天然產(chǎn)物提取分離

天然產(chǎn)物提取分離第1頁(yè)/共119頁(yè)一、基本概念1、提取：利用適當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過(guò)程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開(kāi)，并將得到的單體加以精制的過(guò)程。

第一節(jié)天然產(chǎn)物的提取第2頁(yè)/共119頁(yè)

水親水性有機(jī)溶劑親脂性有機(jī)溶劑二、提取方法超臨界流體萃取法（SFE）水蒸氣蒸餾法溶劑提取法升華法壓榨法溶劑第3頁(yè)/共119頁(yè)（一）溶劑提取法根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對(duì)所需成分溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來(lái)的一種提取方法。

第4頁(yè)/共119頁(yè)

溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物體細(xì)胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過(guò)程。包括浸潤(rùn)、解吸和擴(kuò)散三個(gè)階段。1、溶劑提取法的原理選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。第5頁(yè)/共119頁(yè)

浸潤(rùn)：滲透階段溶劑通過(guò)細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。解吸：溶解階段細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和力，溶劑破除這種親和力。擴(kuò)散：置換階段利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來(lái)，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而將內(nèi)容物置換出來(lái)。第6頁(yè)/共119頁(yè)

擴(kuò)散過(guò)程表達(dá)式：dt:擴(kuò)散時(shí)間F：擴(kuò)散面積，以粉碎度表示濃度差D：擴(kuò)散系數(shù)ds:在dt時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)散量第7頁(yè)/共119頁(yè)2、選擇溶劑的要點(diǎn)*對(duì)所要成分溶解度大*沸點(diǎn)適中容易回收*低毒安全*廉價(jià)天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。最常用的溶劑為乙醇。第8頁(yè)/共119頁(yè)3、溶劑的分類(lèi)*強(qiáng)極性溶劑：水*親水性有機(jī)溶劑：能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機(jī)溶劑：不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）常用溶劑的極性大小順序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水第9頁(yè)/共119頁(yè)4、化合物的結(jié)構(gòu)與親水性、親脂性的關(guān)系（1）分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)（羧基、羥基、氨基）越多，極性越大，親水性越強(qiáng)，反之則親脂性越強(qiáng)。（2）分子中非極性部分越大，碳鏈越長(zhǎng)或結(jié)構(gòu)越大，則親脂性越強(qiáng)。（3）結(jié)構(gòu)母核相同的成分，分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個(gè)分子的極性越大，親水性越強(qiáng)，親脂性越弱。第10頁(yè)/共119頁(yè)5、溶劑的選擇

(1)水：為價(jià)廉、易得、使用安全的強(qiáng)極性溶劑。適于提取無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽、苷類(lèi)等。(2)親水性有機(jī)溶劑：以乙醇最常用。高濃度提取親脂性成分，低濃度提取親水性成分。(3)

親脂性有機(jī)溶劑：具有較強(qiáng)的選擇性，對(duì)揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹(shù)脂、內(nèi)酯、某些生物堿及一些苷元均可提取出來(lái)。優(yōu)缺點(diǎn)：沸點(diǎn)低，濃縮回收方便，但易燃、有毒、價(jià)貴，穿透力差。第11頁(yè)/共119頁(yè)6、溶劑提取的方法溶劑提取的方法連續(xù)回流提取法回流提取法煎煮法（煎中藥）滲漉法浸漬法（泡藥酒）第12頁(yè)/共119頁(yè)

以水或稀醇反復(fù)提取，適于遇熱易破壞或揮發(fā)性成分及含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料。（1）浸漬法

民間的藥酒浸制。第13頁(yè)/共119頁(yè)

（2）滲漉法

以稀乙醇或酸、水作溶劑，先浸后滲，提取效率高于浸漬法。但溶劑用量大，對(duì)原料粒度要求高。實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)單滲漉裝置第14頁(yè)/共119頁(yè)

（3）煎煮法

以水為溶劑，對(duì)遇熱易破壞和揮發(fā)性成分有影響，對(duì)含多量淀粉、黏液質(zhì)的原料也不適用。

傳統(tǒng)的中藥煎制。第15頁(yè)/共119頁(yè)

（4）回流提取法使用有機(jī)溶劑。對(duì)遇熱易破壞的成分有影響。第16頁(yè)/共119頁(yè)

（5）連續(xù)回流提取法索式提取器的組成

循環(huán)使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，在脂肪提取器中連續(xù)提取的方法。提取效率高，節(jié)省溶劑。但不適于熱不穩(wěn)定成分的提取。

也可采用混合溶劑，常用的有水和乙醇。不同比例的溶劑可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5) 可提取出強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、葉綠素等。第17頁(yè)/共119頁(yè)

