霍亂弧菌樣品采集及前處理課件

霍亂弧菌樣品采集及前處理2012.9.20內(nèi)容樣品采集的總體要求樣品種類采樣方法及其注意事項樣品前處理增加或改動內(nèi)容兩種新的水樣采集方法Moore法（小體積水樣）及Spira法（大體積水樣）水樣的前處理方法雜質(zhì)少的水體、渾濁水體、海洋和河口水樣食品的前處理方法貝類、魚類、牡蠣樣品種類糞便病人嘔吐物尸體腸內(nèi)容物糞便污染的衣物及相關(guān)物體表面如地面水體食品水生動物蒼蠅采樣方法一、

糞便標(biāo)本一般采用自然留便，若采樣時病人無便或嬰幼兒則可采用肛拭法。盡可能在急性期、抗生素使用前采集新鮮糞便，樣品采集后應(yīng)盡快送檢。留便：取自然排出的新鮮糞便，成形便采集約5g標(biāo)本；水樣便或典型的米泔水樣便采集約5ml。肛拭法：先用無菌甘油水或生理鹽水濕潤棉簽，多余的液體緊靠管壁擠出；再用棉拭或肛門采便管由肛門插入直腸內(nèi)約3cm～5cm（幼兒約2cm～3cm）處，輕輕旋轉(zhuǎn)360°，擦取直腸表面黏液后取出。避免采便量過少（注意棉簽上應(yīng)沾有糞便）。采樣方法一、

糞便標(biāo)本采肛拭子時應(yīng)注意拭子大小是否適宜、光滑、結(jié)實且不易脫落。肛拭子標(biāo)本如不能在2h內(nèi)送達(dá)實驗室，應(yīng)插入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)送，注意培養(yǎng)基應(yīng)埋住糞便拭子，手接觸的部分在管口折斷棄去。采樣方法二、

