第二章 紫外-可見分光光度法

第二章紫外-可見分光光度法紫外-可見分光光度法屬于分子吸收光譜法，主要產(chǎn)生于價電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物的定性和定量測定。該方法靈敏度高，選擇性好，儀器設(shè)備價格適中。在分析化學(xué)領(lǐng)域中是一種較受歡迎的方法。在介紹分子吸收光譜法之前，先了解一下電磁輻射的性質(zhì)?！?-1電磁輻射的性質(zhì)電磁輻射包括無線電波、微波、紅外、紫外及X射線和射線等形式。其在真空中的傳播速度等于光速：c=·=31010cm/s由光學(xué)知識可知，電磁輻射具有波微兩重性。

一.波動性光的波動性可用以下的波動性參數(shù)來描述。1.周期T相鄰兩個波峰或波谷通過空間某一固定點所需要的時間間隔稱為周期。單位為s。2.頻率單位時間內(nèi)通過傳播方向上某一點的波峰或波谷的數(shù)目。即單位時間內(nèi)電磁場振動的次數(shù)，稱為頻率，其值等于T的倒數(shù)，單位為Hz。3.波長相鄰兩個波峰或波谷間的直線距離。不同電磁波譜區(qū)可采用不同的單位。用cm、m和nm表示。4.波數(shù)波長的倒數(shù)，即每cm長度內(nèi)含有波長的數(shù)目，單位cm-1。5.傳播速度cc=·單位：cm/s二.微粒性光的微粒性特征為：光由光子組成，而光子具有能量，其能量與波長之間的關(guān)系為：E=h·=hc/h—普朗克常數(shù)6.626×10-34J·s由上式可知，不同波長的光具有不同的能量，波長愈長，光的能量愈低；反之，則愈高?！?-2分子光譜概述如果某分子吸收了光輻射的能量，其外層電子可從較低能級躍遷至較高能級，但由于分子內(nèi)部運(yùn)動的能級變化較復(fù)雜，所以分子吸收光譜相對也較復(fù)雜。在分子內(nèi)部除了電子運(yùn)動外，還存在核間的相對運(yùn)動，即核的振動和分子繞著重心的轉(zhuǎn)動。如圖所示：A、B表示不同能量的電子能級；在每個電子能級中因振動能量不同而分為若干個振動能級；在同一電子能級和同一振動能級中，因轉(zhuǎn)動能量不同而分為若干個轉(zhuǎn)動能級。若用E電、E振、E轉(zhuǎn)分別表示三個能級，則三者的關(guān)系為：E電＞E振＞E轉(zhuǎn)。E電約為1~20ev，E振在0.05~1ev之間，E轉(zhuǎn)一般小于0.05ev，由此可算出相應(yīng)的波長分別為：E電60~1250nm，E振、E轉(zhuǎn)50m~1.25cm。在電子能級發(fā)生變化時，往往不可避免地伴隨著分子的振動和轉(zhuǎn)動能級的變化。因此分子光譜通常比原子光譜復(fù)雜。所以前者的吸收光譜基本位于紫外或可見光區(qū)內(nèi)；后者的吸收光譜則屬于紅外和遠(yuǎn)紅外區(qū)。而分子的總能量E

=E電+E振+E轉(zhuǎn)。由分子光譜可知:?如果用紅外光去激發(fā)分子，則不足以引起電子能級的躍遷，而只能引起分子的振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷；各種物質(zhì)的分子對紅外光的吸收與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此紅外吸收光譜可應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)的研究。?物質(zhì)對不同波長的光具有不同的吸收能力，物質(zhì)也只能選擇性地吸收那些能量相當(dāng)于該分子內(nèi)部三種能量總合(E電+E振+E轉(zhuǎn))的輻射光。由于每種物質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同，它們的能級千差萬別，如此就決定了它們對不同波長光線的選擇性吸收?！?-3Lamber-Beer定律一.吸光度和透光度當(dāng)一束平行光通過均勻的液體時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被器皿反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia，透射光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir，則I0=Ia+It+Ir。在分析時，一般在儀器中放兩個相同材料和厚度的器皿分別盛裝待測液和參比液，使強(qiáng)度為I0的單色光分別通過兩器皿，然后再測量透射光強(qiáng)度，如此可抵消反射光的影響。什么叫透光度？即透射光的強(qiáng)度(It)與入射光的強(qiáng)度(I0)之比稱為透光度或透射比。用T表示：T=It/I0不難理解，溶液的透光度，它對光的吸收；反之，則吸收。一般用吸光度A來表示物質(zhì)對光的吸收程度。其定義為：A=lg(1/T)=lg(I0/It)

實際應(yīng)用中，T以百分率表示。二.Lamber-Beer定律該定律是光吸收基本定律，也是分光光度分析法的依據(jù)和基礎(chǔ)。Lamber-Beer定律指出，當(dāng)入射光波長一定時，溶液的吸光度A是待測物質(zhì)濃度c和液層厚度b的函數(shù)。Lamber和Beer分別于1760年和1852年研究了吸光度與液層厚度、溶液濃度之間的定量關(guān)系。Lamber定律指出，當(dāng)用一定波長的單色光照射某一固定濃度的溶液時，其吸光度與光透過的液層厚度成正比。數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=k·b式中k為比例常數(shù)，b為液層厚度。Beer定律指出，當(dāng)用一定波長的單色光照射厚度一定的均勻溶液時，其吸光度與溶液的濃度成正比。數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=k·c式中k為比例常數(shù)，c為溶液濃度。當(dāng)溶液濃度(c)和液層厚度(b)均可變時，它們都會影響吸光度(A)的數(shù)值。合并L和B兩式，即得到L-B定律：A=kbc?L-B定律的推導(dǎo)：據(jù)量子化理論，光是由光子組成，其能量E=h。