第18頁(yè)/共119頁(yè)索式提取器連續(xù)回流提取

萃取瓶（圓底燒瓶）冷凝管脂肪提取器濾紙筒虹吸管蒸汽管第19頁(yè)/共119頁(yè)

①.把濾紙做成與提取器大小相應(yīng)的濾紙筒，然后把需要提取的樣品放入濾紙筒內(nèi)，裝入提取器。注意:a.濾紙筒既要緊貼器壁，又要方便取放。（濾紙筒上可以套一圈棉線(xiàn)，方便提取完成后取出濾紙筒。）b.被提取物高度不能超過(guò)虹吸管，否則被提取物不能被溶劑充分浸泡，影響提取效果。被提取物亦不能漏出濾紙筒，以免堵塞虹吸管。如果試樣較輕，可以用脫脂棉壓住試樣。

操作步驟：

第20頁(yè)/共119頁(yè)

②.在提取用的燒瓶中加入提取溶劑和沸石（沒(méi)有沸石可以用玻璃珠或碎瓷片，目的就是防止暴沸）。③.連接好燒瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水,加熱。沸騰后，溶劑的蒸氣從燒瓶進(jìn)到冷凝管中，冷凝后的溶劑回流到濾紙筒中，浸取樣品。溶劑在提取器內(nèi)到達(dá)一定的高度時(shí)，就攜帶所提取的物質(zhì)一同從側(cè)面的虹吸管流入燒瓶中。溶劑就這樣在儀器內(nèi)循環(huán)流動(dòng)，把所要提取的物質(zhì)集中到下面的燒瓶?jī)?nèi)。第21頁(yè)/共119頁(yè)

具體的回流時(shí)間是不一樣的，有的是按文獻(xiàn)要求提取一定時(shí)間，有的是提取至提取液無(wú)色，又比如用乙醚提取樣品中的脂肪時(shí)是以抽提管中流出的乙醚揮發(fā)后不留下油跡為抽提終點(diǎn)?？傊褪且崛⊥耆珵橹埂５?2頁(yè)/共119頁(yè)

7、影響溶劑提取法的因素（1）生物材料的粉碎度

材料細(xì)，面積大，擴(kuò)散快，效果好。但是太細(xì)，吸附作用大，易糊化，擴(kuò)散慢，同時(shí)植物細(xì)胞也會(huì)遭受破壞，大量蛋白質(zhì)、淀粉被提出，產(chǎn)生沉淀或膠束狀，影響提取。花、葉可適當(dāng)粗些，皮、莖、根宜細(xì)些。第23頁(yè)/共119頁(yè)

（2）提取溫度

一般使用常溫，在不破壞有效成分的條件下加熱不要超過(guò)80?C。

溫度低提取時(shí)的雜質(zhì)少，溫度高時(shí)提取效率高；但含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料，水提時(shí)避免熱提。第24頁(yè)/共119頁(yè)

（3）提取時(shí)間

以提完為準(zhǔn)，是否完全可以提取也做定性實(shí)驗(yàn)，或薄層層析檢測(cè)，或以液體顏色判斷。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定是否需要延長(zhǎng)提取時(shí)間。第25頁(yè)/共119頁(yè)

（4）濃度差

根據(jù)擴(kuò)散原理，造成提取液的濃度差可以提高提取的效率。

可采取的措施有：攪拌、更換溶劑。第26頁(yè)/共119頁(yè)

（5）新技術(shù)的使用

超聲波、微波促提技術(shù)的應(yīng)用，可以加快提取速度，提高提取效率。

目前實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的超聲波萃取儀是將超聲波換能器產(chǎn)生的超聲波通過(guò)介質(zhì)（通常是水）傳遞并作用于樣品，這是一種間接的作用方式，聲振強(qiáng)度較低，必須通過(guò)增加超聲波發(fā)生器功率（3300W）來(lái)提高萃取效率。但較大的超聲波功率，又會(huì)發(fā)出令人感覺(jué)不適的噪音。

超聲波促提原理：第27頁(yè)/共119頁(yè)

為物理過(guò)程，無(wú)化學(xué)反應(yīng)，不改變生物活性，高能量的超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力，可造成植物細(xì)胞壁及生物體破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散、溶解。實(shí)驗(yàn)室用小型超聲儀工業(yè)生產(chǎn)用超聲儀第28頁(yè)/共119頁(yè)

微波輔助技術(shù)是利用樣品中目標(biāo)物分子在微波電磁場(chǎng)的作用下，從原來(lái)的熱運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為跟隨微波交變電磁場(chǎng)而快速排列取向，將微波能量轉(zhuǎn)化為樣品內(nèi)的能量，從而加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑相的過(guò)程。微波促提原理：第29頁(yè)/共119頁(yè)

