《基因復(fù)習(xí)題》word版

第八章外源DNA片段與載體DNA的重組主要有哪幾種方法？各自的優(yōu)缺點？（1）黏性末端連接法：.1同一限制酶切位點連接：單酶切優(yōu)點：黏性末端連接可抑制載體和目的DNA分子的自連，因而可大大提高連接的效率。更重要是不同限制性酶切位點的黏性末端連接可以控制目的DNA和載體DNA的連接方向。缺點：載體易自身環(huán)化；不易定向克??；產(chǎn)生串聯(lián)重組體；難以插入特定的基因；大片段DAN的重組率低，2.不同一限制酶切位點連接：雙酶切優(yōu)點：①不必將原有的內(nèi)切酶失活，可以直接進行重組連接；②有原有限制性內(nèi)切酶的重組，載體自連就不會發(fā)生，不必用堿性磷酸酶進行處理，從而得到高效連接。缺點：同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別（2）平頭末端連接法：常用①同聚物加尾連接②人工接頭連接等缺點：1效率很低2平頭末端連接常常破壞原有的識別性序列3雙向插入，由于平頭末端沒有粘性末端的堿基互補限制，只要是平頭末端均能連接，造成插入方向良種可性。4造成多拷貝外源DNA片段插入載體可能性。優(yōu)點::1連上后就能用。2能把任何片段連接起來第九章1轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。2重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。3酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA原理：一抗（primaryantibody）:與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）：二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標(biāo)分子的含量。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）步驟：①抗體制備（普通抗體、酶標(biāo)記抗體[一抗、二抗]）②抗體或抗原的包被(固定在固相載體上）③免疫反應(yīng)④特異性表達產(chǎn)物的檢測具體步驟：1）固定樣品：將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。2）一抗結(jié)合：加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。3）二抗結(jié)合：加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。4）顯色反應(yīng)：加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。5）比色：在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮第十章外源基因表達系統(tǒng)：泛指目的基因與表達載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。包涵體蛋白：在一定條件下，外源基因的表達產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。涵體存在部位：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)融合蛋白：將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達的蛋白稱為融合蛋白。①穩(wěn)定性好；②表達效率高；③較易于分離純化寡聚型外源蛋白：為提高外源蛋白表達量，在構(gòu)建外源蛋白表達載體時，將多個外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達的外源蛋白稱為寡聚型外源蛋白.整合型外源蛋白:為防止外源基因隨質(zhì)粒丟失，將要表達的外源基因整合到染色體的非必需編碼區(qū)上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達的外源蛋白即為整合型外源蛋白。分泌型外源蛋白:外源基因的表達產(chǎn)物，通過運輸或分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進入培養(yǎng)基中，即為分泌型外源蛋白.1基因表達在原核生物與真核生物中的差別和特點：1）原核生物表達系統(tǒng)1基因表達是以操縱子的形式進行的。2當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA;3與此同時，mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。2）真核生物基因表達系統(tǒng)1轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進行的，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。2mRNA只能在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化，形成高級結(jié)構(gòu)2原核生物作為基因表達系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點：1原核生物多為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達產(chǎn)物。2基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。3多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達載體。4生理代謝途徑及基因表達調(diào)控機制比較清楚。5不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。6內(nèi)源蛋白酶會降解表達的外源蛋白，造成表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定。]3真核細(xì)胞表達系統(tǒng)表達外源基因的特點：真核生物可識別并切除外源基因的內(nèi)含子，從而表達目的多肽，所以不必向原核細(xì)胞表達體系那樣從mRNA制備cDNA。2真核基因在真核細(xì)胞中表達是，其SD序列與細(xì)胞核糖體RNA16S亞基3‘末端的互補程度較高，對于翻譯水平的調(diào)節(jié)有利3在真核細(xì)胞內(nèi)由外源基因表達的蛋白可被糖基化，成為糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性4外源基因?qū)胝婧思?xì)胞表達效率較低，其在染色體DNA上的整合是隨機的和自發(fā)的，還無法控制整合的位置和適當(dāng)?shù)目截悢?shù)5真核細(xì)胞的培養(yǎng)要求較高，大量生產(chǎn)比較困難，成本較高。