轉(zhuǎn)錄組和蛋白組

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究乳酸菌脅迫條件下自身應(yīng)答機制郝彥玲副教授

食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院

2013年9月30日

食品微生物專題

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）：廣義上指某一生理條件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的集合。1、轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)介紹基因組（genome）：指的是細(xì)胞或生物體中所有的DNA，包括所有的基因和基因間隔區(qū)。

轉(zhuǎn)錄組具有時空特異性FromSangertoNextGenerationSequencing2、蛋白組學(xué)技術(shù)的介紹

蛋白質(zhì)組(Proteome)：指由一個基因組或一個細(xì)胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)(2D-Gel)

熒光差異凝膠電泳技術(shù)（2D-DIGE）

iTRAQ技術(shù)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)：是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后在垂直的方向再進行SDS（按照分子大?。?jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。優(yōu)點：雙向電泳技術(shù)具有很好的分辨率和靈敏度，可以同時顯示組織或細(xì)胞內(nèi)各種蛋白，高分辨率確保蛋白質(zhì)最大程度的分離。缺點：重復(fù)性是很不理想。高重復(fù)性有利于凝膠間的對比。

熒光差異凝膠電泳技術(shù)（2D-DIGE）采用專有的熒光染料與多重樣本和圖象分析的方法，在同一塊膠上可同時分離多個由不同熒光標(biāo)記的樣品。

iTRAQ技術(shù)Whenchallengedwithbile,bacteriaareknowntomodifytheircellenvelopepropertiessuchascellmembranefattyacidcomposition,peptidoglycancompositionandmembranecharge.Exposuretobileisaseriouschallengetotheviabilityofprobioticsbecausetheconcentrationofbileacidsinthehumansmallintestinetypicallyvariesbetween0.2and2%Bilestresscanalsocausedeleteriouseffects,includingproteinmisfoldinganddenaturation,DNAdamage,secondarystructureformationinRNA,andintracellularacidification.14and22spotsweresignificantlyoverexpressedatthe0.6g/Land1.2g/Lbilesalts.Only4spotsweresignificantlydown-regulatedatthebothconcentrations.3spotswereonlydetectedonlywhenbilesaltswereaddedtothemedium.Oxbileextractpromotesinductionofgeneralstressresponseproteinsthematurationofnewlysynthesizedproteins,refoldinganddegradationofdenaturedproteinsandDNArepairs,suchasGroELandDnaK（2）Severalenzymesinvolvedincarbohydratecatabolism,includingthekeyenzymeoftheso-calledbifidobacterialshunt,areoverexpressedincellsgrowninthepresenceofbilesalts（4）Regulationbybilesaltsofproteinsinvolvedintranscription,translation,andmetabolismofaminoacidsandnucleotides.（3）生理指標(biāo)的檢測：Endmetabolicproducts（lactate,acetateandformate）andF6PPKweredetected.利用2-Dgel結(jié)合實時定量進行研究，創(chuàng)新點是推測出丙酮酸的代謝流向飽和脂肪酸，從而增強了膜的rigidityandimpermeability.轉(zhuǎn)錄組：基因芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組：2D-DIGE技術(shù)在0.2%的oxgal中培養(yǎng)，316基因，42個蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化。2011：

ResultsandDiscussion（1）GGAltercellsurfacepropertiesandexpressionmultipleABC-typemultidrugtransporterinresponsetobile.（2）Two-componentregulatorysystemsandbilesalthydrolasemodulatecellularresponsetobile（3）BileinducescommonstressresponseinGG.

（4）Bileaffectscentralmetabolicprocesses典型文章實驗手段：DNA芯片和實時定量PCR。推測結(jié)果：通過轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)Genesencodingthreetransportsystemsbelongingtothemajorfacilitatorsuperfamily(MFS),Bbr_0838,Bbr_0832,andBbr_1756,andthreeABC-typetransporters,Bbr_0406-0407,Bbr_1804-1805,andBbr_1826-1827在膽鹽脅迫下表達水平發(fā)生顯著變化，推測可能參與膽鹽脅迫。創(chuàng)新點：利用膽鹽缺陷型的L.lactisNZ9000lmrCD作為宿主，通過異源表達證明其參與膽鹽抗性。問題：酸奶對人體具有重要的益生保健功能，但是后酸化是制約酸奶行業(yè)發(fā)展的主要問題。原因：當(dāng)pH值從6.5下降到5.5時，嗜熱鏈球菌的生長逐漸減慢，pH值下降到5.0后，保加利亞乳桿菌控制了酸奶的發(fā)酵（郭清泉等，2001）。

立題的背景

后酸化：酸奶在正常發(fā)酵結(jié)束后的貯存、運輸和銷售過程中，發(fā)酵微生物的繼續(xù)生長會導(dǎo)致產(chǎn)品pH值持續(xù)降低，進而發(fā)生后酸化現(xiàn)象（徐成勇等，2006）

乳酸菌酸耐受機制的研究進展質(zhì)子泵F0F1-ATPase

（Arikadoetal.,1999）谷氨酸脫羧酶途徑GAD

（Sandersetal.,1998）精氨酸脫氨酶途徑ADI

（Curranetal.,1995;DeAngelisetal.,2002）應(yīng)激蛋白和分子伴侶蛋白（Hartkeetal.,1996；

Coxetal.,2000）改變細(xì)胞膜的脂肪酸構(gòu)成（CotterandHill,2003）（CotterandHill,2003）保加利亞乳桿菌的酸耐受機制的特殊性對保加利亞乳桿菌全基因組序列的分析表明,僅具有F0F1-ATPase基因簇缺失一些存在于其他乳酸菌中的pH調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，如ADI途徑中的arcA,B,C,T,D,R基因和GAD途徑中的gadC,B基因（vandeGuchteetal.,2006）保加利亞乳桿菌的酸適應(yīng)機制研究情況利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究保加利亞乳桿菌經(jīng)低pH誘導(dǎo)后的全蛋白表達情況如，