具有穿透力強(qiáng)，加熱效率高，操作簡(jiǎn)便、快速、節(jié)能、高效等特點(diǎn)。缺點(diǎn)：化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，繼而導(dǎo)致生物活性的改變。

微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物質(zhì)的穩(wěn)定性。工業(yè)生產(chǎn)用微波提取罐第30頁(yè)/共119頁(yè)

（二）水蒸氣蒸餾法

適于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的有效成分結(jié)構(gòu)的提取。如揮發(fā)油、小分子生物堿、酚類(lèi)、游離醌類(lèi)等。

水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入不溶或難溶于水但有一定揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì)中，使該有機(jī)物在低于100℃

的溫度下，隨著水蒸氣一起蒸餾出來(lái)。原理：道爾頓分壓定律第31頁(yè)/共119頁(yè)

水蒸氣蒸餾裝置

常用的水蒸氣蒸餾裝置，包括水蒸氣發(fā)生器、蒸餾、冷凝和接受器四個(gè)部分。第32頁(yè)/共119頁(yè)

磨口玻璃裝置第33頁(yè)/共119頁(yè)

在實(shí)驗(yàn)上較為方便，常用于微量實(shí)驗(yàn)。操作時(shí)將盛有被蒸餾物的燒瓶中加入適量蒸餾水，加熱至沸以便產(chǎn)生蒸氣，水蒸氣與被蒸餾物一起蒸出。對(duì)于揮發(fā)性液體和數(shù)量較少的物料，此法非常適用。水蒸氣蒸餾的方法分為直接法和間接法兩種。直接法第34頁(yè)/共119頁(yè)

常量實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的方法，其操作相對(duì)比較復(fù)雜，需要安裝水蒸氣發(fā)生器。圖中A是水蒸氣發(fā)生器，一般使用厚壁玻璃瓶，也可使用金屬制成的水蒸氣發(fā)生器，安全玻璃管B幾乎插到發(fā)生器A的底部。當(dāng)容器內(nèi)氣壓太大時(shí)，水可沿著玻璃管上升，以調(diào)節(jié)內(nèi)壓。間接法第35頁(yè)/共119頁(yè)

蒸餾部分可用三口燒瓶，瓶?jī)?nèi)液體不宜超過(guò)其容積的1/3。蒸氣導(dǎo)入管E的末端正對(duì)瓶底中央并伸到接近瓶底2～3mm處。餾液通過(guò)接液管進(jìn)入接收器，接收器外圍可用冷水浴冷卻。第36頁(yè)/共119頁(yè)

水蒸氣發(fā)生器與盛物的圓底燒瓶之間應(yīng)裝上一個(gè)T形管C。在T形管下端連一個(gè)帶螺旋夾的膠管或兩通活塞D，以便及時(shí)除去冷凝下來(lái)的水滴，應(yīng)盡量縮短水蒸氣發(fā)生器與圓底燒瓶之間距離，以減少水氣的冷凝。第37頁(yè)/共119頁(yè)

進(jìn)行水蒸氣蒸餾時(shí)，先將被蒸溶液置于三頸瓶中，加熱水蒸氣發(fā)生器A，直至接近沸騰后再關(guān)閉兩通活塞，使水蒸氣均勻地進(jìn)入圓底燒瓶。為了使蒸氣不致在D中冷凝而積聚過(guò)多，必要時(shí)可在F下置一石棉網(wǎng)，用小火加熱。必須控制加熱速度，使蒸氣能全部在冷凝管中冷凝下來(lái)。第38頁(yè)/共119頁(yè)

如果隨水蒸氣揮發(fā)的物質(zhì)具有較高的熔點(diǎn)，在冷凝后易析出固體，則應(yīng)調(diào)小冷凝水的流速，使它冷凝后仍然保持液態(tài)。假如已有固體析出，并且接近阻塞時(shí)，可暫時(shí)停止冷凝水或?qū)⒗淠畷簳r(shí)放去，以使物質(zhì)熔融后隨水流入接收器中。當(dāng)冷凝管夾套中要重新通入冷卻水時(shí)，要小心而緩慢，以免冷凝管因驟冷而破裂。萬(wàn)一冷凝管已被阻塞，應(yīng)立即停止蒸餾，并設(shè)法疏通（可用玻棒將阻塞的晶體捅出或用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹化結(jié)晶，也可在冷凝管夾套中灌以熱水使之熔化后流出來(lái)）。

第39頁(yè)/共119頁(yè)

