基因工程和基因組學(xué)2

基因工程和基因組學(xué)2第1頁/共72頁2/74

基因工程概述★遺傳工程廣義狹義：細胞工程、染色體工程、細胞器工程等基因工程第2頁/共72頁3/74★1、概念：

是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。

基因工程概述也稱為DNA重組技術(shù)(DNARecombination)、或分子克隆(Molecularcloning)第3頁/共72頁4/74基因工程的基本操作程序包括：(1)目的基因的分離或合成；(2)用工具酶對目的基因和載體（Vector）進行加工處理，把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子；(3)把重組DNA分子引入受體細胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達；（4）轉(zhuǎn)化體細胞的擴增；（5）重組體細胞的鑒定與篩選。第4頁/共72頁5/74★2、誕生：

1971年，美國Smith,H.O.

等分離出一種限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；

1972年：Ｂerg,P.

等實現(xiàn)不同酶切DNA片段的體外連接；

1973年：Cohen,s.等將體外重組的DNA

轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞并得以表達。

基因工程概述第5頁/共72頁6/741973Cohen第一例成功的克隆實驗1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物1982第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

1993基因工程西紅柿在美國上市1997英國羅斯林研究所多莉羊1999.9中國獲準加入人類基因組計劃.負責(zé)測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程第6頁/共72頁7/74★３、基本過程：

基因工程概述⑴從供體細胞中分離出目的基因；(簡稱“切”)⑵用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子(“接”)；⑶借助細胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細胞(“轉(zhuǎn)”)；第7頁/共72頁8/74★３、基本過程：

基因工程概述⑷培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，以擴增DNA重組分子，使其整合到受體細胞的基因組中（“增”）；⑸鑒定轉(zhuǎn)化細胞，獲得外源基因高效表達的細胞（“檢”）；由此可見，基因工程的操作過程可簡化為：“切、接、轉(zhuǎn)、增、檢”第8頁/共72頁9/74基因克隆示意圖第9頁/共72頁10/74二限制性內(nèi)切核酸酶

★限制性內(nèi)切核酸酶或限制性酶：

(restrictionenzymes)

在細菌中此酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。該類能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并將雙鏈DNA分子切斷。第10頁/共72頁11/74工具酶常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第11頁/共72頁12/741限制性內(nèi)切核酸酶

★限制性酶據(jù)其作用特點，可分為兩類。

⑴第Ⅰ類限制性酶：每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈

DNA分子，沒有序列特異性。

⑵第Ⅱ類限制性酶：能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。其識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種序列稱為回紋對稱序列(palindrome)。第12頁/共72頁13/74第13頁/共72頁14/74第14頁/共72頁15/74第15頁/共72頁16/74第16頁/共72頁17/742DNA聚合酶DNA聚合酶的主要作用是在體外大量合成目的基因第17頁/共72頁18/743、DNA連接酶在大腸桿菌和動物細胞中都發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，這種酶能夠催化DNA中相鄰的

3’一OH和5’一磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵。4、逆轉(zhuǎn)錄酶

RNADNA第18頁/共72頁19/74三載體

一個DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(hostcell)，并在其中復(fù)制、擴增、克隆出多個拷貝。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。第19頁/共72頁20/74三載體

★作為載體DNA分子，需具備四個條件：⑴具復(fù)制原點(ori)，

能攜帶的外源DNA片段獨立地自我復(fù)制；⑵具有多克隆位點，即具有多種限制性酶的切點，用于克隆外源DNA片段；⑶至少具有一個選擇標(biāo)記基因；⑷易從宿主細胞中回收。

第20頁/共72頁21/741.細菌質(zhì)?！糍|(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子?！钸@些質(zhì)粒的適應(yīng)范圍廣，拷貝數(shù)多。進入宿主細胞復(fù)制后，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù)可高達1000個。第21頁/共72頁22/742.λ噬菌體

