任務單元抗原抗體的制備課件

任務六抗原抗體的制備主要內容單元一抗原的制備單元二抗血清的制備單元三單克隆抗體的制備單元四基因工程抗體學習目標1.掌握抗血清的制備過程及鑒定方法，正確判定抗血清的質量，能正確處理抗血清制備中的干擾因素。2.掌握單克隆抗體技術的原理、制備流程和應用。3.正確理解多克隆抗體、單克隆抗體和佐劑的概念。4.知曉免疫原的制備方法及意義。5.了解基因工程抗體的優(yōu)點、種類和應用。一、顆粒性抗原的制備顆粒性抗原細胞性抗原：血細胞和組織細胞病原體：細菌、病毒、支原體、寄生蟲等采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調合適濃度（一）綿羊紅細胞的制備(二)細菌抗原的制備用途:(1)作為診斷菌液。(2)用于制備免疫血清或診斷血清。2.細菌抗原的檢定1.一般性狀檢定菌種典型；抗原為乳白色懸液；鹽水中不自凝。2.無菌試驗甲醛處理后37℃培養(yǎng)2-3d無菌生長3.純度檢查革蘭氏染色鏡檢10個視野無雜菌。4.特異性試驗玻片凝集試驗強陽性。5.定量凝集試驗凝集效價不低于原血清凝集效價的50%6.濃度測定。二、可溶性抗原的制備組織細胞粗抗原制備組織、細胞清洗和去污處理細胞裂解（搗碎方法）勻漿物提?。ǔ鹾Y物）可溶性抗原制備勻漿物中目的抗原提取純化

（不同純化方法，多次純化）鑒定（定性、定量、特異性、理化性等）分裝、保存可溶性抗原制備的一般流程二、可溶性抗原的制備（一）材料的選取與預處理（二）細胞裂解（三）純化抗原的提取（四）抗原的鑒定（五）抗原的濃縮與保存五步驟二、細胞裂解1.細胞勻漿（1）高速組織勻漿器法（2）研磨法：玻璃勻漿器3.酶處理法適用范圍：多種微生物細胞機制：利用酶反應，破會細胞壁上特殊的鍵，從而達到破壞細胞壁的目的。優(yōu)缺點：優(yōu)點：專一性強，酶解條件溫和。

缺點：費用較高。應用做多的是：溶菌酶（專一分解細胞壁上糖蛋白分子的α-1，4-糖苷鍵）。4.反復凍融法適用范圍：培養(yǎng)細胞、細胞壁較脆弱的菌體機制：突然冷凍時細胞內冰晶的形成及胞內外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。優(yōu)缺點：優(yōu)點：簡便

缺點：①破碎率低②引起對凍融敏感的蛋白質變性（三）可溶性抗原純化

1.蛋白質抗原的純化純化方法：

（1）超速離心法分離亞細胞成分和大分子蛋白質（2）選擇性沉淀法鹽析法最為經典（3）凝膠過濾法（4）離子交換層析法（5）親和層析法（1）超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內，達到彼此分離的目的。特點：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。應用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。（3）凝膠過濾法原理：凝膠具有三維空間多孔網狀結構的物質，經適當溶液平衡后，裝入層析柱。當含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時，大分子物質不能進入凝膠顆粒的網孔結構內，在凝膠顆粒之間的空隙中很快地通過凝膠床，短時間內被洗脫出來；而分子較小的物質則進入凝膠網孔結構內，反復受到阻滯，洗脫較慢。分成大、中、小三種類型。（4）離子交換層析法原理：利用帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷不同，與纖維素結合的能力有差別。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。2.核酸抗原的制備主要步驟破碎細胞蛋白質的去除核酸的沉淀酚和氯仿乙醇核酸的保存（1）溫度-70℃長期保存-20℃4℃（5℃）最佳和最簡單（2）介質TE緩沖液（最常用）3.脂多糖抗原的制備4.Ig片段的制備（1）非共價鍵解離法肽鏈亞單位之間以氫鍵、靜電引力等非共價鍵結合，這些鍵結合力較弱，可經2種方法將其斷開制備片段。