在蒸餾需要中斷或蒸餾完畢后，一定要先打開(kāi)螺旋夾使通大氣，然后方可停止加熱，否則蒸餾瓶中的液體將會(huì)倒吸到A中。在蒸餾過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)安全管B中的水位迅速上升，則表示系統(tǒng)中發(fā)生了堵塞。此時(shí)應(yīng)立即打開(kāi)活塞，然后移去熱源。待排除了堵塞后再繼續(xù)進(jìn)行水蒸氣蒸餾。第40頁(yè)/共119頁(yè)

最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。分子的極性、沸點(diǎn)和分子量的大小與其在二氧化碳超臨界流體中的溶解性密切相關(guān)。（三）超臨界流體萃取法

超臨界二氧化碳流體(SFE-CO2)臨界點(diǎn)(31.1℃)相當(dāng)接近室溫第41頁(yè)/共119頁(yè)

利用超臨界條件下流體的特殊性能對(duì)樣品進(jìn)行提取，是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來(lái)的一種提取方法。

超臨界流體不但具有與液體接近的密度，有很強(qiáng)的穿透性，接近或超過(guò)溶劑的提取效率；而且具有與氣體相近的擴(kuò)散的性能，提取效率越高。常用的超臨界流體有CO2、乙烷、丙烷等。第42頁(yè)/共119頁(yè)

與普通有機(jī)溶劑提取法相比，超臨界CO2萃取技術(shù)具有無(wú)毒、常溫、不易燃、無(wú)污染等特點(diǎn)，可確保原有的色、香、味不因受熱破壞；更為可貴的是在萃取過(guò)程中可同時(shí)對(duì)萃取物進(jìn)行分離純化。該技術(shù)適宜于萃取高價(jià)值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、內(nèi)酯等極性較低的天然產(chǎn)物有效成分。

超臨界CO2提取的特點(diǎn)。第43頁(yè)/共119頁(yè)

CO2

鋼瓶

冷溫槽

高壓泵恒溫箱

控溫面板

接受瓶

流量計(jì)

CO2

原料

玻璃珠

脫脂棉

萃取柱

超臨界CO2

萃取實(shí)驗(yàn)裝置示意圖第44頁(yè)/共119頁(yè)

液體CO2由高壓泵加壓到萃取工藝要求的壓力并傳送到換熱器，將CO2流體加溫到萃取工藝所需溫度后進(jìn)入萃取器，在此完成萃取過(guò)程。負(fù)載溶質(zhì)的CO2流體在分離器中改變溫度壓力，溶解度降低使萃取物得以分離。分離萃取物后的CO2流體再經(jīng)換熱器液化后回到儲(chǔ)罐中循環(huán)使用。超臨界CO2提取操作流程第45頁(yè)/共119頁(yè)

20世紀(jì)50年代初進(jìn)入試驗(yàn)階段，如從石油中脫瀝青。

70、80年代SFE用于食品香料的提取。

90年代從植物藥中提取目標(biāo)成分，如從蛇床子、桑白皮、茵陳蒿中提取活性成分。第46頁(yè)/共119頁(yè)

（四）升華法

將固體物質(zhì)受熱氣化，遇冷又凝結(jié)為固體的方法。樟木中的樟腦，茶葉中的咖啡因的提取。2-莰酮咖啡因第47頁(yè)/共119頁(yè)

1、將茶葉與95%乙醇回流2h；2、濾出茶葉，濃縮提取液至適當(dāng)體積；3、濃縮液與生石灰粉混合，攪成漿狀，用蒸發(fā)皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸發(fā)皿上蓋一張刺孔向上的濾紙，再在濾紙上罩一個(gè)大小適合且頸部塞有棉花的漏斗；5、用酒精燈隔石棉網(wǎng)加熱，適當(dāng)控制溫度，白色咖啡因在濾紙上結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)室提取咖啡因步驟：第48頁(yè)/共119頁(yè)

第49頁(yè)/共119頁(yè)升華第50頁(yè)/共119頁(yè)

借助機(jī)械外力的作用，將油脂從榨料中擠壓出來(lái)的過(guò)程。在壓榨過(guò)程中，主要發(fā)生的是物理變化，如物料變形、油脂分離、摩擦發(fā)熱、水分蒸發(fā)等。但由于溫度、水分、微生物等的影響，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生某些生物化學(xué)方面的變化，如蛋白質(zhì)變性、酶的鈍化和破壞、某些物質(zhì)的結(jié)合等。壓榨時(shí)，榨料粒子在壓力作用下內(nèi)外表面相互擠緊，致使其液體部分和凝膠部分分別產(chǎn)生兩個(gè)不同過(guò)程，即油脂從榨料空隙中被擠壓出來(lái)及榨料粒子變形形成堅(jiān)硬的油餅。（五）壓榨法第51頁(yè)/共119頁(yè)