2酵母基因表達載體1）自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeastreplicatingplasmid，YRP）該載體含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和基因克隆位點等元件，能夠在酵母細(xì)胞中進行自我復(fù)制。優(yōu)點：在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化效率較高，每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)可達200個。缺點：經(jīng)過多代培養(yǎng)后，子細(xì)胞中的拷貝數(shù)會迅速減少。（2著絲粒型質(zhì)粒載體該型質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型的基礎(chǔ)上，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件。在細(xì)胞分裂時，質(zhì)粒載體能平均分配到子細(xì)胞中，穩(wěn)定性較高，但拷貝數(shù)很低，通常只有1～2個拷貝。（3酵母人工染色體該載體在酵母細(xì)胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個細(xì)胞內(nèi)只有單拷貝。在細(xì)胞分裂和遺傳過程中，能將染色體載體均勻分配到子細(xì)胞中，并保持相對獨立和穩(wěn)定。酵母菌選擇標(biāo)記基因赭石突變抑制基因SUP4表達時菌落呈白色，不表達時呈紅色。外源基因的插入可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組轉(zhuǎn)化子。YAC載體可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達研究。第十一章1原核細(xì)胞表達真核基因的障礙和措施：障礙：1細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真和基因的啟動子2從真和基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，不能結(jié)合到核糖核蛋白體上3真核基因中一般含有內(nèi)含子，而原核基因缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能切除內(nèi)含子，不能形成成熟的mRNA，不能表達真核蛋白。4表達的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。措施：（1）可以通過人工合成的方法或者從cDNA庫中獲取.（2）(2)需要在真核生物基因的上游加入SD序列.(3)使用原核生物的強啟動子.(4)如果人工合成某一蛋白質(zhì)的基因,需要考慮原核生物對密碼子的偏愛性.(5)為了防止原核生物分解目的蛋白可以考慮分泌表達和融合表達等方法.(6)需要較復(fù)雜翻譯后加工的蛋白質(zhì)最好不用原核細(xì)胞表達.信號肽：(signalpeptide)是引導(dǎo)新合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一段多肽，一般位于新合成肽鏈的N端，含有6～15個帶正電荷的非極性氨基酸，由于信號肽又是引導(dǎo)肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的一段序列，又稱開始轉(zhuǎn)移序列(starttransfersequence)。2um質(zhì)粒：：一個閉合環(huán)狀超螺旋DNA分子，長約2um。在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的一種模擬微生物?？捎糜谘芯炕蛘{(diào)控、染色體復(fù)制的理想系統(tǒng)，也可作為酵母菌轉(zhuǎn)化的有效載體，并組建基因工程菌YEP質(zhì)粒：含有釀酒酵母2um質(zhì)粒和DNA復(fù)制有關(guān)的部分或全部序列，是一種酵母附加體型質(zhì)粒。2基因工程疫苗種類主要包括基因工程亞單位疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等四種1、基因工程亞單位疫苗(geneengineeringsubunitvaccine)基因工程亞單位疫苗，主要是指將基因工程表達的蛋白抗原純化后制成的疫苗。優(yōu)點：①產(chǎn)量高；②純度高；③安全性高；④用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。缺點：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，免疫效果較差。增強其免疫原性的方法：①調(diào)整基因組合使之表達成顆粒性結(jié)構(gòu)②是在體外加以聚團化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球③加入有免疫增強作用的化合物作為佐劑（adjuvant）。2、核酸疫苗（nucleicacidvaccine）核酸疫苗或稱基因疫苗（genevaccine），指使用能夠表達抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。優(yōu)點：①易于制備；②便于保存；③可多次免疫并且容易制成多聯(lián)多價疫苗。缺點：①外源核酸是否會整合到染色體中引起癌變；②能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗體的產(chǎn)生，免疫耐受等。3、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）基因缺失活疫苗使用分子生物學(xué)技術(shù)去除與毒力有關(guān)的基因獲得的缺失突變毒株制成的疫苗。優(yōu)點：①有突變性狀明確、穩(wěn)定；②不易返祖、毒力恢復(fù)；③是研究安全有效的新型疫苗的重要途徑。缺點：免疫效率、低用量大。5、蛋白工程疫苗（proteinengineeringvaccine）蛋白工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點突變、插入、缺失、構(gòu)型改變，甚至進行不同基因或部分結(jié)構(gòu)域的人工組合，以期達到增強其產(chǎn)物的免疫原性，擴大反應(yīng)譜，去除有害作