第十八章高效液相色譜法

第十八章高效液相色譜法HPLC1經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ);引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù);高壓輸送流動(dòng)相;高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器;現(xiàn)代液相色譜分析方法。2與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)109g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1012g。

3與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。4第一節(jié)高效液相色譜法的主要類(lèi)型和原理

一、主要類(lèi)型 四類(lèi)基本類(lèi)型色譜法

分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）分子排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法5二、化學(xué)鍵合相色譜法

以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相6優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過(guò)程中不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類(lèi)多，分離的選擇性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法：根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱7（一）正相鍵合相色譜法

固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類(lèi)。（與水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物8正相鍵合相色譜法分離選擇性：極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。分離機(jī)制：分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用9（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑常用甲醇－水、乙腈－水等應(yīng)用：最廣。非極性至中等極性的組分，（還有有機(jī)酸、堿及鹽等）10保留機(jī)制疏溶劑理論（solvophobictheory）溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力，11保留行為的主要影響因素1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。2、固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長(zhǎng)而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。123、流動(dòng)相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑種類(lèi)：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大pH：影響弱酸、弱減的離解 流動(dòng)相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。13離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatography；ISC）用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱堿14把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，被分析的組分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子（或稱(chēng)對(duì)稱(chēng)離子，counterion）生成不荷電的中性離子對(duì)，從而增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。用于分離可離子化或離子型化合物。（三）反相離子對(duì)色譜法

pairedionchromatography；PIC

ionpairchromatography；IPC15離子對(duì)模型固定相Bm++Am-?（B+·A-）m?（B+·A-）s流動(dòng)相通式+(BH+·RSO3-）mB+H+?BH+RSO3Na?RSO3-+Na+離子對(duì)(BH+·RSO3-）s16影響保留因子的因素離子對(duì)試劑的種類(lèi)和濃度：在反相離子對(duì)色譜中，離子對(duì)試劑碳鏈長(zhǎng)度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大流動(dòng)相的pH：有利于組分和離子對(duì)試劑離子化時(shí)（離子對(duì)的形成），組分的k值最大固定相、流動(dòng)相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。17適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。分析酸類(lèi)或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等分析堿類(lèi)或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、正庚烷基磺酸鈉（PICB7）。

適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇18三、其他高效液相色譜法

（一）離子色譜法

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。離子色譜法可分為兩大類(lèi)：抑制型（雙柱型）和非抑制型（單柱型）以分析陰離子X(jué)-為例：分離柱：填有低交換容量的陰離子交換劑抑制柱：填有高交換容量的陽(yáng)離子交換劑（稱(chēng)為陰離子抑制柱）。19兩柱上的反應(yīng)：分離柱：交換反應(yīng)：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH洗脫反應(yīng)：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX抑制柱：與組分反應(yīng)：R--H++NaX→R--Na++HX與洗脫劑反應(yīng):R--H++NaOH→R--Na++H2O20(二）手性色譜法手性色譜法是利用手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑分離分析手性化合物的對(duì)映異構(gòu)體的色譜法。間接法分析手性化合物的對(duì)映體，即將試樣與適當(dāng)?shù)氖中栽噭?單一對(duì)映體)反應(yīng)，使其一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)體，然后用常規(guī)HPLC方法分離分析。21實(shí)現(xiàn)手性拆分的基本原理是對(duì)映異構(gòu)體與手性選擇物(固定相或添加劑)形成瞬間非對(duì)映立體異構(gòu)“配合物”，由于兩對(duì)映異構(gòu)體形成的“配合物”的穩(wěn)定性不同，因而得到分離。手性固定相的種類(lèi)繁多，它們與對(duì)映體的作用力也各有個(gè)同。如π-氫鍵型固定相與手性化合物之間一般認(rèn)為有3種作用力，即π-π相互作用、氫鍵作用和偶極間相互作用，化合物與固定相之間的作用部位至少有一個(gè)受對(duì)映體立體構(gòu)型的影響。22

（三）親和色譜法（AC）

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種方法。它通常是在載體（無(wú)機(jī)或有機(jī)填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。23第二節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇固定相應(yīng)符合下列要求：顆粒細(xì)且均勻；傳質(zhì)快；機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。24一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類(lèi)非極性鍵合相：非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩(wěn)定性更好。25弱極性鍵合相：醚基和二羥基等鍵合相用于反相或正相色譜極性鍵合相：常用氨基﹑氰基鍵合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)鍵合硅膠一般用于正相色譜特殊用途的鍵合相26（二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)

鍵合反應(yīng)硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)

如：YWG－C18H37，無(wú)定形硅膠YWG上鍵合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅膠Spherisorb上鍵合了ODS。27鍵合相的性質(zhì)含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù)覆蓋度：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例封尾（end-capping）：在鍵合反應(yīng)后，用三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅醇基。28鍵合相的特點(diǎn)使用過(guò)程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大注意：流動(dòng)相的pH一般應(yīng)在2-8，否則會(huì)引起硅膠溶解；不同廠家，不同批號(hào)的同一類(lèi)型鍵合相也可能表現(xiàn)不同的色譜特性。29二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動(dòng)相

