對模板鏈的甲基化來區(qū)分新合成的DNA鏈。大腸桿菌中存在一種Dam甲基化酶，它通常首先對DNA模板鏈

的5′-GATC序列中腺嘌呤的N6位置進行甲基化，當復(fù)制完成后，在短暫的時間內(nèi)（幾秒或幾分鐘），只有模板鏈是甲基化的，而新合成的鏈是非甲基化的。正是子代DNA鏈中的這種暫時半甲基化，可以作為一種鏈的識別標志，以區(qū)別模板鏈和新合成的鏈，從而使存在于GATC序列附近的復(fù)制錯配將按親代鏈為模板進行修復(fù)。幾分鐘后新合成鏈也將在Dam

甲基化酶作用下被甲基

化，從而成為全甲基化DNA。一旦兩條鏈都被甲基化，這種錯配修復(fù)過程幾乎不再發(fā)生。由于甲基化DNA成為識別模板鏈和新合成鏈的基礎(chǔ)，且錯配修復(fù)發(fā)生在GATC的鄰近處，故這種修復(fù)也稱為甲基指導(dǎo)的錯配修復(fù)（methyl-directedmismatchrepair）。

（五）．SOS修復(fù)：這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復(fù)制受到抑制時出現(xiàn)的修復(fù)機制，以SOS借喻細胞處于危急狀態(tài)。

DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。

損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。

由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位DNA的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯誤的堿基，從而造成突變。

三、基因突變

突變是在DNA分子堿基序列水平上所發(fā)生的一種永久性、可遺傳的變化，它是與遺傳保守性相對立而又相互統(tǒng)一的自然現(xiàn)象。生物進化始于基因突變（mutation），并通過基因突變的積累和遺傳導(dǎo)致生物種屬的演化。

（一）、基因突變的類型堿基序列發(fā)生改變的基因我們稱之為突變基因（mutantgene）。攜帶突變基因的生物個體或群體或株系通常稱為突變體（mutant）?；驔]有發(fā)生變化而表現(xiàn)正常的生物個體則稱為野生型（wildtype）。突變及其在機體中的后效也可用基因型（genetype）和表現(xiàn)型（phenotype）兩個術(shù)語來表述，前者

用于描述突變及其所處基因；后者用于描述突變在機體中的后果。此外，按照突變生成的過程可將突變分為自發(fā)突變（spontaneousmutation）和誘發(fā)突變（inducedmutation，簡稱誘變）兩種類型。由于自然界中突變劑的作用或由于偶然的復(fù)制錯誤而產(chǎn)生的突變都屬于自發(fā)突變。由于人們使用突變劑處理生物體而產(chǎn)生突變則是誘變。從不同角度

看，基因突變可以分為許多相互聯(lián)系的類別。目前人們最了解和最常見的基因突變主要有以下兩類：1、堿基置換突變指基因中一個或少數(shù)幾個堿基被替代的突變。最簡單的堿基置換突變是點突變，即DNA序列上單個堿基的改變。如前述鐮刀型紅細胞貧血病人的血紅蛋白中，β鏈第6為谷氨酸被纈氨酸取代，其編碼鏈

DNA序列中的谷氨酸密碼子GAG被置換為纈氨酸密碼子GTG，兩者之間僅發(fā)生了一個堿基的改變。點突變?nèi)绻青堰逝c嘌呤之間，嘧啶與嘧啶之間發(fā)生互換，稱之為轉(zhuǎn)換（transversion）；如果是嘌呤與嘧啶之間發(fā)生互換，稱之為顛換（transition）。此外，點突變的表型效應(yīng)是多樣化的，根據(jù)點突變發(fā)生的性質(zhì)和部位的不同，可進一步將其化分為以下幾種類型：

1）、同義突變（cosensemutation）：也稱沉寂或沉默突變（silentmutation）。由于遺傳密碼具有簡并性，即同一氨基酸可由兩種或兩種以上密碼子編碼，而且同義密碼間通常只有第3位堿基不同。如果點突變發(fā)生在第3位堿基位置，那么它就不會影響摻進蛋白質(zhì)中的氨基酸，這也就是在某些情況下，DNA編碼序列中堿基的取代雖然導(dǎo)致了某一

密碼子的改變，但所編碼的氨基酸并未改變的原因。換言之，同義突變不會造成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變化，但可形成基因多態(tài)性。除此之外，如果突變發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)或非調(diào)節(jié)區(qū)，則該突變也將是沉默突變，而且群體中許多沉默及非致死突變的積累會產(chǎn)生遺傳多態(tài)性，即在“正?！?/p>

DNA及其蛋白質(zhì)序列中可接受的變異。

2）、錯義突變（missensemutation）：基因編碼序列中堿基的置換如果發(fā)生在密碼子的第1或第2位堿基上，導(dǎo)致某密碼子改變，并編碼另一種氨基酸，則是錯義突變。錯義突變有可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的變化，也可能僅有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，而對其功能影響甚微。因為大多數(shù)蛋白質(zhì)可以耐受其氨基酸序列中某些非活性必需氨基酸的改變，特別是