吸收過程就是光子被吸光質(zhì)點(分子或離子)所俘獲，結(jié)果使吸光質(zhì)點能量增加而處于激發(fā)態(tài)；它們俘獲光子的幾率與其面積有關(guān)。如圖所示，假設(shè)有一束強(qiáng)度為I0的單色平行光，垂直通過一橫面積為s的均勻介質(zhì)。當(dāng)光強(qiáng)度為Ix的單色光通過吸收層(db)后，光強(qiáng)度減弱了dIx，則厚度為db的吸收層對光的吸收率為-dIx/Ix，另一方面，由于db為無限小，所以截面積上所有吸光質(zhì)點所占的面積之和(ds)與橫截面積(s)之比(ds/s)可視為該截面積上光子被吸收的幾率，即：-dIx/Ix=ds/s如果進(jìn)一步在吸收介質(zhì)里含有m種吸光質(zhì)點，且它們之間沒有相互作用，設(shè)ai為第i種吸光質(zhì)點對特定光子的吸收面積，dni為ds中第i種吸光質(zhì)點的數(shù)目，則：代入上式，得到:當(dāng)光束通過厚度為b的吸收層時，對上式兩邊積分，得到：根據(jù)前述的吸光度A=lgI0/It定義，可得到:將式子中截面積s用均勻介質(zhì)的體積V和光程b來表示，即：s=V/b代入上式，

NA為Avogadro常數(shù)；ni/(NA?V)即為第i種質(zhì)點在均勻介質(zhì)中的濃度(ci)；將0.4343NAai合并為常數(shù)k，則：該公式表明：總吸光度等于吸收介質(zhì)內(nèi)各吸光物質(zhì)的吸光度之和。即吸光度具有加和性。這是進(jìn)行多組分光度分析的理論基礎(chǔ)。如果吸收介質(zhì)內(nèi)只有一種吸光物質(zhì)時，公式可簡化為:

A=kbc1.質(zhì)量吸收系數(shù)從L-B定律的表達(dá)式中可知，k值隨c、b所取的單位不同而不同。當(dāng)c以g·L-1為單位，b以cm為單位時，k可用a來表示，稱為質(zhì)量吸光系數(shù)，三.比例常數(shù)的表示形式2.摩爾吸收系數(shù)如果c以moLL-1為單位，b以cm為單位，此時k稱為摩爾吸收系數(shù)，用符號表示。單位：L·moL-1·cm-1。的物理意義是：濃度為1moL·L-1，厚度為1cm的溶液，在一定波長下測得的吸光度大小。此時,A=bc。其單位為Lg-1cm-1。此時，A=abc。四.光譜曲線的表示方法將不同波長的光依次通過被分析的溶液，分別測定不同波長下的吸光度或透光度。以波長為橫坐標(biāo)，吸光度或透光度為縱坐標(biāo)作圖，得到的譜圖稱為該物質(zhì)的吸收曲線或透光曲線。在紫外-可見光譜法中，縱坐標(biāo)的參數(shù)除了用T%、A表示外，還可用、lg。曲線中具有最大吸收值的波長，稱為最大吸收波長，一般用max表示，P.12.圖2-3。

吸收曲線描述了物質(zhì)對不同波長光的吸收能力大小，反映了物質(zhì)分子能級的變化。所以吸收曲線形狀和max的位置以及吸收強(qiáng)度等與分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因此，利用吸收曲線可以對物質(zhì)進(jìn)行定性分析；而在某一波長下測得的吸光度與物質(zhì)濃度的工作曲線(A~C曲線)可對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。為了提高測定的靈敏度，波長往往選擇在max處進(jìn)行。五.光吸收定律發(fā)生偏離的原因1.吸光度A的測量在光度分析中，測量A的工作是先配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液；用容量瓶或比色管來配置，如圖。根據(jù)L-B定律A=bc，b即為比色皿的厚度，如果實驗中使用相同材料和厚度的比色皿，b可視為常數(shù)。以測得的A為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的溶液濃度c為橫坐標(biāo)，將測得的數(shù)據(jù)作圖，所得的曲線稱工作曲線。(或稱標(biāo)準(zhǔn)曲線，理論上應(yīng)為一條直線。)但在實際工作中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)該曲線會不成直線，且不過原點；特別當(dāng)吸光物質(zhì)的濃度比較高時，曲線有明顯地偏離直線現(xiàn)象。關(guān)于曲線不過原點的原因在測定過程中，溶液中除了吸光物質(zhì)吸收入射光以外，含有的其它試劑或離子也可能吸收入射光；另外，在測定過程中，部分光被器皿表面反射而會造成損失?？朔姆椒ㄍǔ⒃囈汉涂瞻滓悍謩e置于相同材料和厚度的比色皿中，此空白液即稱為參比溶液。調(diào)節(jié)儀器，使參比溶液的A=0，然后再測定其它溶液的A值。

