功能化離子液體修飾豬胰脂肪酶的研究,生物化學(xué)論文

功能化離子液體修飾豬胰脂肪酶的研究,生物化學(xué)論文脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)主要是指一類能夠催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶，廣泛應(yīng)用于水解或醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構(gòu)體拆分等有機(jī)合成反響，是當(dāng)前用處最廣泛的酶催化劑之一。豬胰脂肪酶(porcinepancreaslipase，PPL)是一類重要的脂肪酶，在食品、化裝品、醫(yī)藥、洗滌劑和畜牧業(yè)等領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。然而，PPL的應(yīng)用仍然存在一些缺乏，如一般具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的目的化合物并不是它的天然底物;PPL活力不高，在有機(jī)溶劑、高溫、極端pH等非天然環(huán)境下極易失活等，這些不利因素限制了PPL在工業(yè)上進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用。因而，對(duì)PPL進(jìn)行分子改性以強(qiáng)化其催化性能，為工業(yè)應(yīng)用提供活性更高層次、穩(wěn)定性更好、環(huán)境耐受性更強(qiáng)的新酶品種，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?；瘜W(xué)修飾具有便宜、周期短、實(shí)驗(yàn)室可行、容易創(chuàng)造新型的酶學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是對(duì)脂肪酶進(jìn)行分子改性的一種重要手段。固然化學(xué)修飾PPL已經(jīng)獲得了一定的研究進(jìn)展，但仍然局限于脂肪酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇(PEG)和多糖等常用修飾劑的研究，修飾酶的催化活性、穩(wěn)定性、耐有機(jī)溶劑性等性能往往不能同時(shí)得到有效的改善以知足反響的需要。離子液體近年來在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化復(fù)原酶等多種酶都在離子液體中顯示出了很好的穩(wěn)定性。在離子液體中酶催化的區(qū)域、對(duì)映體選擇性往往都有所增加，尤其作為高極性底物的酶催化反響介質(zhì)，離子液體顯示出了宏大的潛力。筆者所在課題組將功能化離子液體作為酶固定化載體材料SBA-15的外表修飾劑，結(jié)果表示清楚修飾載體固定化的酶對(duì)溫度、pH等的穩(wěn)定性得到了有效提升，而且相對(duì)活力較游離酶有了較大提高。在固定化方式方法中，離子液體作為載體修飾劑。最近幾年，Bekhonche等初次提出了離子液體修飾酶的新型化學(xué)修飾方式方法，用含羥基的咪唑、吡咯等離子液體修飾甲酸脫氫酶，修飾酶的活性和穩(wěn)定性得到了顯著提升。這些研究講明離子液體不僅能夠作為反響介質(zhì)用于酶催化反響中，還能夠分別用作固定化載體及酶分子本身的修飾劑，當(dāng)前還沒有其他用功能化離子液體修飾脂肪酶的報(bào)道。本文以PPL為例，希望發(fā)展一種酶分子改造的新方式方法。1材料與方式方法1.1藥品與試劑PPL購自Sigma公司并在0～4℃下保存，酶的蛋白質(zhì)含量為9.3%，以三乙酸甘油酯為底物時(shí)比酶活力為362U/g(45℃、pH7.5)。3種離子液體氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-乙基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-丁基咪唑(99%)購自上海成捷化學(xué)有限公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(98%)、N-羥基琥珀酰亞胺(98%)、嗎啉乙磺酸(97%)購自阿拉丁試劑公司。