當堿基變化導(dǎo)致兩種性質(zhì)相近的氨基酸發(fā)生替換時，如密碼子CTT變?yōu)锳TT，導(dǎo)致亮氨酸殘基被異亮氨酸殘基所取代，往往可使蛋白質(zhì)活性不受影響。但是，如果蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能活性的關(guān)鍵部位發(fā)生了氨基酸的改變，則極有可能產(chǎn)生突變體或造成致死性后果。鐮刀型紅細胞貧血癥就是典型實例。

3）、無義突變（nonsensemutation）：指基因編碼序列中堿基置換使氨基酸密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子的突變。這種突變可導(dǎo)致mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程提前終止，產(chǎn)生比原肽鏈截短并缺失了C末端的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。所以，無義突變常對編碼蛋白質(zhì)的活性有嚴重影響，容易產(chǎn)生突變體表型。

4）、終止密碼子突變（mutationofterminationcodon）：指基因的終止密碼子發(fā)生堿基置換轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N氨基酸密碼子，致使轉(zhuǎn)錄和翻譯過程不能正常終止，結(jié)果形成一種比原肽鏈延長的異常蛋白質(zhì)的突變。

5）、起始密碼子突變（mutationofinitiationcodon）：指基因中起始密碼子被置換，導(dǎo)致不能正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，無表達產(chǎn)物的突變。上述大部分發(fā)生在基因編碼序列中的點突變，可引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，但一般不影響基因的表達，少數(shù)情況下可伴有基因表達水平的降低?；虻姆蔷幋a序列也可發(fā)生堿基置換突變，如啟動子、增強子、內(nèi)含子等區(qū)域內(nèi)的突變，均可影響基因表達及表達調(diào)控。

2、缺失和插入突變（deletionandinsertionmutation）指在DNA編碼區(qū)內(nèi)丟失或增加3或3的倍數(shù)個核苷酸而導(dǎo)致的基因突變。這類突變的效應(yīng)是使基因翻譯至突變處時丟失或增加1個或數(shù)個氨基酸，而突變位點后的氨基酸序列并無改變。但是，如果插入或缺失涉及的核苷酸數(shù)目不等于3的倍數(shù)，將會造成突變點后全部密碼子閱讀框架

移位，進而翻譯產(chǎn)生的氨基酸序列與正常蛋白質(zhì)完全不同，或者使肽鏈合成提前終止或延長，產(chǎn)生無正常功能的異常蛋白質(zhì)，這種基因突變稱為移碼突變。移碼突變的結(jié)果是所翻譯出的蛋白質(zhì)序列從突變點起至C末端都完全被改變了，若此突變發(fā)生在有重要功能的基因中，常可導(dǎo)致生物個體死亡。（三）、突變的意義基因突變的效應(yīng)是多種多樣的。人們一般容易誤認為突變對生命都具有危害作用。其實就其后果而言，突變在生物界普遍存在是有其積極意義的。

1、突變是進化的分子基礎(chǔ)從生物進化史看，進化過程是突變不斷發(fā)生所造成的，突變?yōu)檫M化提供了最根本、最原始的材料，沒有突變就

不可能有現(xiàn)今五彩繽紛的生物世界。遺傳學(xué)家甚至認為，沒有突變就不會有遺傳學(xué)。在進化過程中，DNA序列一定要經(jīng)歷改變，新序列必需加入到生物的基因組中，才可能使生物進化發(fā)展。雖然在一個短暫的歷史時期內(nèi)，人類很難親眼看到某一物種的自然演變過程，而只能看到長期突變積累所造成的結(jié)果。但是通過化石的比較研究，人們發(fā)現(xiàn)不同生物物種的歷史存在狀態(tài)是不同的。有的

物種隨著時間的推移發(fā)生了顯著的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，從一個物種變成了另一個物種；有的原始種群產(chǎn)生了劇烈的形態(tài)結(jié)構(gòu)的歧化，由一個物種演變出兩個以至更多的物種；有的物種在歷史的演進過程中滅絕消失。此外，同一物種個體間存在的差異也表明，突變在自然界普遍存在。大量研究結(jié)果表明，動植物及微生物中很多單位性狀內(nèi)的差別，都來自

該生物進化過程中的基因突變。例如，水稻由非糯性變?yōu)榕葱裕←溣筛叨捵優(yōu)榘挼刃誀疃际腔蛲蛔兊慕Y(jié)果。又如流感病毒就有很多不同遺傳變異型的毒株，不同毒株的感染方式、毒性大小有可能相差很大，因而給流感的預(yù)防帶來相當大的困難。

2、突變可產(chǎn)生遺傳多態(tài)性

多態(tài)性（polymophism）一詞是用來描述個體之間基因型差別現(xiàn)象的。只有基因型改變而沒有可察覺表型改變的突變，是導(dǎo)致DNA多態(tài)性形成的原因。如前所述的簡并密碼子中第三位堿基的改變，以及蛋白質(zhì)非功能區(qū)段上編碼序列的改變等等。由于許多DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶解該DNA片段就會

產(chǎn)生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）。研究表明，RFLP按孟德爾方式遺傳，在某一特定家族中，如果某突變基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標志”進行分析和診斷。例如，法醫(yī)學(xué)上的個體識別和親子鑒定；醫(yī)學(xué)上器官移植的配型及個體對某些疾病的易感性分析，都要用