一般通常使用純?nèi)軇┳鲄⒈纫?即C0溶液)。使用了參比液后，實際上是以通過參比液的光強(qiáng)度作為測定的入射光強(qiáng)度，如此測得的吸光度能比較真實地反映待測物的濃度。(1)由非單色光引起的偏離2.偏離比耳定律的原因L-B定律適用于單色光。但由于儀器中單色器的色散能力及出口狹縫的寬度等，各種分光光度計得到的入射光實際上都是某一波段的復(fù)合光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同，結(jié)果導(dǎo)致曲線負(fù)偏離。設(shè)一束入射光為含有兩個波長max、的復(fù)合光,兩個波長對應(yīng)的入射光強(qiáng)度分別為I0和I0，透過光強(qiáng)度為It和It,總?cè)肷涔鈴?qiáng)度I0總=I0+I0；總透過光強(qiáng)度It總=It+It；A實=lg(I0+I0)/(It+It)

=lg(It·10bc+It·10bc)/(It+It)=lg10bc[It+It·10(-)bc]/(It+It)=bc+lg[It+It·10(-)bc]/(It+It)=A理+A由于，所以A為負(fù)值；A實A理，產(chǎn)生負(fù)偏。與的差值及濃度C愈大，則負(fù)值A(chǔ)愈大,對光吸收定律的偏離程度就愈嚴(yán)重。實際測得的吸光度為：降低由于單色光不純造成負(fù)偏的方法：?選擇吸收曲線的max作入射光波長。因為吸收曲線峰值頂部曲線較平坦，入射光譜帶內(nèi)各波長的值相近。選擇max，偏離光吸收定律較小。只有當(dāng)干擾物質(zhì)存在并對待測物質(zhì)的max產(chǎn)生吸收時，才選擇沒干擾的其它波長作入射光波長。?選擇高分辨率儀器，使入射光波長范圍盡可能窄。(2)雜散光的影響在光度分析中，雜散光指不包括在入射光帶內(nèi)即不通過吸收池而直接進(jìn)入檢測器的非單色光。其來源有幾方面：a.儀器內(nèi)光學(xué)部件及機(jī)械零件反射和散射的光；b.外界及光源漏進(jìn)檢測器的光；c.光學(xué)系統(tǒng)有缺陷而引起的不均勻散射等；雜散光一般引起負(fù)偏離。(3)溶液本身的原因?溶液折射率變化的影響若溶液濃度的變化能顯著改變?nèi)芤旱恼凵渎剩瑒t可觀察到偏離比爾定律的現(xiàn)象，此時必須對光吸收定律進(jìn)行折射率(n)校正：A=bc·n/(n2+2)2?散射的影響一般在濃度小于0.01moL/L時，n基本上為常數(shù)，其影響可忽略不計，說明Beer定律適用于稀溶液。溶液若為膠體溶液、乳濁液或懸濁液時，在入射光通過溶液時，除一部分被吸光粒子吸收外，還有部分因散射而損失，使透光度減小，A實。所以往往發(fā)生正偏離。?化學(xué)因素引起的偏離吸光物質(zhì)常因離解、締合而形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度，導(dǎo)致了偏離。例如K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：此平衡隨溶液酸度及稀釋程度不同而左右移動，因而Cr2O72-和CrO42-的濃度比不同。因此在某一波長下，測得的吸光度與鉻的總濃度之間的線性關(guān)系被破壞?！?-3比色分析法及儀器一.目視比色法