對(duì)流動(dòng)相的要求：與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。對(duì)試樣有適宜的溶解度，使k在1~10范圍內(nèi)。與檢測(cè)器相適應(yīng)。純度高，粘度小。30（一）流動(dòng)相對(duì)分離的影響n由色譜柱（固定相）性能決定，α主要受溶劑種類(lèi)的影響，k受溶劑配比的影響。增加流動(dòng)相中強(qiáng)溶劑的比例，其洗脫能力增強(qiáng)，使k變小。31（二）流動(dòng)相的強(qiáng)度和選擇性溶劑的極性（強(qiáng)度）正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng)溶劑的選擇性不同種類(lèi)的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同混合溶劑（二元或多元流動(dòng)相）32溶劑極性參數(shù)：表示溶劑與乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲烷相互作用純?nèi)軇┑臉O性參數(shù)P′P′=lg（Kg″)e+lg(Kg″)d+lg(Kg″)nKg″極性分配系數(shù)P′越大，溶劑的極性越強(qiáng)，在正相色譜中的洗脫能力越強(qiáng)。強(qiáng)度因子反相色譜中的溶劑強(qiáng)度用強(qiáng)度因子S表示。反相色譜中，S大的溶劑洗脫能力強(qiáng)。33混合溶劑的強(qiáng)度溶劑的選擇性Xe、Xd、Xn分別反映溶劑的質(zhì)子接受能力、質(zhì)子給予能力和偶極作用力3435三、分離條件的選擇（一）HPLC中的速率理論H=A+B/u+Cu渦流擴(kuò)散A=2λdp

球形、小粒度、均勻（RSD＜5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A?？v向擴(kuò)散B=2γDm可以忽略。因?yàn)镈l很小，室溫操作，且U大于U最佳，36傳質(zhì)阻抗固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略，因df極小流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm

要求：dp小，Dm大靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗：由于部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η

要求:固定相dp2、流動(dòng)相η都小37

H=A+Cmu+Csmu原因：化學(xué)鍵合相，液體流動(dòng)相結(jié)果：HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：①小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相；②低粘度流動(dòng)相，流速不宜過(guò)快；③柱溫適當(dāng)。HPLC中的速率理論38（二）正相鍵合相色譜法的分離條件

固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等分離含雙鍵的化合物常用氰基鍵合相，分離多基團(tuán)化合物常用氨基鍵合相。流動(dòng)相烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑39（三）反相鍵合相色譜法的分離條件

固定相非極性鍵合相如ODS流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑加入0.1%∽1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用40（四）反相離子對(duì)色譜法的分離條件

固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相，離子對(duì)試劑 離子對(duì)試劑所帶的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反流動(dòng)相pH使試樣組分與離子對(duì)試劑全部離子化有機(jī)溶劑及其濃度同一般HPLC41第三節(jié)高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)4243一、輸液系統(tǒng)（1）高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動(dòng)相過(guò)程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。有串聯(lián)式和并聯(lián)式44來(lái)自流動(dòng)相454647輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕輸液泵操作注意事項(xiàng)：防止固體微粒進(jìn)入泵體流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完不超過(guò)規(guī)定的最高壓力流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣48（2）梯度洗脫裝置在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。

液相色譜中通常所說(shuō)的梯度洗脫是指流動(dòng)相梯度，即在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相的組成或濃度。49

線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。

階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。50

高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。51

低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。52二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣器進(jìn)樣閥（六通閥）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置色譜柱（column）由柱管和固定相組成分析柱、制備柱性能評(píng)價(jià)H、n、fs、k和α的重復(fù)性，或R。

53

色譜填料：經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10μm粒徑的球形顆粒。

色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。

色譜柱：也稱(chēng)固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的。5455三、檢測(cè)系統(tǒng)

檢測(cè)器：用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。檢測(cè)器利用溶質(zhì)的某一物理或化學(xué)性質(zhì)與流動(dòng)相有差異的原理，當(dāng)溶質(zhì)從色譜柱流出時(shí)，會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相背景值發(fā)生變化，從而在色譜圖上以色譜峰的形式記錄下來(lái)。56（一）檢測(cè)器(detector)的主要性能要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測(cè)限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專(zhuān)屬型）57（二）紫外檢測(cè)器(ultravioletdetector)

檢測(cè)原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點(diǎn)：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。局限：專(zhuān)屬型、濃度型檢測(cè)器只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。58固定波長(zhǎng)檢測(cè)器：254nm可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiodearraydetector；PDAD)：一系列光電二極管，一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光59光電二極管陣列檢測(cè)器工作原理：復(fù)光通過(guò)流通池，再進(jìn)入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時(shí)獲得各波長(zhǎng)的信號(hào)強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。606162（三）熒光檢測(cè)器(fluorescencedetector；FD)檢測(cè)原理：熒光強(qiáng)度(F)與激發(fā)光強(qiáng)度(I0)及熒光物質(zhì)濃度(C)之間的關(guān)系為：F=2.3QKI0εCl

Q為量子產(chǎn)率，K為熒光效率，ε為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長(zhǎng)度。F=KC

特點(diǎn)：選擇性好，專(zhuān)屬型檢測(cè)器靈敏度比紫外檢測(cè)器高（檢測(cè)限10-10g/ml）激發(fā)波長(zhǎng)(ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(em)的選擇6364（四）安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器的靈敏度很高，尤其適用于痕量組分的分析，凡具有氧化還原活性的物質(zhì)都能進(jìn)行檢測(cè)，本身沒(méi)有氧化還原活性的化合物經(jīng)衍生化后，也能進(jìn)行檢測(cè)。安培檢測(cè)器的工作原理：在電極間施加一恒定電位，當(dāng)電活性組分經(jīng)過(guò)電極表面時(shí)，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。反應(yīng)的電流：65（五）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

適用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，主要用于檢測(cè)糖類(lèi)、高級(jí)脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、三酰甘油及甾體。66第四節(jié)高效液相色譜分析方法

一、定性分析方法1．色譜鑒定法利用色譜定性參數(shù)保留時(shí)間(或保留體積)和相對(duì)保留值或用已知物對(duì)照法對(duì)組分進(jìn)行鑒別分析，其原理是同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時(shí)間相同。此法只能對(duì)范圍已知的化合物進(jìn)行定性。6