第22頁/共72頁23/743.柯斯質(zhì)粒

第23頁/共72頁24/744.穿梭載體

第24頁/共72頁25/745.細菌人工染色體

第25頁/共72頁26/746.酵母人工染色體第26頁/共72頁27/747.Ti質(zhì)粒及其衍生載體

第27頁/共72頁28/744.1目的基因的獲得4.2目的基因和載體的連接4.3重組DNA導(dǎo)入受體菌4.4篩選轉(zhuǎn)化子4.5克隆基因的表達4重組DNA技術(shù)基本原理第28頁/共72頁29/744.1目的基因的獲取目的基因的獲取大概有以下途徑：1化學(xué)合成法如已知目的基因的核酸序列，則可以利用化學(xué)合成法進行人工合成。2基因組DNA可以從基因文庫中篩選出目的基因。第29頁/共72頁30/743cDNA法通過提取mRNA，然后進行反轉(zhuǎn)錄得到目的基因。4PCR法用特異的引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)來擴增目的基因。第30頁/共72頁31/74PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右第31頁/共72頁32/74PCR操作流程90

0C500C700C第32頁/共72頁33/74PCR的三個步驟為一次循環(huán)，約需5－10分鐘。每經(jīng)一次循環(huán)，所找到的目的基因擴充一倍。經(jīng)過20次循環(huán)，即可擴增

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倍，總共只需幾個小時。第33頁/共72頁34/744.2目的基因和載體的連接外源基因離開染色體是不能復(fù)制的。如果將外源基因連到復(fù)制子上，外源基因則可作為復(fù)制子的一部分進行復(fù)制。這種復(fù)制子就是載體。載體可分為復(fù)制載體和表達載體。表達載體是將外源基因在寄主細胞內(nèi)表達成蛋白質(zhì)的載體。作為表達載體必須具有強的啟動子和終止子，而且啟動子必須是受控制的，所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號。第34頁/共72頁35/74選擇了載體后，就要將載體和目的基因在體外進行連接，即DNA的體外重組。DNA的體外重組是依靠連接酶在體外將連接。第35頁/共72頁36/744.3重組DNA導(dǎo)入受體菌外源DNA與載體在體外連接成重組的DNA分子后，需要將其導(dǎo)入受體菌。隨著受體菌生長、增殖，重組DNA分子得以復(fù)制、擴增、表達。在選擇了適當(dāng)?shù)氖荏w菌后，經(jīng)過特殊的方法處理后，使之成為感受態(tài)細胞，具備接納外源DNA的能力。感受態(tài)的細胞制備有氯化鈣法、電擊發(fā)等。第36頁/共72頁37/74第37頁/共72頁38/744.4重組體的篩選篩選就是將眾多的轉(zhuǎn)化菌落和菌斑區(qū)分開來，并鑒定那一個菌落或菌斑所含的重組DNA帶有目的基因。第38頁/共72頁39/74篩選的方法有以下種：第39頁/共72頁40/74常用的方法有以下幾種：1遺傳檢測法：如果載體攜帶有某些抗藥性標(biāo)志基因，轉(zhuǎn)化后，只有含有這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含有該抗生素的培養(yǎng)板上生存并且形成菌落?？顾幮裕阂陨蟽煞N方法僅僅是初步篩選。插入失活：載體一般含有多克隆位點，在沒有外源DNA插入時該基因可正確表達，當(dāng)外源基因插入時該基因就不能正確表達。這就是插入失活。第40頁/共72頁41/742重組質(zhì)粒的快速提取和酶切鑒定3PCR法如果質(zhì)粒中重組有外源基因，則可以先快速提取少量質(zhì)粒進行酶切，然后通過電泳法檢查是否含有目的基因片段?？商崛≠|(zhì)粒，用特異的引物進行擴增，如能擴增出目的基因片段，則證明目的基因已重組入質(zhì)粒。第41頁/共72頁42/744.5克隆基因的表達重組DNA技術(shù)的目的是為了擴增目的基因并且使目的基因表達，實現(xiàn)生命科學(xué)研究、醫(yī)藥或商業(yè)目的?？寺』蛟谑荏w細胞表達或大量生產(chǎn)涉及正確的基因轉(zhuǎn)錄、mRNA的翻譯以及后加工等問題。這些過程的進行在不同的表達體系是不一樣的，這些差別不但與基因的來源、性質(zhì)有關(guān)，而且與載體和表達體系有關(guān)。第42頁/共72頁43/74常用的表達體系有原核表達體系和真核表達體系。大腸桿菌是當(dāng)前采用最多的原核表達體系。真核表達體系有酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等。第43頁/共72頁44/74第44頁/共72頁45/74第45頁/共72頁46/74第46頁/共72頁47/74第47頁/共72頁48/74第48頁/共72頁49/74五基因工程的應(yīng)用