其余試劑購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。1.2離子液體的活化取0.001mol的離子液體，參加0.0012mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺及0.1115molN-羥基琥珀酰亞胺，在5mL的嗎啉乙磺酸溶液中，室溫?cái)嚢璺错?h后停止。1.3活化的離子液體修飾PPL取2gPPL用去離子水溶解，向酶溶液中緩慢參加活化的離子液體，在0～4℃下，磁力攪拌6h后，在去離子水中透析24h備用。修飾度的測(cè)量通過三硝基苯磺酸法才測(cè)定。1.4蛋白質(zhì)含量測(cè)定根據(jù)Bradford的方式方法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定酶液的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。1.5酶活的測(cè)定1)三乙酸甘油酯乳化液的制備將6.83g三乙酸甘油酯在強(qiáng)力攪動(dòng)下緩慢參加磷酸緩沖液(pH7.0)，得到三乙酸甘油酯乳化液，再參加磷酸鹽緩沖液定容至100mL。2)酶活測(cè)定取10mL上述制備的三乙酸甘油酯乳化液于100mL錐形瓶中，再參加15mL磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，于50℃、150r/min下預(yù)熱5min，然后向華而不實(shí)參加酶開場(chǎng)反響。反響10min后取出，立即參加15mL乙醇終止反響。用0.025mol/L的NaOH溶液滴定，記錄NaOH的消耗量。在一定條件下，每分鐘酶催化三乙酸甘油酯生成1mol乙酸所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活單位(U)。1.6最適溫度及最適pH的檢測(cè)1)最適溫度調(diào)節(jié)反響緩沖液pH為7.0，分別在30、35、40、45、50、55、60和65℃下水浴反響10min，取出測(cè)定酶活。2)最適pH調(diào)節(jié)反響液的pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，50℃下水浴反響10min，取出測(cè)定酶活。1.7酶的熱穩(wěn)定性將酶置于50℃水浴中保溫，分別在0、0.5、1、2、4、6和8h取出，冷卻至室溫，再測(cè)定酶活。酶活測(cè)定方式方法同1.5。設(shè)保溫0h時(shí)的游離酶的初始酶活為100%。1.8有機(jī)溶劑耐受性在酶活測(cè)定的反響體系中，參加不同濃度的有機(jī)溶劑，測(cè)定修飾前后PPL在有機(jī)溶劑中的催化穩(wěn)定性，設(shè)不含有機(jī)溶劑體系游離酶的初始酶活為100%。1.9紫外光譜測(cè)定室溫下，取一樣濃度的PPL、PPL-M、PPL-E和PPL-B在紫外可見分光光度計(jì)上分別測(cè)定其紫外可見吸收光譜，測(cè)定范圍為240～340nm。2結(jié)果與討論2.1水解活力的考察表1為經(jīng)修飾后的酶與PPL的表觀比酶活力的數(shù)據(jù)?！颈?】由表1可知:豬胰脂肪酶在經(jīng)過修飾之后，活力有明顯的提高，講明離子液體修飾脂肪酶的方式方法有利于水解活力的提高。華而不實(shí)離子液體修飾的酶，隨著修飾度的增加活力增大，含短鏈的修飾有更好的水解活力，是游離酶的1.74倍，而鄰苯二甲酸酐對(duì)PPL的修飾只提高了25%的水解活力。隨著修飾劑的鏈長(zhǎng)的增大，活力呈降低的趨勢(shì)。2.2最適溫度的考察根據(jù)經(jīng)典酸堿滴定的方式方法，在不同溫度下考察酶水解三乙酸甘油酯特性，結(jié)果見圖1。由圖1可知:原酶最適反響溫度為45℃左右;經(jīng)離子液體修飾后，PPL的最適溫度向高溫方向移動(dòng)至55℃。與PPL相比，修飾后的PPL對(duì)溫度的適應(yīng)范圍更廣?！緢D1】經(jīng)過修飾后的酶對(duì)在高溫區(qū)相對(duì)游離酶愈加趨于平緩，該點(diǎn)證明酶的離子液體修飾有助于提高溫度的耐受性。2.3最適pH的考察在不同pH條件下考察豬胰脂肪酶的三乙酸甘油酯水解特性，結(jié)果如此圖2所示。