用眼睛去觀察、比較溶液顏色深淺以確定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。該方法將被測溶液在相同條件下和一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，顏色深淺相同者，則它們的濃度認(rèn)為相同。推導(dǎo)如下：對標(biāo)準(zhǔn)液和試液則分別有：當(dāng)溶液顏色相同時，說明I標(biāo)=I試∵兩溶液為同一種物質(zhì),則：標(biāo)=試設(shè)液層厚度相等,b標(biāo)=b試，∴c標(biāo)=c試操作方法：取一套大小相同的比色管，加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和相應(yīng)的顯色劑及緩沖溶液，然后稀釋至同一刻度，形成顏色由淺至深的標(biāo)準(zhǔn)色階。另取一大小相同的比色管，加入被測液后按配制標(biāo)準(zhǔn)色階的方法處理，在管底下方放置一塊白板沿比色管中心垂直觀察比較顏色。該方法的優(yōu)點：(1)操作簡便，儀器簡單，特別適用于工廠里大批樣品的分析；(2)因所用的平底比色管較長,可測定顏色淡的稀溶液中的微量物質(zhì)；(3)該方法準(zhǔn)確度不高，相對誤差約為5~20%。二.分光光度法1.概述分光光度法原理上不同于目視法，它是比較有色溶液(吸光物質(zhì))對某一波長的吸收情況，而目視法是比較透過光的強(qiáng)度。分光光度法是在光電法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。分光光度法與光電法的基本原理相同，所不同的僅在于兩者獲得單色光的方法不同。前者采用棱鏡或光柵等分光元件，后者采用傳統(tǒng)濾光片，利用棱鏡或光柵獲得的“單色光”純度要比濾光片高許多。分光光度法中所用的儀器稱為分光光度計，它的測量范圍不再局限于可見光區(qū)域內(nèi)，可擴(kuò)展到紫外和紅外光區(qū)域。對測定而言，單色光愈純愈好。其純度一般用半寬度表示，即指透光曲線上，峰高一半時所對應(yīng)的峰寬度。半寬度，說明透過的單色光就愈純。分光光度法的特點：(1)因得到的入射光純度較光電比色法高得多，所以進(jìn)行測量時，偏離比耳定律的情況大為改善，從而也擴(kuò)大了測定的線性范圍。(2)由于測定波長可任意選定，故在一定條件下,利用吸光度的加和性，可同時測定溶液中兩種或兩種以上的組分。(3)由于入射光波長范圍擴(kuò)大，測定不僅局限于可見光區(qū)域，還可用于紫外光區(qū)域，即可測定那些吸收紫外光的無色物質(zhì)。2.分光光度計用于分光光度法分析的儀器稱為分光光度計。根據(jù)其波長范圍可分為可見分光光度計，紫外-可見分光光度計，紅外分光光度計。紫外及可見分光光度計主要應(yīng)用于含量的測定；紅外分光光度計主要應(yīng)用于結(jié)構(gòu)的分析。其原理的框示圖如下：(1)光源可見區(qū)光源常用鎢燈或碘鎢燈，屬于熱光源；其發(fā)射波長約為320~2500nm，除用作可見光源外，還可用作紅外光源。紫外光源多為氣體放電光源。如氫、氘、氙放電燈及汞燈等。其中以氫燈和氘燈應(yīng)用最廣泛。其發(fā)射波長為160~500nm。氘燈發(fā)射強(qiáng)度比同樣的氫燈大3~5倍。一般儀器上都設(shè)置有穩(wěn)壓電源，因為電源電壓的變化會引起光源發(fā)光強(qiáng)度的波動，從而影響測定結(jié)果。(2)單色器將光源發(fā)出的連續(xù)光譜色散為單色光的裝置稱為單色器。單色器是利用光的色散原理制成，所謂的色散即是把復(fù)合光變成各種單色光的過程。單色器由棱鏡或光柵等色散元件及狹縫和透鏡組成。棱鏡由玻璃或石英制成。因為玻璃吸收紫外光，所以玻璃制的棱鏡只能用于可見分光光度計。紫外分光光度計必須使用石英材料的棱鏡。狹縫和透鏡系統(tǒng)的作用是調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度，控制光的方向并獲得所需波長的單色光。光柵是另一種色散元件。當(dāng)復(fù)合光照射到光柵上時，根據(jù)光的衍射和干涉原理，色散為不同波長的單色光。近年來，由于光柵刻制技術(shù)的發(fā)展，使用光柵作為色散元件的分光光度計日益增多。(3)吸收池吸收池是盛裝試液并決定液層的厚度，常用的吸收池(比色皿)材料有石英和玻璃兩種。石英吸收池可用于紫外-可見及近紅外光區(qū)，玻璃的只能用于可見及近紅外光區(qū)。常見的比色皿為長方形，光程有0.5~3cm。同樣厚度的比色皿之間透光度相差應(yīng)小于0.5%。(4)檢測器所謂光度檢測器就是將紫外-可見光的信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置。常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管。它們都是基于光電效應(yīng)的原理而制成。a.硒光電池的工作原理：當(dāng)光線照射到光電池上時，半透明膜金屬及半導(dǎo)體硒都會吸收光子。金屬膜吸收光子后釋放光電子，由于硒的半導(dǎo)體性質(zhì)，使得透明金屬層的光電子密度較大，相對來說，光電池的底板成為正極。當(dāng)照射光強(qiáng)度不大，且光電池外電路電阻小于100Ω時，光電流i=KI。使用光電池需注意幾點：受強(qiáng)光照射或長時間連續(xù)使用，會產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象，即光電流逐漸下降，i與I不成正比。內(nèi)阻小，與一般直流放大器不相匹配；溫度系數(shù)較大，使用時要注意隔熱，防止光線直射。易受潮，受潮后光電流大小會不正常，甚至引起光電池完全失效。受光照后，硒光電池可產(chǎn)生約100~200A電流。該電流不需放大可直接用靈敏電流計測量。b.光電管的工作原理：光電管在紫外-可見分光光度計上應(yīng)用較廣。構(gòu)造：以一彎成半圓柱型的金屬片為陰極，其內(nèi)表面涂有一層光敏物質(zhì)，多采用堿金屬或其氧化物，受光照射時，可放出光電子。陽極通常為鎳環(huán)或鎳片，兩極密封于玻璃或石英內(nèi)，抽真空。兩極間施加約90v的直流電壓。當(dāng)光線照射到陰極內(nèi)表面時，光子轟擊出陰極表面的電子(即光電子)，此電子在電場作用下流向陽極，形成電流，經(jīng)測量該電流的大小與照射到陰極上的光強(qiáng)度成正比。與光電池不同，光電管產(chǎn)生的光電流很小，需經(jīng)放大后才能被測定。根據(jù)陰極光敏材料不同，光譜的靈敏區(qū)可分為藍(lán)敏和紅敏兩種。前者在陰極表面沉積銻和銫(Sb-Cs)，可用于波長210~625nm測定，后者在陰極表面沉積了銀和氧化銫(Ag-Cs2O-Cs)，可用于波長625~1000nm測定。與光電池比較，它的光敏范圍寬，不易疲勞，但靈敏度只有光電池的1/4左右。(5)顯示系統(tǒng)其作用是將檢測器輸出的電信號以吸收光譜的形狀(A或T)顯示。常用的顯示測量儀器有電位計、檢流計、自動記錄儀及數(shù)字顯示裝置。無機(jī)物分析中，很少利用金屬離子本身的顏色進(jìn)行光譜分析。因為其吸光度數(shù)值都比較小。§2-4顯色反應(yīng)及顯色劑一般選用適當(dāng)?shù)脑噭?，與待測離子反應(yīng)生成對某波長有較大吸收的物質(zhì)后再進(jìn)行測定，這種反應(yīng)稱顯色反應(yīng)。所用的試劑稱顯色劑。應(yīng)用最多的顯色反應(yīng)為配合反應(yīng)；此外還有O-R反應(yīng)，取代反應(yīng)等。往往同一種物質(zhì)有數(shù)種顯色反應(yīng)，其原理和靈敏度各不相同。可根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。一.分光光度法對顯色反應(yīng)的要求2.生成物應(yīng)組成恒定，穩(wěn)定性好，顯色條件易于控制，保證測量結(jié)果有良好的重現(xiàn)性。3.對照性好，顯色劑與有色配合物兩者的max差別要在60nm以上。選好顯色劑后，研究顯色反應(yīng)的條件十分重要，下面介紹影響反應(yīng)的主要因素。二.影響顯色反應(yīng)的因素1.顯色劑用量1.生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸光能力，即吸收系數(shù)(一般指)較大。為了保證顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，一般需要加入過量的顯色劑；但對于有些顯色反應(yīng)，R加入過多，會引起某些副反應(yīng)，對測定不利。顯色劑的加入量通常根據(jù)實驗結(jié)果來確定。顯色劑用量對顯色反應(yīng)的影響一般有三種情況：顯色反應(yīng)通常可表示為：M-被測組分，R-顯色劑，MR-生成的有色配合物第一種曲線是比較常見的。隨著顯色劑濃度cR，A。當(dāng)濃度達(dá)到某一數(shù)值時，A值趨于平坦；選擇顯色劑的量可在a、b之間。第二種曲線的平坦部分較窄，即cR，A反而。如：Mo(SCN)32+?Mo(SCN)5?Mo(SCN)6-

