PCR技術分離目的基因課件

第二節(jié)PCR技術分離目的基因一PCR技術

1PCR的含義

PCR（polymerasechainreaction）：模仿細胞內發(fā)生的DNA復制過程，體外大量合成目的DNA片段，包括變性、退火、延伸三個步驟。2PCR反應程序：（1）90－95℃模板變性（2）37－60℃引物與模板復性（退火）（3）70－75℃引物，合成模板鏈DNA的互補鏈循環(huán)25-35次加熱變性復性復溫DNA的變性和復性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復,這稱DNA復性,也叫退火。

引物引物Mullis’ideaDNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術PCR引物的設計原則:1.引物的特異性

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

2.長度

寡核苷酸引物長度為15~30bp。3.G+C含量

G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.堿基礎隨機分布

引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

5.引物自身

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。

6.引物之間

兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。

ＲＴ－ＰＣＲ逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增RACE（RapidamplificationofcDNAends）cDNA末端的快速擴增技術，是以mRNA為模板合成cDNA第一條鏈后用PCR技術擴增出某個特異位點到3’或5’端之間未知序列的方法。3’-RACE5’-RACE目的基因的分離技術：基因文庫技術PCR技術插入突變法分離目的基因圖位克隆法分離目的基因（chromosomewalking）

酵母雙雜交技術分離目的基因

基因芯片技術蛋白質組學技術....第三節(jié)基因的化學合成在基因的化學合成中，首先要合成出有一定長度的、具有特定序列結構的寡核苷酸片段，然后再通過DNA連接酶的作用，使它們按照一定的順序共價地連接起來。目前已發(fā)展出來的有關寡核苷酸片段的化學合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法，以及在后二者基礎上發(fā)展起來的固相合成法和自動化法。磷酸二酯法（最早創(chuàng)立的DNA化學合成方法）基本原理：將兩個在5’或3’—末端各帶有適當保護基團的脫氧單核苷酸連接起來，形成一個兩端都被保護的二核苷酸