①改變pH：蛋白質解離的臨界值為pH3～4(羧基滴定范圍)和pH9～10(賴氨酸—酪氨酸滴定范圍)，當加入酸或堿使pH低于，3或高于10時，肽鏈亞單位就會解離；②利用強變性劑：多數蛋白在8mol／L脲或6moI兒鹽酸胍中會發(fā)生變性，使肽鏈亞單位解離，此法也可用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取。（2）共價鍵解離法二硫鍵是連接免疫球蛋白肽鏈的共價鍵，解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。解離的方法多采用氧化法和還原法。氧化法的優(yōu)點是切開二硫鍵后，肽鏈不能重新形成二硫鍵，便于肽鏈純化，缺點是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亞砜，色氨酸側鏈被破壞。

還原法目前常用，其原理是將二硫鍵還原成巰基，但還原的琉基極不穩(wěn)定，易再重新結合成二硫鍵，必須及時用碘乙酸或碘代乙酰胺進行羧甲基化以封閉巰基。（3）酶解法酶解法的專一性極好，不同的片段可用不同的酶進行裂解。如木瓜酶水解IgG可獲得1個Fc段和2個Fab段；胃蛋白酶水解IgG可獲得F(ab')：和數個小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作為抗原來制備抗重鏈血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab')；常作為抗體試劑應用。（四）純化抗原的鑒定、濃縮與保存1.定量測定生化技術

如UV法、雙縮脲、酚試劑等蛋白檢測方法。常用的是紫外光吸收法，該法測定280nm和260nm的吸光度(A)值，并根據公式計算蛋白含量。蛋白含量(mg／m1)＝A280nm×1.45-A260nm×0.742.純度鑒定

PAGE、免疫電泳、雙擴3.免疫活性鑒定

免疫電泳、雙向免疫擴散法、ELISA4.濃縮與保存三、半抗原的制備半抗原：僅有抗原性的物質。半抗原+載體=完全抗原（一）載體

1.蛋白質是結構復雜的大分子膠體物質，是一種良好的載體，常用的有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍蛋白等。其中牛血清白蛋白溶解度較高、免疫原性強且易獲得，因此最為常用。蛋白質與半抗原的結合主要通過游離氨基、游離羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基團的縮合。

2.多肽聚合物

人工合成的載體。常用多聚賴氨酸(polylysine)，其分子量高達lOOkD以上，是良好的載體。這種多肽聚合物與半抗原結合后，可誘導產生高效價、高親合力的抗體。

3.大分子聚合物羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可與半抗原結合，加入弗氏完全佐劑可誘導動物產生良好的抗體。（二）半抗原與載體的連接方法

1.物理法通過吸附作用。

2.化學法通過交聯實現。（三）半抗原的鑒定

1.目的：測定半抗原與載體的比例。2.測定方法：（1）吸收光譜分析法（2）放射性核素標記半抗原摻入法（1）如果半抗原有適宜的吸收光譜，測定在一定波長下復合抗原和載體之間克分子吸光度的差別，然后把這個差別與同樣波長下半抗原的克分子吸光度數相比較，就可以準確地計算出所結合的半抗原分子數。（2）在偶聯反應液中加入一定量的放射性核素標記的半抗原，偶聯反應后經充分透析，測量透析袋中的放射性含量，計算結合到載體上的半抗原分子數。四、免疫佐劑免疫佐劑（佐劑）：先于抗原或與抗原同時注入體內，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型的物質被稱為免疫佐劑，簡稱佐劑。本質：佐劑可視為一種非特異性免疫增強劑，可增強體液免疫和細胞免疫應答。（一）佐劑的種類與制備1.種類具備免疫原性的佐劑：如卡介苗、枯草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌、脂多糖、細胞因子等。不具備免疫原性的佐劑：如氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、表面活性劑、藻酸鈣、多聚核苷酸、胞壁肽等。應用最多的是福氏佐劑、細胞因子佐劑。（1）福氏佐劑：分完全福氏佐劑（石蠟油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐劑（石蠟油+羊毛脂）兩種。福氏完全佐劑可提高佐劑效能，但注射后易產生局部持久性潰瘍和肉芽腫，宜注意。（2）細胞因子佐劑：細胞因子佐劑與抗原合用，可有效激發(fā)機體的免疫功能。IL-2、IL-1、IFNγ、IL-12、GM-CSF皆較常應用；細胞因子佐劑還被廣泛應用于腫瘤基因治療中。用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細胞因子、熱休克蛋白常用于動物實驗的佐劑：弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)。2.制備制備方法（1）研磨法（2）攪拌混合法（注射器混合法）（3）其他方法超聲（二）佐劑的作用機制1.改變抗原的物理性狀，