淺紅橙紅淺紅用于測定的化合物應(yīng)生成Mo(SCN)5，其，A。SCN-的量加入過多，會生成Mo(SCN)6–而使A?！啾仨毧刂芻R的量。

第三種曲線與前兩種不同，隨著cR，A；沒有較明顯的平坦可選擇。∴cR的量需用某個標(biāo)準(zhǔn)液作對比，通過實驗確定。酸度在顯色反應(yīng)中的影響是多方面的。2.溶液的酸度(1)多數(shù)顯色劑都是有機(jī)弱酸或弱堿，溶液的pH會影響顯色劑的平衡濃度和顏色。一般對其顯色反應(yīng)：M+HR?MR+H+增加酸度(pH)對顯色反應(yīng)不利；另外，有些顯色劑在不同的酸度下有不同的顏色。(2)影響待測金屬離子的存在狀態(tài)。當(dāng)溶液pH,大部分金屬離子容易水解生成氫氧化物，使溶液顏色褪去，破壞了有色配合物的生成。(3)影響生成的配合物的組成。對于某些金屬離子與配位體生成逐級配合的顯色反應(yīng)，酸度不同，配合物的配位數(shù)往往不同。如：磺基水楊酸與Fe3+的顯色反應(yīng)，在不同酸度下，可生成1:1、1:2和1:3三種顏色不同的配合物。

pH值范圍配合物組成顏色

＜4Fe(C7H4O3)+紫紅色(1:1)

4~7Fe(C7H4O3)2-棕橙色(1:2)8~10Fe(C7H4O3)3-黃色(1:3)對于這種情況，應(yīng)嚴(yán)格控制溶液的酸度。放置時間及溫度不僅影響配合物的穩(wěn)定性，也影響顯色反應(yīng)，一般通過條件試驗來確定。3.顯色反應(yīng)的時間、溫度4.溶液和溶劑中共存干擾離子的影響在某些顯色反應(yīng)中，如果加入某種有機(jī)溶劑，常常會發(fā)現(xiàn)降低有色配合物的離解度，提高顯色反應(yīng)靈敏度。而共存離子的影響往往是負(fù)面的。如有的本身有顏色或與顯色劑生成有色配合物，會使A，造成正干擾；如果干擾離子與被測組分或顯色劑生成無色配合物，則會降低被測組分或顯色劑的濃度，影響顯色劑與被測組分的反應(yīng)，造成A，引起負(fù)干擾。消除干擾離子的方法通常有如下幾種：(1)控制溶液酸度；(2)加入掩蔽劑；(3)利用O-R反應(yīng)，改變干擾離子的價態(tài)；(4)利用參比溶液消除顯色劑和某些干擾離子；(5)選取適當(dāng)波長；(6)采用某種分離方法。三.顯色劑1.無機(jī)顯色劑無機(jī)顯色劑在光度分析中應(yīng)用不多，主要原因是因為生成的配合物不夠穩(wěn)定，靈敏度和選擇性較差。目前應(yīng)用較多的有：硫氰酸鹽：可與鐵、鈷、鉬、鎢、鈮及錸等元素形成絡(luò)合物。鉬酸銨：在酸性溶液中，可與磷、硅、砷及鍺等元素的含氧酸陰離子生成二元雜多酸配合物。如：PO43-及SiO32-與鉬酸銨生成黃色的H3PO4·12MOO3及H2SiO3·12MOO3