Limetal.,2000；

Fernandezetal.,2008；Streitetal.,2008利用反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR的方法，考察保加利亞乳桿菌中酸耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化如，

Penaudetal.,2006中發(fā)現(xiàn)酸處理后銅離子轉(zhuǎn)運蛋白CPX-TypeATPase的Ldb0660和Ldb1239基因大幅上調(diào)對于保加利亞乳桿菌感受環(huán)境壓力并作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)這一過程的分子調(diào)控機制缺少系統(tǒng)性的研究2.研究目的及意義本課題擬采用蛋白組學(xué)、RT-qPCR、乳酸乳球菌表達系統(tǒng)、細(xì)菌單雜交和EMSA等分子生物學(xué)技術(shù)，對酸脅迫反應(yīng)中的關(guān)鍵基因進行分離鑒定及功能研究。進一步揭示保加利亞乳桿菌酸耐受機制；為制備弱后酸化的保加利亞乳桿菌奠定基礎(chǔ)；為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的酸奶發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。3.研究內(nèi)容134蛋白組學(xué)方法分析保加利亞乳桿菌應(yīng)對酸脅迫過程中的差異表達蛋白細(xì)菌單雜交和EMSA實驗分析抗酸脅迫中新轉(zhuǎn)錄因子Ldb0667的功能2RT-qPCR分析差異基因轉(zhuǎn)錄水平的變化提出保加利亞乳桿菌酸耐受模型4.研究結(jié)果SurvivalofL.bulgaricusCAUH1afteracidadaptation.Acidadapted(40minattheindicatedpH)andcontrol(pH6.5)samplesweresubjectedtoanacidchallenge(60minatpH3.7).OD600

nm=

～0.4pH4.8,40min--700倍確定酸脅迫處理條件：致死處理條件：pH3.7,60min蛋白質(zhì)雙向電泳處理組對照組47pI47pIMW10904020MW10904020平均每塊膠得到644個蛋白點，經(jīng)ImageMaster2DPlatinumsoftware

分析，選取變化幅度大于1.5倍的蛋白點41個進行質(zhì)譜鑒定Results

通過MALDI-TOF/TOF二級質(zhì)譜鑒定了27個差異蛋白（17個上調(diào)，10個下調(diào)），利用NCBIBLAST、KEGG等數(shù)據(jù)庫，確定其功能和參與的代謝途徑糖類代謝:10proteins(GlcK,Eno,Pyk,GpmA,GpmB,Gap,Ack,Gpd,XfpandPgl)核苷酸代謝:3proteins(PyrG,CmkandPurR)翻譯過程:7proteins(Tuf,FusA,TypA,Der,RplM,RpsSandRpsA)氨基酸代謝:2proteins(PepO1andPepN)脅迫反應(yīng):1

proteins(ClpC)未知功能:proteins(RnjA,Ldb0677andPthA)蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR糖酵解途徑K144561.823.14glcKGlucokinase（葡萄糖激酶）YP_618316.1K226643.7229.86Ldb1036Fructose-2,6-bisphosphatase（果糖-2,6-二磷酸酶）YP_619006.1M15596-1.85-14.42gapGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（3-磷酸甘油醛脫氫酶）YP_618713.1M236141.8313.45enoEnolase（烯醇化酶）YP_619161.1L111751.8610.78pykPyruvatekinase（丙酮酸激酶）YP_618880.1K45801.595.10gpmAPhosphoglyceratemutase（磷酸甘油酸變位酶）YP_618404.1L6304-1.61-22.32ackAcetatekinase（乙酸激酶）YP_618754.1戊糖磷酸途徑M12180-1.51-6.68gpdGAPDH（磷酸葡萄糖脫氫酶）YP_619397.1M2110-1.53-24.76Ldb0534phosphoketolase（磷酸酮醇酶）YP_618635.1K103821.704.92Ldb0588putative3-carboxymuconatecyclaseYP_618678蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR伴侶蛋白L47-2.04-13.45clpCATP-bindingsubunitClpCgb|EGD26863.1|核苷酸代謝K375-1.48-20.25pyrGCtpsynthase（CTP合成酶）YP_004033330.1M175431.5123.43Ldb0774Cytidylatekinase（胞苷酸激酶）YP_812822.1L13554-1.62-21.86purRPuroperonrepressor（pur操縱子阻遏蛋白）YP_812402.1肽類降解M2641.6218.90pep01Endopeptidase（肽鏈內(nèi)切酶）YP_618394.1M203271.509.97pepNAminopeptidaseN（氨肽酶N）YP_619704.1轉(zhuǎn)錄-翻譯相關(guān)K247472.7323.75tufPutativeelongationfactorTuYP_618840.1M13561.885.66fusAElongationfactorGYP_618520.1N175131.47fusAElongationfactorGYP_618520.1K9142-1.74-13.55engAGTP-bindingproteinEngAYP_618891.1K113201.542.69typAGTP-bindingproteinTypAYP_618827.1

蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR核糖體蛋白M137941.762.18rplM50SribosomalproteinL13YP_812477.1K19533-1.52-10.93rpsA30Sribosomalprotei