ELISA 雙抗夾心法檢測抗原

ELISA雙抗體夾心法檢測抗原王春復(fù)旦大學(xué)免疫學(xué)系復(fù)旦大學(xué)免疫生物學(xué)研究所<<細(xì)胞與分子免疫學(xué)技術(shù)>>整理課件

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)

一種固相酶免疫測定技術(shù)，利用酶標(biāo)記的抗原或者抗體，在固相載體上定量或定性測定特異性抗體、可溶性抗原及細(xì)胞表面抗原。1971年由瑞典學(xué)者Engrall和Perlmann,荷蘭學(xué)者weeman和Schuurs報(bào)道；開創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測定的實(shí)驗(yàn)方法；整理課件ELISA-測抗原（Ag）或抗體（Ab）三要素抗原或抗體的固相化：已知的Ag/Ab結(jié)合到固相載體表面，并保持其免疫活性；抗原或抗體的酶標(biāo)記：酶標(biāo)Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物顯色：底物被酶催化成為有色產(chǎn)物—定性和定量–放大免疫反應(yīng)的信號基本原理整理課件高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值基本特點(diǎn)整理課件基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法整理課件基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法整理課件顯色間接法檢測特異性抗體包被已知抗原與待測抗體孵育與酶標(biāo)抗體孵育加入底物包被已知抗原整理課件優(yōu)點(diǎn):只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法操作簡單迅捷缺點(diǎn)：可重復(fù)性差通常用于抗體效價(jià)的檢測和某些疾病的早期診斷整理課件基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法整理課件直接競爭法檢測可溶性抗原原理：待檢抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合；待檢抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。整理課件優(yōu)點(diǎn)：待檢抗原只需要一個(gè)抗原決定簇，適合小分子抗原，如，激素，藥物等；操作步驟簡單快捷，只需要一個(gè)保溫洗滌過程缺點(diǎn)：酶標(biāo)記抗體用量大；定量檢測的靈敏度和重復(fù)性存在不足。整理課件基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原

雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法整理課件改良雙抗夾心法雙抗體夾心法檢測可溶性抗原雙抗夾心法整理課件優(yōu)點(diǎn)：待測抗原需要≥2個(gè)抗原決定簇，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量5000D以上；由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物就可以建立此法；重復(fù)性較好；缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力整理課件基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法整理課件應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法

（BA-ELISA法）間接包被放大終末反應(yīng)整理課件BA-ELISA原理

BA-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素(B，biotin)與親和素(A，avidin)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。生物素是動植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H；親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親和力；（鏈酶親和素是從鏈霉菌中提取，對載體吸附性比前者低）親和素與生物素都可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結(jié)合而不影響后者的生物活性，是理想的標(biāo)記劑；結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。整理課件實(shí)驗(yàn)材料小鼠INF-γ檢測試劑盒的組成：CaptureAb：purifiedanti-mouseIFN-γDetectionAb：biotin-conjugate-anti-mouseIFN-γAvidin-conjugate-HRPStandard：recombinantmouseIFN-γ（定量測定）Coatingbuffer5×AssaydiluentTMBsolution待測樣品----經(jīng)ConA活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清整理課件ELISA操作要點(diǎn)樣品的保存試劑的準(zhǔn)備固相載體包被加樣孵育(溫育）洗滌顯色和比色整理課件樣本的制備與保存：血清樣品和細(xì)胞培養(yǎng)上清：5天內(nèi)測定，可以放置于4℃，超過一周，-80℃保存；ConA活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清：分別于活化后不同時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)的細(xì)胞，2000rpm，4℃離心分離上清，冰上放置，分裝整理課件試劑的準(zhǔn)備ELISA中用的蒸餾水或者去離子水，包括用于配置coatingbuffer，稀釋Assaybuffer，洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的；從冰箱中取出的試劑應(yīng)該平衡至室溫后使用；試劑最好現(xiàn)配先用整理課件固相載體最常用的是聚苯乙烯：有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能；國際上標(biāo)準(zhǔn)的是微量滴定板8×12的96孔板式；已經(jīng)包被抗原或者抗體的固相載體在低溫（2-8℃）干燥的條件下一般可以保存6個(gè)月。整理課件包被定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過程稱為包被；物理吸附：兩者的疏水基團(tuán)通過疏水鍵的作用抗體或者蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液（即本次實(shí)驗(yàn)用的coatingbuffer）4-8℃包被過夜(有利于蛋白活性的保持），與37℃孵育2小時(shí)被認(rèn)為具有相等的包被效果包被的最適當(dāng)濃度隨著載體和包被物的性質(zhì)和酶結(jié)合物的濃度調(diào)定整理課件封閉定義：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程；目的：抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度比較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量的不相關(guān)蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附；常用封閉液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脫脂奶粉；本實(shí)驗(yàn)用封閉液：1×Assaybuffer。整理課件加樣ELISA中一般有3次加樣步驟，即，加樣本（和/或標(biāo)準(zhǔn)品），加酶結(jié)合物，加底物；加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以濺出,不可以產(chǎn)生氣泡；多道加液器的使用整理課件孵育(溫育）在ELISA中抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫的過程稱為孵育；常用溫度：43℃，37℃，室溫，4℃等孵育時(shí)為了避免蒸發(fā)，可以用塑料封口膠或者保鮮膜封板整理課件洗滌