二元雜多酸。過氧化氫：在酸性溶液中，能與鈦、釩、鈮、鉻、鉬及鎢等元素形成配合物。2.有機(jī)顯色劑大多數(shù)有機(jī)顯色劑能與金屬離子生成穩(wěn)定的配合物(螯合形式)，顯色反應(yīng)的選擇性和靈敏度都較高，應(yīng)用范圍也較無機(jī)顯色劑廣得多。有機(jī)顯色劑種類繁多，常用的有偶氮類，三苯甲烷類，醌亞胺類，含肟(RC=NOH)及含硝基類，安替比林類及鄰菲啰林類。生成的配合物有些可溶于水中，而有些則溶于有機(jī)溶劑中。溶于有機(jī)溶劑的可考慮采用萃取方法來進(jìn)行光度法測定。另外，有機(jī)顯色劑中一般都含有生色團(tuán)和助色團(tuán)。所謂生色團(tuán)即表示有機(jī)顯色劑中含有不飽和基團(tuán)，能吸收大于200nm的光。如：-N=N-，＞C=O,＞C=S，-N=O等。所謂助色團(tuán)表示結(jié)構(gòu)中含有孤對電子的基團(tuán)，與生色團(tuán)的不飽和鍵相互作用，可以影響有機(jī)化合物對光的吸收，往往使顏色加深，吸光度增大。如胺基，羧基等等。3.多元配合物由三種或三種以上的組分形成的配合物。在分光光度法中應(yīng)用較多的是由一種金屬離子與兩種配位體所組成的配合物，即“三元配合物”。主要類型有：(1)三元混配配合物適用于配位數(shù)較高，容易形成未飽和配合物的金屬離子，即如果金屬離子與配合劑配合時，第一配合劑的體積較小，且配位數(shù)未飽和，就容易與第二配合劑配位。(2)離子締合物金屬離子首先與配合劑生成配陰離子或配陽離子，再與帶相反電荷的離子生成離子締合物。與(1)不同的是金屬離子的配位數(shù)已經(jīng)滿足，但電荷沒有飽和。一般離子締合物具有疏水性，主要應(yīng)用于萃取分光光度測定。(3)金屬離子-配合劑-表面活性劑體系M與R反應(yīng)時，如加入某些長鏈的季胺鹽、Op乳化劑等表面活性劑，可形成膠束化合物?！?-5光度測量誤差和測量條件的選擇一.光度測量誤差分光光度法的誤差，除了來源于各種化學(xué)因素外，還包括儀器的精度、測得的透光率和吸光度的讀數(shù)誤差等，這些可由多方面引起測定誤差。而這些膠束化合物的吸收峰有明顯的波長紅移現(xiàn)象。測定時，靈敏度可顯著提高。光度計中，透光率的標(biāo)尺刻度呈均勻分布，而吸光度A=-lgT，∴導(dǎo)致A的標(biāo)尺刻度分布是不均勻的。A=-lgTT=100%，A=0T=10%，A=1.0T=0%，A=∞對于同一臺儀器，讀數(shù)的波動對透光率來說，基本上為一定值，但由于A的標(biāo)尺刻度不是均勻的，所以A的讀數(shù)波動不為定值；根據(jù)標(biāo)尺可知，A，讀數(shù)波動引起的誤差，因此選擇合適的吸光度范圍，可減小測量結(jié)果的誤差。據(jù)L-B定律,A=-lgT=bc微分得到:得到:要使測定結(jié)果(c/c)的相對誤差最小，對上式求導(dǎo)應(yīng)有一極小值。即：得：A=-lgT=0.4343或T=36.8%說明當(dāng)A=0.4343時，得到濃度誤差最小。通過作圖(c/c-T)可進(jìn)一步了解吸光度測量對結(jié)果測量的誤差關(guān)系。當(dāng)透光度為15%~65%(吸光度0.2~0.8)時,濃度測量的相對偏差較小;此即分光光度分析中比較適宜的吸光度測量范圍.二.測量條件的選擇為使測定結(jié)果有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，必須注意選擇適當(dāng)?shù)臏y量條件。主要有以下幾點：1.入射光波長的選擇選擇的原則：一般以被測物質(zhì)的最大吸收波長作為入射光，即所謂的最大吸收原則。在此波長下測定，不僅靈敏度較高，而且測定時偏離L-B定律的程度減小(如前所述)，準(zhǔn)確度較高。