(一)基因工程工業(yè)(二)植物基因工程(三)轉(zhuǎn)基因動物(四)遺傳疾病診斷第49頁/共72頁50/74(一)基因工程藥物◆胰島素的人工生產(chǎn)第50頁/共72頁51/74(二)植物基因工程根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化◆植物基因轉(zhuǎn)化：是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達的過程?！舾┺r(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化第51頁/共72頁52/742.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)◆通過高壓氣體等動力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒，將目的基因直接導(dǎo)入受體細胞，并整合到染色體上的方法?！舸朔ㄒ褟V泛用于轉(zhuǎn)化水稻、小麥、玉米、大豆等主要作物。第52頁/共72頁53/74(三)轉(zhuǎn)基因動物

與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展要慢些。

◆例如，利用轉(zhuǎn)基因羊大量表達人類的抗胰蛋白酶?！魧⑷说目挂鹊鞍酌甫?1基因克隆在羊奶產(chǎn)生相關(guān)基因啟動子的下游，這種啟動子僅在乳腺細胞中表達，使羊奶中含有大量有功能的人類抗胰蛋白酶；◆可利用家禽作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)人類大量需要的重要蛋白質(zhì)。大象的生長基因轉(zhuǎn)到豬身上第53頁/共72頁54/74(四)遺傳疾病診斷第54頁/共72頁55/74(五)基因治療◆利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系骄哂羞z傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病的方法，通常叫做基因治療(genetherapy)。◆目前最常用的方法是利用病毒DNA作載體，構(gòu)建重組DNA分子，用病毒包裝物包裝后形成的重組去毒病毒感染患者的細胞，將正?；蛘系饺旧w上。第55頁/共72頁56/74第二節(jié)基因組學(xué)

◆基因組學(xué)(genomics)：是遺傳學(xué)研究進入分子水平后發(fā)展起來的一個分支，主要研究生物體全基因組(genome)的分子特征?！籼攸c：是以基因組為研究單位，而不是以單個基因，◆目標(biāo)：是認識基因組的結(jié)構(gòu)、功能及進化，弄清基因組包含的全部遺傳信息及相互關(guān)系，為最終充分合理利用各種有效資源，預(yù)防和治療人類遺傳疾病提供科學(xué)依據(jù)。第56頁/共72頁57/74第57頁/共72頁58/74㈠構(gòu)建基因組的遺傳圖譜

(geneticmap)；㈡構(gòu)建基因組的物理圖譜

(physicalmap)；㈢測定基因組DNA的全部序列；㈣構(gòu)建基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；㈤分析基因組的功能。

基因組學(xué)的重要組成部分是基因組計劃(genomeproject)，大體上可分為：第58頁/共72頁59/74◆人類基因組計劃(humangenomeproject，HGP)：◆水稻基因組計劃(ricegenomeproject，RGP)◆模式生物基因組計劃：如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥第59頁/共72頁60/74一基因組圖譜的構(gòu)建鳥槍射擊法(shotgun)基因組序列測定第60頁/共72頁61/74㈠遺傳圖譜的構(gòu)建㈡物理圖譜的構(gòu)建一基因組圖譜的構(gòu)建

第61頁/共72頁62/74(一)遺傳圖譜的構(gòu)建

圖譜標(biāo)記圖譜構(gòu)建中需要可以鑒別的標(biāo)記(marker)，在構(gòu)建遺傳圖譜中，可用基因和DNA作為標(biāo)記。(1)基因標(biāo)記

(2)DNA標(biāo)記第62頁/共72頁63/