由圖2可知:修飾酶及游離酶的最適反響pH均為7.5，修飾的PPL在6.0～8.0之間對(duì)pH的敏感度明顯降低，離子液體的修飾拓寬了酶的使用范圍?！緢D2】2.4熱穩(wěn)定性的考察熱穩(wěn)定性是酶催化工業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)重要因素。圖3為酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖3可知:游離酶的熱穩(wěn)定性較差，酶活下降快。在保溫2h后，酶活僅為初始酶活的20%。PPL-M、PPL-E及PPL-B的熱穩(wěn)定性均顯著提高;在保溫8h后，殘存余留酶活仍然保持在游離酶初始酶活的60%以上，尤其是長(zhǎng)鏈的離子液體修飾的酶，酶活降低的更緩慢，熱穩(wěn)定性更好?！緢D3】2.5有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響2.5.1甲醇對(duì)酶活的影響在pH7.5、30℃不同甲醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，測(cè)定PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的活力變化，結(jié)果見圖4。由圖4可知:反響體系中參加不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇時(shí)，游離酶的相對(duì)活力一直在降低。而3種修飾酶的活力則是先升高，在高濃度的含甲醇體系中會(huì)下降，這可能是修飾后的酶在低濃度的甲醇中仍能維持構(gòu)象穩(wěn)定，而高濃度的甲醇會(huì)毀壞部分氫鍵進(jìn)而造成酶的解折疊。3種酶的變化趨勢(shì)比擬一致，且普遍高于PPL，3種修飾酶的活力大小順序(從大到小)為PPL-M、PPL-E、PPL-B，但PPL-B的活力在含低濃度的甲醇中增加幅度高于其他2種修飾酶，在含高濃度的甲醇中的活力降低程度要低于其余2種修飾酶?！緢D4】2.5.2N，N-二甲基甲酰胺(DMF)對(duì)酶活的影響在pH7.5、30℃不同DMF體積分?jǐn)?shù)的條件下，測(cè)定PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的活力變化，結(jié)果見圖5。由圖5可知:在反響體系中參加不同體積分?jǐn)?shù)的DMF時(shí)，游離酶的活力一直在降低，而修飾酶均保持了較高的活力，在反響體系中存在80%的DMF時(shí)，3種修飾酶的活力仍然保持游離酶100%的相對(duì)活力以上。3種修飾酶在不同濃度的DMF的反響體系中，酶活變化趨勢(shì)一致，修飾酶的水解活性均高于原酶PPL。在含低濃度DMF中，PPL-M的酶活高于其他2種修飾酶，在DMF濃度不斷增加中，PPL-B的活力受影響程度最弱，在70%以上的DMF體積分?jǐn)?shù)中活力下降比例低于其他2種修飾酶，PPL修飾后的耐DMF的性能明顯提高?！緢D5】2.6紫外光譜表征圖6為脂肪酶PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的紫外光譜變化圖。由圖6可知:PPL經(jīng)離子液體修飾后，紫外吸收光譜峰型未發(fā)生明顯變化，講明修飾后對(duì)PPL的空間構(gòu)造沒有造成明顯的影響，但原270nm處的吸收峰發(fā)生稍微紅移，PPL-M、PPL-E及PPL-B的最大吸收波長(zhǎng)值分別為271、272及275nm，修飾酶的紫外吸光值均有所提高?！緢D6】3結(jié)論以3種陰離子的咪唑類離子液體對(duì)PPL進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾后的PPL水解活力明顯提升，修飾度越高，水解活力越高，且隨著修飾劑的鏈長(zhǎng)的增大，活力呈降低的趨勢(shì)。與原酶相比，修飾酶的熱穩(wěn)定、有機(jī)溶劑中的催化性能等酶學(xué)性質(zhì)都得到了提高。以下為參考文獻(xiàn):［1］HasanF，ShahAA，HameedA．Industrialapplicationsofmicrobiallipases［J］．EnzymeMicrobTechnol，2006，39(2):235-251．［2］YangJK，GuoDY，YanYJ．Cloningexpressionandc