如果共存干擾物質(zhì)在max處也有吸收，應(yīng)選擇待測物有吸收而干擾物無吸收的波長作入射光。即所謂的“吸收最大，干擾最小”的原則。如圖，a表示丁二酮肟鎳的吸收曲線；b表示酒石酸鐵的吸收曲線；用丁二酮肟顯色測定鋼中的鎳，其最大吸收波長在470nm左右；試樣中的鐵用酒石酸鉀掩蔽,在同樣波長下，也有吸收，對測定有干擾。從圖可知，當(dāng)波長大于500nm時，干擾變小，所以測定時，可將入射光波長選在500nm以上。雖然靈敏度有所降低，但可消除干擾。2.控制適當(dāng)?shù)奈舛确秶梢陨嫌懻摰墓舛葴y量誤差中得知，為使測量結(jié)果的誤差盡可能小，一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度在0.2~0.8范圍內(nèi)。從A=bc的公式中可知，控制A值大小可從兩個方面進(jìn)行，一是調(diào)節(jié)b值；二是改變濃度c。3.選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤涸跍y量吸光度A時，利用參比溶液調(diào)節(jié)儀器零點，可消除溶液中其它成份以及吸收池、溶劑對光的反射和吸收所帶來的誤差。如此根據(jù)試樣溶液的性質(zhì)，選擇合適組分的參比溶液是很重要的。(1)溶劑參比若樣品基體、試劑及顯色劑均在測定波長處無吸收，則可用溶劑作參比液(有時用蒸餾水替代)。(2)試樣參比若顯色劑或溶劑無吸收而樣品基體組分有吸收時，則應(yīng)采用不加顯色劑的樣品溶液作為參比液。(3)若顯色劑、試劑及樣品基體均有吸收時，則應(yīng)在樣品溶液中加入適當(dāng)?shù)脑噭?，將被測物掩蔽起來，使之與顯色劑不再起反應(yīng)，然后依次加入顯色劑及其它試劑，以此作參比液。在光度分析實驗中，有時標(biāo)準(zhǔn)曲線不過原點，其重要的原因之一就是參比液選擇不當(dāng)?！?-6定量分析法光度分析法的定量依據(jù)是L-B定律，即在一定波長處，被測物的吸光度與其濃度呈線性關(guān)系。因此通過測定某溶液對一定入射光波長的吸光度，即可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。一.標(biāo)準(zhǔn)曲線法(校準(zhǔn)曲線法或工作曲線法)該方法是應(yīng)用最多的一種方法。具體做法：配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含被測組分的空白溶液為參比液(視具體情況而定)，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。繪制吸光度A–濃度c曲線，此曲線即稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測定未知試液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)出未知試液的濃度。在建立一個方法時，首先要確定符合L-B定律的濃度范圍，即線性范圍。定量測定一般在線性范圍內(nèi)進(jìn)行。

對于常規(guī)性的測定，有時往往采用標(biāo)準(zhǔn)對比法。即在相同條件下，測定試樣溶液和某標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度(AX和AS)，由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度CS可計算出試樣中被測物的濃度Cx。使用該方法須在測定的線性范圍內(nèi)，且Cs和Cx較接近時，才能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。二.差示分光光度法光度分析法具有簡便、快速、靈敏和高選擇性等優(yōu)點。但只適用于測定一定含量的組分。如前所述，當(dāng)待測組分濃度過高或過低，即吸光度值過大或過小時，測量會產(chǎn)生很大的誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。為擴(kuò)大分析的需求，在普通光度法的基礎(chǔ)上，提出了差示分光光度法。該方法擴(kuò)大了待測物的濃度范圍，可獲得較滿意的測定結(jié)果。下面介紹差示法中的一種方法—高吸光度差示法。普通方法之所以不適于測定高濃度的溶液，原因在于：(1)普通法以試劑空白作參比，因待測液濃度較高，C，所以透過的光強(qiáng)度T很小，以至于儀器測量時發(fā)生困難。(2)普通法中由于兩者A值相差較大，使A或T的讀數(shù)落在標(biāo)尺的一端，造成讀數(shù)的相對誤差很大。而差示法是采用一個比被測溶液濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液。使AX和AS之間的差距縮??；AX可落在準(zhǔn)確測量的讀數(shù)范圍之內(nèi)，克服了一般光度法誤差大的不足。其操作方法：當(dāng)入射光通過一個比試樣濃度稍低的參比溶液時，將儀器的透光度調(diào)至100%(參比A=0)，然后測定試樣的吸光度；用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或?qū)Ρ确ù_定試樣濃度。下面討論差示法的原理：普通法：AS=bCS

AX=bCX

兩式相減：AX–AS=b(CX–CS)即：A=bC結(jié)論：濃度為CX和CS的兩溶液吸光度差A(yù)與兩溶液的濃度差C成正比。

若以濃度為CS的標(biāo)準(zhǔn)溶液替代普通法的空白溶液作為參比，調(diào)節(jié)其透光度為100%(A=0)，然后測量待測液的吸光度，得到的是兩溶液(CX和CS)吸光度的差值。此差值與兩溶液的濃度差成正比。

