色譜分析法導(dǎo)論

色譜分析法導(dǎo)論一、色譜分析概論問題問題1：什么是色譜法？問題2：為什么色譜法能將混合物分開？問題3：色譜法的分類？問題4：各種色譜法的應(yīng)用范圍？1、什么是色譜法？茨維特的實驗茨維特：俄國植物學(xué)家，主要從事植物色素的研究工作，在1906

年發(fā)表的文章中，首次提出了色譜的概念。茨維特的實驗因此色譜法是一種分離方法。它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。Chromatography將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。2、色譜法分離原理當(dāng)流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。3、色譜法的分類

按流動相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC)什么是氣相色譜法？以氣體為流動相的色譜法GasChromatogaphy，簡稱GC按固定相狀態(tài)的不同可分為：氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC)適合分離分析易汽化（在-190℃-500℃范圍內(nèi)有的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應(yīng)的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的分離。什么是液相色譜法？以液體為流動相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡稱LC適合分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。應(yīng)用舉例(HPLC)按固定相使用的形式可分為柱色譜（ColumnChromatography）將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜（PaperChromatography）用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（ThinLayChromatography）固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上

關(guān)于分配平衡分配系數(shù)K(distributioncoefficient)分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態(tài)時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。是衡量柱子對組分保留能力的重要參數(shù)。相比β

色譜柱內(nèi)固定相和流動相體積之比

是柱型及結(jié)構(gòu)的重要特征。

4.色譜相關(guān)術(shù)語關(guān)于色譜峰關(guān)于保留值關(guān)于分配平衡

關(guān)于色譜峰的術(shù)語峰峰高基線峰寬半峰寬峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差σ

色譜峰寬（區(qū)域?qū)挾龋┓宓讓扺b

在色譜峰兩邊的轉(zhuǎn)折點所畫的切線與基線相交的截距。標(biāo)準(zhǔn)偏差σ拐點間距離的一半

半峰寬度峰高一半處的峰寬度

W

1/2=2.354σ

峰底寬

Wb=4σ

拐點處峰寬

Wσ=2σ

（4）色譜圖的信息

a.色譜峰個數(shù)判斷試樣中所含組分的最少數(shù)

b.色譜保留值定性

c.色譜峰面積或峰高定量A=KCd.保留值與區(qū)域?qū)挾仍u價柱分離效能依據(jù)

e.兩峰間距評價兩組分能否分離

關(guān)于保留值的術(shù)語死時間(tM):無保留組分出峰時間保留時間(tR):從進(jìn)樣開始到色譜峰最大值出現(xiàn)所需時間調(diào)整保留時間(t’R):死體積(VM):保留體積(VR):

調(diào)整保留體積(V’R):相對保留值ɑ：二、色譜分析法基本理論研究理論的目的解決色譜峰的分離問題三個色譜基本理論問題色譜熱力學(xué)問題——發(fā)展高選擇性色譜柱色譜動力學(xué)問題——發(fā)展高效能色譜柱分離條件的最優(yōu)化問題——分離條件優(yōu)化1、色譜動力學(xué)理論

研究流出曲線展寬的本質(zhì)及曲線形狀變化的影響因素塔板理論速率理論（1）塔板理論推導(dǎo)

塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：為標(biāo)準(zhǔn)偏差當(dāng)t=tR時，C=Cmax，峰高正比于進(jìn)樣量C0，是峰高定量的理論基礎(chǔ)。當(dāng)n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留時間一定時，塔板數(shù)越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留時間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留時間大的組分峰低且寬。

對色譜流出曲線方程的討論

柱效

由流出曲線方程導(dǎo)出：

H=L/nn是峰相對展寬的量度n是柱效的量度n是常數(shù)時，W與tR

成正比n越大，H越小，表明組分在柱中達(dá)到的分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利，但還不能預(yù)言各組分有被分離的可能性。

塔板理論的貢獻(xiàn)塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。導(dǎo)出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現(xiàn)象相吻合。導(dǎo)出理論塔板數(shù)的計算公式，作為柱效的評價指標(biāo)。

塔板理論的局限塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質(zhì)是什么？它與哪些參變量有關(guān)，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導(dǎo)意義有限。不能解釋流速對理論塔板數(shù)的影響。有些假設(shè)不合理，如沒有考慮縱向擴散對色譜分離的影響等。（2）速率理論概述速率理論是1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。運用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產(chǎn)生色譜峰擴展的因素，導(dǎo)出了理論塔板高度與流動相線速度的關(guān)系，揭示了影響塔板高度的動力學(xué)因素。

氣相色譜中速率方程的導(dǎo)出速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數(shù)n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu渦流擴散項A=2λdp渦流擴散項均勻性因子粒徑

渦流擴散項A

由不等路徑造成的色譜峰擴展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長短不同的路徑，因此流動相沿柱內(nèi)各路徑形成紊亂的渦流運動，有些溶質(zhì)分子沿較窄且直的路徑運行，以較快的速度通過色譜柱，發(fā)生分子超前，反之，有些分子發(fā)生滯后，從而使色譜峰產(chǎn)生擴散。