第二節(jié)天然產(chǎn)物的分離與精制一、溶劑萃取法1、溶劑分離法2、兩相溶劑萃取法第52頁(yè)/共119頁(yè)

1、溶劑分離法

采用三、四種不同極性的溶劑，由低級(jí)性到高級(jí)性分步進(jìn)行分離。①正己烷→乙醚→甲醇→水②正己烷→二氯甲烷→甲醇→水第53頁(yè)/共119頁(yè)

一般極性順序（低到高）：石油醚→CS2→CCl4→HCCl2CH2Cl→苯→CH2Cl2→CHCl3→乙醚→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→甲醇→乙腈→水→吡啶→乙酸第54頁(yè)/共119頁(yè)

1)影響分離的因素①分離因子β，分配系數(shù)Kβ=Ka/Kb，Ka>Kb

K=CU/CL

CU、CL為被分離物質(zhì)在上相和下相中濃度

2、兩相溶劑萃取法

利用混和物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。第55頁(yè)/共119頁(yè)

根據(jù)β值的大小可決定分離采用的方法

β>100,簡(jiǎn)單的一次萃取，可基本分離。β≈10，數(shù)次乃至10余次萃取，CCD法β≦2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法β≈1，不能分離可以根據(jù)PC法計(jì)算β值，選擇理想的分離條件。第56頁(yè)/共119頁(yè)

紙色譜（PC），也叫紙分配色譜（PPC，PaperPartitionChromatography）

(γ為紙色譜定數(shù))Rfa、Rfb為A、B兩物質(zhì)在PC上的Rf值第57頁(yè)/共119頁(yè)

②pH值

對(duì)于酸性、堿性和兩性化合物，pH值可以改變它們的存在狀態(tài)（游離型、解離型），分配比受pH的影響。第58頁(yè)/共119頁(yè)

∵

HA+H2O=A-+H3O+pKa=pH-log[A-]/[HA]pH=pKa+log[A-]/[HA]HA達(dá)到99%解離時(shí)，pH=pKa+2HA達(dá)到99%游離時(shí)，pH=pKa-2第59頁(yè)/共119頁(yè)

2)酸堿性成分的分離---pH梯度萃取法

按酸堿性強(qiáng)弱的不同分離酸性、堿性、中性物質(zhì)，改變pH值使酸堿成分呈不同狀態(tài)。如中藥大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚的分離第60頁(yè)/共119頁(yè)

大黃酸大黃素大黃酚酸性最強(qiáng)酸性其次酸性最弱溶于NaHCO3溶于Na2CO3溶于NaOH第61頁(yè)/共119頁(yè)

3)幾種逆流分配方法

逆流分溶法液滴逆流色譜高速逆流色譜第62頁(yè)/共119頁(yè)

①逆流分溶法（CCD法）

多次連續(xù)液-液萃取分離過(guò)程特點(diǎn)：條件溫和，樣品易回收，適用于中等極性、不穩(wěn)定物質(zhì)的分離。

實(shí)驗(yàn)室萃取設(shè)備：1、分液漏斗2、克雷格逆流分布儀。第63頁(yè)/共119頁(yè)

克雷格逆流分布儀

把一系列的分液漏斗有效地排成鏈，重復(fù)進(jìn)行系列的步驟：振搖（混合）、靜置、分離，多次重復(fù)，以提高分離的塔板數(shù)。第64頁(yè)/共119頁(yè)

②液滴逆流色譜（DCCC）

液液分配色譜，流動(dòng)相呈液滴形式垂直上升或下降，通過(guò)固定相，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的逆流色譜分配。特點(diǎn)：不易乳化，樣品可定量回收，分離效果好，特別適合于分離皂苷等水溶性成分。缺點(diǎn)：樣品處理量小。

第65頁(yè)/共119頁(yè)

液滴逆流色譜第66頁(yè)/共119頁(yè)

③高速逆流色譜（HSCCC）

通過(guò)特定的高速行星式旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力場(chǎng)作用，使無(wú)載體支持的液體固定相穩(wěn)定地保留在蛇形管內(nèi)，并使流動(dòng)相單向、低速通過(guò)固定相，實(shí)現(xiàn)連續(xù)逆流萃取分離物質(zhì)的目的。

用于各種物質(zhì)的分離，包括蛋白質(zhì)、酶、三萜、生物堿、皂苷等。第67頁(yè)/共119頁(yè)

4)液-液分配柱色譜

①正向色譜固定相極性大，如水、緩沖液等；流動(dòng)相極性小，如氯仿、乙酸乙酯等載體：硅膠（含水一般大于17%），硅藻土、纖維素等。分離極性較大或水溶性成分，如苷類(lèi)、糖、生物堿等。洗脫順序：極性小的物質(zhì)先被洗脫出來(lái)。第68頁(yè)/共119頁(yè)