舉例：兩個溶液濃度分別為CS和CX，普通法測得TS和TX分別為10%和5%，兩溶液的T讀數(shù)相差5%。差示法中把濃度為Cs的溶液作參比溶液，調(diào)節(jié)儀器光強(qiáng)度至標(biāo)尺讀數(shù)Ts為100%，即把普通法測定中光強(qiáng)度Ts=10%的標(biāo)準(zhǔn)溶液用作差示法中的參比溶液(Ts=100%)，標(biāo)尺擴(kuò)大10倍。所以待測液的Tx在差示法中相應(yīng)的變?yōu)?%10=50%，此時兩溶液讀數(shù)差：100%50%=50%。可見在普通法和差示法中，兩溶液的透光度比并未改變，但差示法中相當(dāng)于把刻度讀數(shù)放大了10倍。這樣使待測液的TX從普通法的5%(落在測量誤差較大的區(qū)域)通過差示法后變?yōu)?0%(落在測量誤差較小的區(qū)域)。差示法的測量誤差經(jīng)過推導(dǎo)，得到：C=CX-Cs，T為擴(kuò)大標(biāo)尺后的TX值。三.雙波長分光光度法對于吸收光譜有重疊的單組分(顯色劑與待測物的吸收光譜重疊)或多組分試樣(由于性質(zhì)相近與待測物的吸收光譜重疊)、渾濁試樣以及背景吸收較大的試樣，由于存在散射和特征吸收，難以找到一個合適的參比溶液來抵消這種影響，可采用雙波長分光光度法進(jìn)行測量。方法：讓兩束強(qiáng)度相同，波長不同的單色光交替照射于同一吸收液，測量兩者的吸光度差值，可消除上述各種干擾，求得待測組分的含量。設(shè)波長1和2光強(qiáng)度相等且均為I0，通過吸收池后其透光度的強(qiáng)度分別為I1和I2。據(jù)L-B定律：lgI0/I1=A1=1bclgI0/I2=A2=2bc得到吸收液對1和2兩波長光的吸光度差值A(chǔ)：

A=A2-A1=lgI1/I2=(2–1)bc上式表明，被測液在兩個波長1和2處的吸光度之差與溶液中被測物的濃度成正比，可根據(jù)所測得的A求出被測組分的含量。雙波長法與普通法相比,其特點是不用參比溶液,而以試液本身對某一波長1的吸光度(A1)作參比。該方法適用于吸收曲線有部分重疊的混合物的分析。這樣可避免因試樣和參比兩個吸收池之間的差異所引入的誤差；消除背景吸收及光散射所引起的誤差。介紹雙波長法的一種應(yīng)用：等吸收法。如圖：在1和2處,2,4,6-三氯苯酚的吸光度相等；若要測定苯酚，以2為測量波長，1為參比波長，則可消除三氯苯酚對苯酚的干擾?！?,4,6-三氯苯酚在1、2處的A相等，所以：A與cx成正比，與cy無關(guān)，即消除了組分Y的干擾。一.有機(jī)化合物紫外吸收光譜的產(chǎn)生紫外吸收光譜是有機(jī)物分子中價電子的躍遷而產(chǎn)生的。因此，這種吸收光譜決定于分子中價電子的分布和結(jié)合情況?！?-7有機(jī)化合物的紫外吸收光譜有機(jī)化合物分子中有幾種不同性質(zhì)的價電子：形成單鍵的電子稱為鍵電子；形成雙鍵的電子稱為鍵電子；氧、氮、硫、鹵素等含有未成鍵的孤對電子，稱為n電子(或p電子)。按分子軌道理論，兩個鍵合原子的原子軌道結(jié)合形成分子軌道時，會形成一個低能級的成鍵分子軌道和一個高能級的反鍵分子軌道，即每一個或鍵軌道必有一個與之對應(yīng)的*反鍵或*反鍵軌道。n電子是非鍵軌道，所以無對應(yīng)的反鍵軌道。當(dāng)有機(jī)物吸收可見-紫外光時，若吸收的光能恰等于某電子基態(tài)(、或n軌道)與激發(fā)態(tài)(*或*軌道)的能級差，則分子中的價電子就會被激發(fā)到相應(yīng)的反鍵軌道而產(chǎn)生吸收光譜，通常產(chǎn)生的躍遷為*，*，n*，n*。二.躍遷類型n*

實現(xiàn)這類躍遷所需的能量也較高，波長一般位于150~250nm范圍內(nèi)。含溴、碘、硫和氮的化合物n*吸收峰大多在大于200nm的近紫外區(qū)，含氟、氯、氧的化合物，n*吸收峰一般在小于200nm的真空紫外區(qū)。*它需要的能量較高，一般發(fā)生在真空紫外區(qū)。飽和烴中的C–C鍵屬于這類躍遷。如甲烷的max=125nm；乙烷為135nm。4.n*在由雜原子直接構(gòu)成鍵的基團(tuán)中，例如-C=O及-C=N等。雜原子上的n電子躍遷到*軌道，發(fā)生n*躍遷,在四類躍遷中，n*躍遷能量最小，max最長，吸收強(qiáng)度弱()，100。3.*它需要的能量通常情況下低于以上兩種。吸收峰一般位于近紫外區(qū)，在200nm左右，如乙烯的最大吸收波長max=162nm；其特點是值較大，max≥104，屬強(qiáng)吸收帶。由上可知，有機(jī)物價電子可能產(chǎn)生的躍遷主要為以上四種類型；且各種躍遷所需的能量各不相同,躍遷能量的大小順序為：*＞n*≥