分子擴散項B/u項其中B=2γDg彎曲因子擴散系數(shù)

分子擴散項由于分子的縱向擴散造成的色譜峰擴展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運動著的分子產(chǎn)生縱向擴散，引起色譜峰擴展。

傳質(zhì)阻力項由氣相傳質(zhì)阻力和液相傳質(zhì)阻力兩項組成

氣相傳質(zhì)阻力項Cgu

試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子隨流動相向前運動，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。

容量因子

液相傳質(zhì)阻力項CLu

試樣組分從固定相表面移動到固定相內(nèi)部再回到表面的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。

液相擴散系數(shù)液膜厚度氣相色譜中的速率方程

速率方程給我們的什么啟示？為柱型的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)為操作條件的選擇提供理論指導(dǎo)為色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)對柱型研究和發(fā)展的影響（1）A=0?Golay1957年提出毛細(xì)管柱的概念（opentube）毛細(xì)管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分離能力大大提高對柱型研究和發(fā)展的影響（2）B=0?溶質(zhì)在液體中的擴散系數(shù)DL≈10-5cm2/s溶質(zhì)在氣體中的擴散系數(shù)Dg≈10-1cm2/sDL《Dg當(dāng)采用液體作流動相時

B→0液體作流動相時可用更細(xì)的固定相，A↓HPLC柱效比GC要高2~3個數(shù)量級操作條件對柱效的影響（1）H-u曲線載氣線速度（流速）的影響最佳流速：u=(B/C)1/2實用最佳流速：比最佳流速更快A與流速無關(guān)B/u：當(dāng)流速小時，對H的大小起主導(dǎo)作用Cu：當(dāng)流速大時，對H的大小起主導(dǎo)作用容量因子k的影響不同組分k不同，測出的柱效不同在氣相傳質(zhì)阻力相中，k↑

，Cg↑理論上說k越小柱效越高，實際不可取在液相傳質(zhì)阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當(dāng)k=1時，最大。希望k在一個合適的范圍內(nèi)，通過改變柱溫、固定相、柱型參數(shù)等可實現(xiàn)。柱溫的影響間接影響、十分復(fù)雜對k影響，對擴散系數(shù)影響，從而對柱效產(chǎn)生影響，但影響情況難以判斷對色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)（1）柱徑：柱徑越小，固定相越難填充均勻。柱長L：柱長增加，總塔板數(shù)增加，但分離時間將增加。固定相粒徑dp：根據(jù)速率方程，粒徑減小，A項減小，C項減小，柱效增加。但粒徑太小，不易填充均勻，A項又增大。對色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)（2）液膜厚度df：從柱效角度考慮，液膜越薄，柱效越高（根據(jù)速率方程），但允許的進(jìn)樣量減小。（1）幾個概念——選擇性系數(shù)α定義與相對保留值(ri,s)基本相同不同之處在于選擇性系數(shù)是兩個相鄰峰的調(diào)整保留值之比（后峰比前峰，α≥1），而不是被測物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的調(diào)整保留值之比（可小于1）它是評價固定液選擇性的指標(biāo)。選擇性系數(shù)越大，該柱對此相鄰峰的分離越好。

幾個概念——有效塔板數(shù)N有效在氣相色譜中，通常用有效塔板數(shù)N有效和有效塔板高度H有效來評價柱子的分離效能，它扣除了死體積對分離的影響，更好地反映了柱子的實際分離效能。柱效越高，該柱的分離能力越好。幾個概念——分離度RR越大，說明兩組分分離得越好。由于該定義綜合了色譜動力學(xué)和熱力學(xué)因素，可作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)。(2)色譜分離基本方程（Purnell方程）

公式推導(dǎo)（3）色譜分離基本方程的啟示要改善物質(zhì)對的分離（提高R），即提高兩相鄰物質(zhì)的分離度，可以采取以下措施：提高柱效N提高選擇性系數(shù)α增大容量因子kN的影響，如何提高N？分離度R與理論塔板數(shù)N的平方根成正比關(guān)系，增加塔板數(shù)，有利于提高分離度。增加柱長可增加N，改善分離，但分析時間將大大延長，峰產(chǎn)生擴展。減小塔板高度H：根據(jù)速率方程的啟示制備一根性能優(yōu)良的色譜柱是十分重要的。根據(jù)速率方程選擇合適的色譜條件同樣有效。K的影響，如何改變k？分離度與容量因子有關(guān)，容量因子越大，分離越好。