嘔吐物和洗胃水患者如有嘔吐，應(yīng)盡量采集嘔吐物。用無菌壓舌板或棉拭子挑取少量嘔吐物作為檢材，放入自封塑料袋中并封好袋口或置于滅菌帶蓋瓶中，然后蓋緊瓶蓋，立即置于冷藏箱中。洗胃水置于滅菌容器內(nèi)冷藏送檢采樣方法三、物體表面用滅菌棉拭蘸以滅菌生理水或堿性蛋白胨水涂擦被糞便污染的衣物、床單、食物操作臺、砧板、地面等相關(guān)物體或懷疑污染物體表面，放入到裝有少量生理鹽水的采樣管中，立即冷藏；或直接置于堿性蛋白胨水管中，常溫下運(yùn)往實驗室。采樣方法四、水體標(biāo)本包括河口水、江河水、溝渠水、池塘水、湖水、井水、港灣海水、鄉(xiāng)鎮(zhèn)自來水廠源水、醫(yī)院污水排放口、下水道排放口、海水產(chǎn)品養(yǎng)殖水、海水產(chǎn)品交易市場的出水口等。需要時也可采集水體的底泥作為檢材。水樣標(biāo)本的采集方法有多種，各實驗室應(yīng)根據(jù)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查需要及實驗室自身檢測條件，如有無過濾器等等，作相應(yīng)的選擇。水源標(biāo)本的采集方法2.Moore紗布集菌法：該方法尤其適用于河流等流動水水樣的采集，但對于靜止水無優(yōu)勢。城市生活污水的采集也可采用此法，該技術(shù)的敏感性似乎不取決于污染源與采樣點的距離，應(yīng)將采樣裝置放在各主要管道輸入口處。Moore紗布集菌法取120cm×15cm紗布塊（圖-1），沿紗布長度方向折疊幾次，在中心系一釣魚繩(長1m以上)，為防止繩子被固定在樹枝或其它物體上時被磨斷，可以在繩子的末端系上一段金屬細(xì)絲（圖-1）。用牛皮紙包好，高壓蒸汽滅菌備用。采樣時，將紗布放在采水點的水中，然后將金屬絲固定于岸邊的樹枝或其他物體上，放置24～48小時后，將帶著水(約55ml)的紗布放入滅菌瓶中，置于冷藏箱后送到實驗室。水源標(biāo)本的采集方法2.Moore紗布集菌法：如果是采集醫(yī)院污水排放口、下水道排放口、肉聯(lián)廠加工的出廠水等水樣時，應(yīng)將紗布放在各個污水管道系統(tǒng)入口處，并仔細(xì)評估采樣點周圍可能抑制目標(biāo)菌分離培養(yǎng)的各種因素。對于有傾倒腐敗垃圾的污水系統(tǒng)進(jìn)行采樣時，應(yīng)將紗布放在傾倒口的上游，以免有毒廢棄物的污染，影響后續(xù)的病原體分離。水樣采集后不能在3小時內(nèi)送檢者，應(yīng)在采水點即將帶水紗布加至增菌液中，搖勻，室溫下運(yùn)送至實驗室。帶水紗布與增菌液的體積之比應(yīng)為10%～20%。水源標(biāo)本的采集方法3.Spira紗布集菌法：用于過濾并采集大體積水樣（約1.5升）。取500克的塑料瓶，在其底部掏一個2cm的洞（圖-2）。洞的大小很關(guān)鍵，如果太大，水樣過濾時會將紗布從孔中拉出來；如果太小又會引起水樣過濾太慢。將120cm×180cm大小的紗布一層一層疊起來，折成30cm寬，放入帶孔的塑料瓶中。既要使紗布相對比較結(jié)實又要使其仍有可壓縮性，要能過濾大約瓶子體積的三分之二的水，而且要使水經(jīng)過紗布過濾后流出去而不是從紗布旁邊直接流出去。用牛皮紙將紗布包好，高壓蒸汽滅菌后備用。將水樣從瓶子的頂部注入并使其從底部流出。無菌操作取出紗布，放入盛有100ml10×濃縮增菌液的三角燒瓶或廣口瓶中，補(bǔ)加水樣至1L，混勻，室溫下盡快送往實驗室。采樣方法五、食品針對不同的可疑食品，采集整體或部分標(biāo)本，帶至實驗室。注意采集過程中不同食品不能交叉污染。采樣方法六、水生動物選取活海水產(chǎn)品或涂抹拭子，置于塑料袋內(nèi)（拭子標(biāo)本可按糞便拭子保存運(yùn)輸方法處置），盡快送往實驗室。如有成箱的海產(chǎn)品，則采取多個海產(chǎn)品的體表作為一個標(biāo)本送檢，這可能比只做一只海產(chǎn)品體內(nèi)檢查的陽性檢出機(jī)會多。注意采集過程中不同海產(chǎn)品間不能交叉污染。樣品前處理1.水樣標(biāo)本的前處理濾膜法：將雜質(zhì)較少的被檢水樣１00ml，注入已滅菌的濾膜（0.45μm)濾器中抽濾后，將濾膜取下，置堿胨水增菌培養(yǎng)基中，35℃～37℃培養(yǎng)6～8小時后接種至TCBS或其它選擇性平板吸附沉淀法：取水樣450ml，先加入10%無菌碳酸鈉溶液2ml及10%硫酸亞鐵溶液1.7ml，混勻，靜置50分鐘，棄上清，取沉淀物約40～50ml，置50～100ml2×堿胨水增菌液中，35℃～37℃培養(yǎng)6～8小時后接種至TCBS或其它選擇性平板樣品前處理1.水樣標(biāo)本的前處理來自海洋和河口的水樣，因其含有大量的其它弧菌，而這些弧菌在堿胨水中和TCBS平板上與霍亂弧菌生長得一樣好。這些標(biāo)本應(yīng)作倍比稀釋，使成10-1、10-2、10-3

，以減少競爭性微生物。然后將堿胨水放在42℃增菌，以抑制一些競爭者的生長，尤其是在該溫度下生長得不好的其它弧菌。相反，淡水和生活污水在放入42℃培養(yǎng)前則不需要進(jìn)行稀釋特別臟的水體首先將10mL水樣加入90mL堿性蛋白胨水中，使成10-1，然后再作系列稀釋，制成10-2和10-3，將三個稀釋度的水樣分別置于37℃增菌培養(yǎng)6～8h。有條件時或檢測需要時、還可制備平行樣，然后將三個稀釋度的水樣分別置于42℃增菌。樣品前處理2.水生動物標(biāo)本處理因為牡蠣肉的某些成份對于O1群霍亂弧菌有毒性，因此一次只能處理少量牡蠣樣品（10～12只），并且要盡快稀釋，這樣既能稀釋其它微生物還能削弱牡蠣肉的殺菌作用有條件的實驗室可以做平行樣，分別放在35℃～37℃和42℃培養(yǎng)。42℃增菌可以大大增加分離霍亂弧菌的機(jī)率，對于牡蠣樣品更是強(qiáng)烈推薦此法24小時pH4℃室溫37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1052.0------------2.6------------4.0++++------------6.3++++34個菌+++++++++++6個菌+++++++++-++++--7.2*++++7個菌++++15個菌++++-++++3個菌----8.4++++×++++×++++×++++×++++×++++-×注：++++：無法計數(shù)；+++：無法計數(shù)，但散在單個菌落較多；++：菌落大都以單個散在形式存在，個別菌落粘連在一塊；+：能夠計數(shù)；×：未接種平板；*：10倍濃縮的PBS96小時pH4℃室溫37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1054.0--×××××-××××6.3++++3個菌++++++++++1個菌++++++++++---7.2*+