4)液-液分配柱色譜

固定相極性小于流動(dòng)相，如HPLC反相色譜柱、反相薄層色譜板。固定相：硅膠的硅醇基與烷基結(jié)合，如RP-2、RP-8、RP-18，親脂性：RP-18>RP-8>RP-2流動(dòng)相（洗脫劑）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脫順序：分離極性大的成分，極性大者先被洗脫出來(lái)。②反相色譜：第69頁(yè)/共119頁(yè)

固定相的表面修飾

第70頁(yè)/共119頁(yè)

三、根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離---吸附色譜法

1、吸附分類(lèi)物理吸附：無(wú)選擇性吸附，吸附-解吸附發(fā)生迅速，吸附劑如硅膠、氧化鋁、活性炭等；化學(xué)吸附：不可逆吸附，如堿性氧化鋁對(duì)酚酸性成分的吸附；酸性硅膠對(duì)生物堿的吸附等；半化學(xué)吸附：聚酰胺對(duì)酚酸類(lèi)、醌類(lèi)的氫鍵吸附。第71頁(yè)/共119頁(yè)

吸附原理：相似相吸

影響吸附過(guò)程的三要素：吸附劑（固定相）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶劑（洗脫劑、展開(kāi)劑、流動(dòng)相）

第72頁(yè)/共119頁(yè)

2、硅膠、氧化鋁

極性吸附劑：載樣量大，吸附力強(qiáng)硅膠：有中性、酸性之分，適用于各類(lèi)成分分離。氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離酸性成分，多用于分離生物堿。第73頁(yè)/共119頁(yè)

2、硅膠、氧化鋁

①被分離物質(zhì)吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

被分離物質(zhì)極性大，吸附力強(qiáng)，難洗脫，Rf值小。官能團(tuán)極性大小排列順序：-COOH>Ar-OH>R-OH>R-NH2、RNHR’、RNR’R’’>RCONRR’>RCHO>RCOR’>RCOOR’>ROR’>RH第74頁(yè)/共119頁(yè)

2、硅膠、氧化鋁

②溶劑（洗脫劑）的極性與洗脫力的關(guān)系洗脫劑極性越大，洗脫力越強(qiáng)；第75頁(yè)/共119頁(yè)

例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強(qiáng)心苷成分，根據(jù)極性大小推測(cè)從硅膠柱上的洗脫順序。

名稱(chēng)RR’黃夾苷ACHO(D-glc)2黃夾苷BCH3(D-glc)2黃夾次苷ACHOH黃夾次苷BCH3H黃夾次苷CCH2OHH黃夾次苷DCOOHH單乙酰黃夾次苷BCH3H單乙酰黃夾次苷BR’’=COCH3, 其它R’’=H第76頁(yè)/共119頁(yè)

答案：1：極性大→極性小，黃夾苷A>黃夾苷B>黃夾次苷D>黃夾次苷C>黃夾次苷A>黃夾次苷B>單乙酰黃夾次苷B2：從硅膠柱上被洗脫下來(lái)的順序：極性小的先被洗出，極性大的后被洗出。第77頁(yè)/共119頁(yè)

3、活性炭----非極性吸附劑

①吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子量大者>分子量小者芳香族>脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的緣故。含OH、COOH、NH2多者>少者第78頁(yè)/共119頁(yè)

3、活性炭----非極性吸附劑

②溶劑的洗脫力

吡啶>15%酚/醇>7%酚/H2O>醇>含水醇>H2O黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色等。③應(yīng)用第79頁(yè)/共119頁(yè)

4、聚酰胺（Polyamide）

由己酰胺聚合成的一類(lèi)高分子化合物。分離原理：主要通過(guò)酰胺與酚、酸、醌等化合物形成氫鍵，吸附能力取決于氫鍵的強(qiáng)弱。第80頁(yè)/共119頁(yè)

4、聚酰胺

①吸附能力與化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系a.形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，吸附力越強(qiáng)；第81頁(yè)/共119頁(yè)

4、聚酰胺

b.形成分子內(nèi)氫鍵者，吸附力減弱；c.分子中芳香化程度高，則吸附性增強(qiáng)；反之，則減弱；第82頁(yè)/共119頁(yè)

4、聚酰胺②溶劑洗脫能力強(qiáng)弱

尿素水溶液>二甲基甲酰胺>甲酰胺>NaOH水溶液>丙酮>甲醇>水第83頁(yè)/共119頁(yè)