洗滌在ELISA中雖然不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但決定了實(shí)驗(yàn)的成敗聚苯乙烯等塑料對蛋白的吸附是普遍的，洗滌可以清除在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)洗滌可以清除殘留在板孔中沒有能夠與固相抗原或者抗體結(jié)合的物質(zhì)常加入非離子表面活性劑（含有疏水基團(tuán)+親水基團(tuán)），以抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面，如吐溫20，0.05%的濃度比較合適，濃度＞2%會洗脫包被在板上的抗原或者抗體整理課件洗滌方式：甩干孔內(nèi)的反應(yīng)液浸泡，即將洗滌液注滿板孔(約300μl），靜置3min，浸泡時(shí)間不可以隨意縮短；甩去液體后在吸水紙上拍干重復(fù)操作2，3，洗滌次數(shù)按要求操作整理課件顯色和比色

顯色是ELISA中的最后一步孵育反應(yīng)，此時(shí)，酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物；定量實(shí)驗(yàn)中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)該按規(guī)定力求準(zhǔn)確；定性測定的顯色時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制和及時(shí)判斷；終止反應(yīng)，防止反應(yīng)過度：

TMB受光照影響不大，經(jīng)HRP作用后，40min達(dá)到高峰；終止液有多種，疊氮鈉或SDS等酶抑制劑可以維持藍(lán)色12-24h不褪色；

OPD受光照會自行變色，要避光，經(jīng)HRP作用后，37℃孵育20-30min后顏色即不再加深；常用終止液為2MH2S04；

整理課件HRP的色原底物系統(tǒng)

與HRP反應(yīng)后的顏色加終止液后的顏色讀數(shù)波長特點(diǎn)OPD臨苯二胺492nm致畸，但本底好TMB四甲基聯(lián)苯胺450nm操作方便，本底較高整理課件ELISA數(shù)據(jù)的處理根據(jù)standard的濃度和對應(yīng)的OD值計(jì)算出線性方程將所測定樣品的OD值代入方程計(jì)算出相應(yīng)的樣品的濃度整理課件Protocal包被：用Coatingbuffer

1:1000稀釋CaptureAb，100ul/孔，濕盒4℃過夜；洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，3×3min，控干；封閉：加1×Assaydiluent200ul/孔，37℃避光孵育2h；洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；5.加樣：100ul/孔，37℃避光孵育1h；6.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:用1×Assaydiluent1:1000稀釋detectionAb，100ul/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；9.Avidin-HRP:用1×Assaydiluent

1:250稀釋AV-HRP，100ul/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，5×3min，控干；11.顯色：1×TMBsolution，100ul/孔，37℃孵育1-30min；12.終止反應(yīng)：顯色完全后加2MH2SO450ul/孔，終止顯色反應(yīng)；于450nm處讀取光密度OD值或吸光度A值；13.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析數(shù)據(jù)整理課件2.洗滌

次日，棄去孔內(nèi)液體，用0.05%PBST洗板3次（將PBST加入每孔，靜置3min后傾去），控干，洗去游離抗體。濕盒中，4℃過夜酶標(biāo)板1.包被(NotePBST洗滌液:0.05%Tween-20-PH7.41×PBS)

1×Coatingbuffer1:1000稀釋CaptureAb，

100μl/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜(或保鮮膜等）封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中，4℃過夜。

整理課件

1×Assaydiluent，200μl/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中，37℃避光孵育2h。4.洗滌

棄去孔內(nèi)液體，用0.05%PBST洗板4次，（將PBST加入每孔，靜置3min后傾去）；控干；37℃避光孵育2h3.封閉（Note1×Assaydiluent：用純水將5×Assaydiluent稀釋至1×）

以上助教老師負(fù)責(zé)完成整理課件5.加樣----抗原與抗體孵育

1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

1×Assaydiluent倍比稀釋standard，每個(gè)梯度各取100μl加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；

2）待測樣品：取100μl待測樣品加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；

3）空白對照：取100μl1×Assaydiluent加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；37℃避光孵育1h50ulStandard原液?

?

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1/161/32整理課件待測抗原100μl空白對照陽性對照每組4位同學(xué)的加樣順序：待測抗原100μl待測抗原100μl樣本有4種，每人選一種做復(fù)孔每組做陽參2個(gè)孔每組做空白對照2個(gè)孔（加樣1×Assaybuffer）每孔加樣100μl待測抗原100μl整理課件6.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:

用1×Assaydiluent1:1000稀釋detectionAb，100μl/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；9.Avidin-HRP(HRP見光分解，之后所有步驟避光操作）用1×Assaydiluent

1:250稀釋AV-HRP，100μl/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，5×3min，控干；整理課件11.顯色：