k135791113∞但當(dāng)容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1<k<10。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖兿啾?，即改變固定相的量和改變柱死體積，其中死體積對k/(k+1)的影響很大，使用死體積大的柱子，分離度將受到很大損失。在高效液相色譜中改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法α的影響，如何改變α？αN有效R=1.0R=1.51.001.0051.011.021.051.101.251.502.00∞650000163000420007100190040014065∞145000036700094000160004400900320145相對保留值（選擇性因子）α越大，分離效果越好。增大α是提高分離度最有效的手段。改變柱溫也可改變α。在氣相色譜中，增大α最有效的手段是改變固定相，選擇合適的固定相種類是解決分離問題的關(guān)鍵在高效液相色譜中，流動相的種類和配比是改善分離最簡便有效的方法。（4）分離度究竟要多大？一般來說R應(yīng)大于。具體工作中應(yīng)根據(jù)樣品要求和定量方法來確定。例如：含量50%的組分，要使峰高定量誤差小于1%，需達(dá)到R1/2，而采用峰面積定量R1/2需。含量1%的組分，要使峰高定量誤差小于1%，需達(dá)到R1/2，而采用峰面積定量R1/2需。3.氣相色譜操作條件的選擇流速柱溫氣化溫度檢測器溫度進(jìn)樣量載氣種類固定相種類流速u（Fc）根據(jù)速率方程，可計算求出最佳流速，此時柱效最高。在實際工作中，為縮短分析時間，往往使流速稍高于最佳流速。具體的：對于填充柱，氮氣的實用最佳線速為10-15cm/s；氫氣為15-25cm/s；氦氣介于兩者之間。若填充柱內(nèi)徑為4mm，則體積流速為氮氣30-40ml/min，氫氣40-60ml/min。柱溫Tc直接影響分析效能和分析速度。每一種固定液都有它的最高使用溫度，柱溫不可超過這一溫度，否則固定液揮發(fā)流失。柱溫太高，組分揮發(fā)度靠攏，不利于分離。但柱溫太低，被測組分的擴散速度下降，分配不能快速達(dá)到平衡，影響峰型，柱效下降，并使分析時間大大延長。柱溫選擇的原則是，在保證難分離物質(zhì)有良好分離的前提下（分離度滿足要求），盡可能采取較高柱溫，以縮短分析時間，保證峰型對稱。汽化溫度一般進(jìn)樣方法下，汽化溫度比柱溫高30-70℃。進(jìn)樣量大時高一些好，保證瞬間汽化。保證不可超過試樣的分解溫度。其它氣化溫度與具體進(jìn)樣方式有關(guān)。檢測器溫度一般大于或等于柱溫，具體與檢測器種類有關(guān)。進(jìn)樣量液體試樣一般進(jìn)樣量。氣體試樣一般進(jìn)樣量為。具體視柱類型，固定液含量（不能超過柱容量）、進(jìn)樣方式、檢測器的靈敏度和線性范圍等確定。流動相（載氣）種類流動相的種類要視檢測器種類確定。常用的有氫氣（熱導(dǎo)用）、氮氣（氫火焰用）、氦氣（均可用，但價格較高）。氫氣和氦氣適合于快速分析。氮氣做載氣峰型較好，柱效較高。三、色譜定性與定量方法1.色譜定性分析(1)利用保留值及其規(guī)律定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)。利用純物對照定性利用文獻(xiàn)值對照定性純物質(zhì)對照定性實現(xiàn)方法利用保留時間和保留體積定性

用相對保留值定性

用已知物增加峰高法定性

應(yīng)用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。優(yōu)點：應(yīng)用簡便，不需要其他儀器。缺點：定性結(jié)果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性文獻(xiàn)值對照定性分析（GC）實現(xiàn)方法測定相對保留值ri,s測定保留指數(shù)I

優(yōu)點：無需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關(guān)。缺點：對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。

適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質(zhì)。(2)與其它儀器或化學(xué)方法聯(lián)合定性離線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法在線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法離線聯(lián)用方式收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷卻后收集應(yīng)用范圍：無標(biāo)準(zhǔn)物時，可對較為復(fù)雜的混合物進(jìn)行定性分析缺點：麻煩在線聯(lián)用方式用化學(xué)方法輔助定性柱前反應(yīng)：在色譜柱前裝上預(yù)處理柱，帶有某些官能團的化合物在預(yù)柱中發(fā)生物理化學(xué)變化，其色譜峰會消失或移動，與反應(yīng)前色譜圖比較，可初步判斷試樣中含那些官能團。柱后反應(yīng)：在色譜柱后裝上Ｔ型毛細(xì)管分流器，將各組分導(dǎo)入官能團試劑反應(yīng)管，利用官能團反應(yīng)對組分進(jìn)行定性。與其它儀器聯(lián)用定性

混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口導(dǎo)入其它儀器中進(jìn)行定性。常用的聯(lián)用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……

其它儀器相當(dāng)于色譜儀的檢測器。使用范圍：復(fù)雜樣品的定性。優(yōu)點：不需要標(biāo)準(zhǔn)物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。缺點：需要特殊儀器或設(shè)備。GC-MS2色譜定量分析(1)色譜定量基礎(chǔ)色譜定量分析是基于被測物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：（2）定量要解決的問題峰面積的測量和計算校正因子的測量與計算色譜定量方法及其應(yīng)用峰面積的測量與計算積分儀或色譜工作站簡便、速度快，精度