③聚酰胺色譜的應(yīng)用4、聚酰胺

聚酰胺對(duì)一般酚類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物的吸附是可逆的（鞣質(zhì)例外），分離效果好，吸附容量大，特別適合于該類(lèi)物質(zhì)的制備與分離。也可用于生物堿、萜類(lèi)、甾體、糖類(lèi)、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離；聚酰胺對(duì)鞣質(zhì)的吸附特別強(qiáng)，近乎不可逆，特別適合于植物粗提物的脫鞣處理。第84頁(yè)/共119頁(yè)

二、沉淀法

在提取液中加入某些溶劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。1、乙醇沉淀法2、酸堿沉淀法3、鉛鹽沉淀法第85頁(yè)/共119頁(yè)

濃提取液中的有效成分在乙醇中不溶或溶解度小。如：淀粉、樹(shù)膠、蛋白質(zhì)、某些多糖。1、乙醇沉淀法特別適合于多糖的分離多糖。第86頁(yè)/共119頁(yè)

第87頁(yè)/共119頁(yè)

第88頁(yè)/共119頁(yè)

如：內(nèi)酯類(lèi)化合物不溶于水，但遇堿開(kāi)環(huán)生成羧酸鹽而溶于水，酸化又析出。2、酸堿沉淀法

利用某些成分在酸（或堿）中溶解，又在堿（或酸）中沉淀的性質(zhì)達(dá)到分離的方法。第89頁(yè)/共119頁(yè)

蛔蒿中提取驅(qū)蛔有效成分山道年

蛔蒿粉末用石灰乳調(diào)勻，加熱水提取，山道年成為山道年酸鈣被水提出，水提取液過(guò)濾濃縮后，加酸酸化，山道年沉淀析出，濾集，用乙酸重結(jié)晶可得純品。第90頁(yè)/共119頁(yè)

生物堿不溶于水，遇酸生成鹽而溶于水，堿化又重新生成游離生物堿。第91頁(yè)/共119頁(yè)

生物堿沉淀劑可形成不溶性復(fù)鹽而析出。如雷氏銨鹽NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]

陳皮甙，黃芩甙等均可用酸堿沉淀法制備。R=葡萄糖醛酸第92頁(yè)/共119頁(yè)

3、鉛鹽沉淀法

中性Pb(Ac)2或Pb(OH)Ac在水或稀醇中，能與多種成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，利用此性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。

中性醋酸鉛可沉淀：有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、鞣質(zhì)、樹(shù)脂、酸性皂甙等。

堿性醋酸鉛可沉淀除上述外，另加醇性羥基、酮基、醛基、中性皂甙、異黃酮、糖類(lèi)。第93頁(yè)/共119頁(yè)

將鉛鹽懸浮于新溶劑中，通入H2S，使其分解為PbS，得有效成分。

也可用H2SO4、Na2SO4、H3PO4、Na3PO4脫鉛。脫鉛第94頁(yè)/共119頁(yè)

三、鹽析法

在有效成分提取液中，加入無(wú)機(jī)鹽使溶解至一定濃度或達(dá)飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低，析出沉淀與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用鹽：NaCl、Na2SO4、MgSO4、(NH4)2SO4例：三七水提取液中，加MgSO4到飽和狀態(tài)，三七皂甙即可沉淀析出。

三顆針中提取黃連素，加NaCl飽和，小薜堿粗品析出。第95頁(yè)/共119頁(yè)

四、透析法

利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過(guò)半透膜，大分子則不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)進(jìn)行分離的方法。

如分離純化皂甙、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子時(shí)，用此法可除無(wú)機(jī)鹽、單、雙糖等小分子雜質(zhì)。

透析膜的膜孔有大有小，視具體情況而選擇，常用透析膜：動(dòng)物性膜、火棉膠膜、硫酸紙膜、玻璃紙膜等。第96頁(yè)/共119頁(yè)

五、結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶六、層析法1、柱層析2、薄層層析3、紙層析4、凝膠層析（又稱(chēng)凝膠過(guò)濾、分子篩過(guò)濾、阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等）第97頁(yè)/共119頁(yè)

4、凝膠層析（GelPenetrationChromatography,GPC）

①葡聚糖凝膠

交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子材料，是水不溶性的白色球狀顆粒，酸性環(huán)境能水解，堿中穩(wěn)定。

在樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于流經(jīng)路徑的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以分離的方法。第98頁(yè)/共119頁(yè)

表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應(yīng)條件。

商品型號(hào)即按凝膠的交聯(lián)度大小分類(lèi)，并以吸水量來(lái)表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量為每克2.5ml。

交聯(lián)度大→網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密→孔隙越小→吸水膨脹越少。第99頁(yè)/共119頁(yè)

