毛細管電泳法 作業(yè)

分析化學

毛細管電泳法

CapillaryElectrophoresis,CE

陳朵花

一、概述generalization

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；

發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學獎；經(jīng)典電泳分析

traditionalelectrophoresis

利用電泳現(xiàn)象對某些化學或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson等用75μm內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——高效毛細管電泳。高效毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質(zhì)中進行；4.應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫(yī)學、藥學、化學、環(huán)境保護、材料等；

二、電滲現(xiàn)象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現(xiàn)象

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。

電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

2、分離過程

電場作用下，毛細管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。3.HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為層流，塞式流動（譜帶展寬很?。?；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。

4

電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細管有效長度

電滲流流出時間

電場強度5.HPCE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；

ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；

ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。6、HPCE中影響電滲流的因素

factorsinfluencedelectroosmosis1）.電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2）.毛細管材料的影響

不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響

對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。4.溫度的影響

毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量；

HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1度，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；5.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。

分離效率和分離度

分離效率柱效可以用理論塔板數(shù)n表示

n=(μep+μeo)Vl/(2DL)

毛細管電泳分離的柱效方程

理論塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W?)2實驗上可按上式求出理論塔板數(shù)

χ為電泳圖上從起點至電泳峰最大值之間的距離W?為電泳峰的半高峰寬

分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：t1、t2分別為兩個組份的遷移時間W為峰底的寬度

三、影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬

factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱進樣電泳擴散毛細管壁對組分的吸附

三、影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬

factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening

1.縱向擴散的影響

在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴散系數(shù)和遷移時間決定。大分子的擴散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.進樣的影響

當進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%～2%。3.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計算：m—電解質(zhì)溶液的摩爾電導；I—工作電流：cm—電解質(zhì)濃度；

散熱過程中，在毛細管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導致區(qū)帶展寬。改善方法：（1）減小毛細管內(nèi)徑；（2）控制散熱；4毛細管壁對組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對毛細管內(nèi)壁進行涂層處理

需要注意：方法也會抑制或改變電滲流

四毛細管電泳的主要分離模式

毛細管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）膠束電動色譜（micellarelectrokineticchromatography,MEKC)毛細管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis,CGE)毛細管等速電泳（capillaryisotachophoresis,CITP)

毛細管等電聚焦（capillaryisoelectricfocus,CIF)毛細管電色譜（capillaryelectrochromatography,CEC)毛細管電泳最基本的分離模式。背景電解質(zhì)是緩沖液，分離是基于樣品中各個組分間質(zhì)荷比的差異。有時需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細管壁的吸附等。在CZE中，影響分離的操作條件為：

√分離電壓

√背景電解質(zhì)種類、濃度和pH

√添加劑種類和濃度

一）、毛細管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式；

二）毛細管凝膠電泳CGE

是毛細管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式

用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的大小分離

毛細管凝膠電泳綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點:電泳峰尖銳，柱效極高短柱上實現(xiàn)極好的分離試樣容量為10－12g主要缺點:制備柱較困難，壽命較短已成為分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、DNA等強有力的工具。例應用CGE分離與激光誘導熒光檢測相結(jié)合，用于DNA序列快速分析。

三）毛細管凝膠電泳

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。四）膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；

五）毛細管等電聚焦CIEF:建立在不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點（pI值）差異基礎(chǔ)上的分離方法。蛋白質(zhì)的等電點(pI):指蛋白質(zhì)分子的凈電荷數(shù)為零時的pH值。

1.根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；六）毛細管等電聚焦

capillaryisoelectricfocusing，CIEF

4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。方法:

進樣－等電聚焦－檢測先將脫鹽的試樣（蛋白質(zhì)）以≥1％的濃度與兩性電解質(zhì)溶液混合，用壓力進樣充入毛細管柱(陽極端)，置于陽極電解質(zhì)溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質(zhì)如NaOH中。施加電壓，進行電泳實驗。兩性電解質(zhì)離子形成pH的位置梯度，而蛋白質(zhì)在遷移時會在其等電點的pH區(qū)域內(nèi)停止移動。這樣pI不同的蛋白質(zhì)各組分會在毛細管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質(zhì)重新帶電，在電場力作用下發(fā)生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質(zhì)得到分離。

六）毛細管等電聚焦五、進樣系統(tǒng)毛細管通道十分細小，所需樣品不過數(shù)nl，所以不能采用色譜的進樣方式。通過讓毛細管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電場力或其它動力來驅(qū)動樣品進入管中。進樣量可以通過控制驅(qū)動力的大小或時間長短來控制。進樣系統(tǒng)必須包括動力控制、計時控制、電極槽或毛細管移位控制等機構(gòu)。

進樣方式：

電動法

壓力法

擴散法電動進樣當把毛細管的進樣端插入樣品溶液并加上電場時，組分就會因電遷移和電滲作用而進入管內(nèi)。電動進樣的控制參數(shù)是電場強度E和進樣時間t。電場強度E取值多在1～60kv/60cm之間；進樣時間通常在1～10s之間，有時可達1min或更大。優(yōu)點：電動進樣對毛細管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特殊限制，屬普適性方法，可實現(xiàn)自動化操作。缺點：電動進樣對離子組分存在偏向，電遷移速度快的進樣多，電遷移速度小的少進甚至不進，這會降低分析的準確性和可靠性。壓力進樣也稱流動進樣，它要求毛細管中的填充介質(zhì)具有流動性。當毛細管兩端置于不同的壓力環(huán)境中時，管中溶液即能流動，將樣品帶入?？捎萌N方法產(chǎn)生進樣動力：正壓、負壓（管尾抽吸）、重力（虹吸）。采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實現(xiàn)正壓進樣，并可與毛細管清洗系統(tǒng)共用，多為商品儀器采用。優(yōu)點：壓力進樣沒有偏向問題，缺點：選擇性差，樣品及其背景同時被引入管中，對后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。擴散進樣利用濃度差擴散原理，當將毛細管插入樣品溶液時，樣品分子因在管口界面存在濃度差而向管內(nèi)擴散。擴散進樣動力屬不可控制參數(shù)，進樣量僅由擴散時間控制。對于利用電動和壓力進樣的系統(tǒng)，設(shè)置電場或壓力差為零，即可實現(xiàn)擴散進樣。擴散進樣時間一般在10～60s。擴散進樣對管內(nèi)介質(zhì)沒有任何限制，屬普適性進樣方法。擴散進樣具有雙向性，在樣品分子進入毛細管的同時，區(qū)帶中的背景物質(zhì)也向管外擴散，由此可得到畸變程度較?。ê捅尘安顒e不大）的初始區(qū)帶，能抑制背景干擾，提高分辨率。擴散與電遷移速度和方向無關(guān)，可抑制進樣偏向，提高定性定