型號(hào)吸水量（ml/g）床體積（ml/g）分離范圍最小溶脹時(shí)間肽與蛋白質(zhì)多糖室溫沸水G-101.02~3小于700小于70031G-151.52.5~3.5小于1500小于150031G-252.54~61000~5000100~500062G-505.09~111500~3萬(wàn)500~1萬(wàn)62G-757.512~153000~7萬(wàn)1000~5萬(wàn)243G-1001015~20400015萬(wàn)1000`10萬(wàn)485G-1501520~305000~40萬(wàn)1000~15萬(wàn)725G-2002030~405000~80萬(wàn)1000~20萬(wàn)725凝膠的型號(hào)與使用范圍第100頁(yè)/共119頁(yè)

②層析原理

絕大部分在水溶液中進(jìn)行，凝膠顆粒在適當(dāng)溶劑中浸泡，待充分膨脹后裝入層析柱，加樣后用同一溶液洗脫。在洗脫過(guò)程中，較小的分子滲入凝膠，較大的分子隨溶液流動(dòng)，分子量小的物質(zhì)（阻滯作用大）可通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入粒子內(nèi)部，然后擴(kuò)散出來(lái)，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，后流出色譜柱，分子量大的物質(zhì)沉凝膠粒子間孔隙，隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速度快，先流出色譜柱。第101頁(yè)/共119頁(yè)

不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時(shí)，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進(jìn)入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過(guò)，保留時(shí)間短；而小分子恰恰相反，保留時(shí)間較長(zhǎng)）而得以分離。第102頁(yè)/共119頁(yè)

常用術(shù)語(yǔ)Vt——床體積，凝膠裝柱以后，柱床所占的體積。Vo——外水體積，柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積。Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積。Vg——凝膠本身體積。相互關(guān)系：Vt=Vo+Vi+VgVe——洗脫體積，自樣品加入時(shí)算起，至流出組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)，所流出的體積。第103頁(yè)/共119頁(yè)

同一類(lèi)型化合物，洗脫特征與組分分子量有關(guān)。

Ve=K1-K2logM

說(shuō)明不同組分流經(jīng)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的，洗脫體積小，最先流出，當(dāng)條件固定時(shí)，Ve重現(xiàn)性很好。

按此特性可測(cè)大分子物質(zhì)的分子量。第104頁(yè)/共119頁(yè)

用已知分子量的物質(zhì)分別相繼上柱（5mg），流出液按每管2~4ml收集，通過(guò)硫酸蒽酮顯色，再經(jīng)紫外檢測(cè)，分別求得洗脫體積Ve。再用藍(lán)色葡聚糖測(cè)出柱床的外水體積Vo，按Ve/Vo與分子量對(duì)數(shù)關(guān)系作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最后將待測(cè)物質(zhì)分子量用少水溶解上柱，在同樣條件下測(cè)定Ve，根據(jù)Ve/Vo，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得物質(zhì)分子量。局限性：

1、要有標(biāo)準(zhǔn)樣。

2、不同的待測(cè)物質(zhì)要有不同的標(biāo)準(zhǔn)樣。第105頁(yè)/共119頁(yè)

操作技術(shù)：溶脹：不同凝膠溶脹時(shí)間不一樣，G-100室溫下最小水化時(shí)間72h，除微顆粒。目的：充分吸水，各孔隙舒張，以利于物質(zhì)分子通過(guò)。裝柱：柱內(nèi)加少量洗脫液，排除底部氣泡，然后將凝膠漿倒入，讓其自然沉降，打開(kāi)出口，柱床表面不再下沉即緊密。裝好的柱應(yīng)不含氣泡，柱床表面平坦。第106頁(yè)/共119頁(yè)

平衡：用3倍床體積洗脫液讓柱平衡流動(dòng)2-3天，至流速恒定。加樣：平衡后，床表面應(yīng)有1~2cm的洗脫液，用吸管沿柱壁加入，打開(kāi)出口，當(dāng)上面液體剛好全部滲入柱內(nèi)時(shí)，滴加洗脫液，注意不能振動(dòng)床表面。

上樣品要體積小，濃度大，這樣峰形好。第107頁(yè)/共119頁(yè)

洗脫：一般用水和電解質(zhì)溶液，如酸、堿、鹽的溶液及緩沖溶液。加入5cm以上洗脫液時(shí)，可接高位瓶中的洗脫液，洗脫分階段洗脫和梯度洗脫收集：分部收集器收集。檢出：蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽用紫外光譜儀在280nm、260nm、230nm測(cè)吸光度值，以樣品體積（或管數(shù)）為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，畫(huà)出洗脫曲線(xiàn)。第108頁(yè)/共119頁(yè)

1、氣