微生物藥物的發(fā)酵工藝詳解演示文稿

微生物藥物的發(fā)酵工藝詳解演示文稿當前1頁，總共96頁。（優(yōu)選）微生物藥物的發(fā)酵工藝當前2頁，總共96頁。（一）微生物藥物工業(yè)生產菌種工業(yè)生產用菌株不同于實驗室研究菌株，不但要求其產物合成能力能夠穩(wěn)定的表達，還應追求產量盡可能的高，作為目標產品的類似物盡可能的少，發(fā)酵產物盡可能的易于提取精制等。在工業(yè)生產中，需要對生產菌株不斷的純化、復壯和改良。當前3頁，總共96頁。工業(yè)生產菌株應滿足的要求：能夠產生較高濃度的目標產物；微生物藥物工業(yè)發(fā)酵中高濃度產物一般是胞外產物；產物便于分離提??；能利用易得廉價原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纖維素物質等；不致病，不產生內毒素；發(fā)熱量低，需氧低，具備適中的發(fā)酵溫度和細胞形態(tài)，即發(fā)酵條件較溫和；容易進行代謝調控。當前4頁，總共96頁。菌種的選育1.尋找產生新化合物的菌種（略）2.現(xiàn)有微生物藥物產生菌種的選育目的：a.提高目標產物的產率水平，降低雜質組分含量b.提高菌種對工業(yè)化生產條件的適應力方法：a.自然純化選育b.傳統(tǒng)誘變選育（紫外線、誘變劑、離子束）c.代謝調控和條件模型選育d.基因工程選育當前5頁，總共96頁。工業(yè)用菌種的分離純化正常菌退化菌傳代傳代傳代微生物遺傳變異是絕對的，穩(wěn)定是相對的；退化性的變異是多數(shù)的，進化性的變異是少數(shù)的。不對工業(yè)用菌種加以分離純化，剔除變異菌，那么通過傳代的累積效應，退化變異菌種將占據(jù)種群遺傳優(yōu)勢。最終導致生產水平的波動和下降。當前6頁，總共96頁。菌種分離純化流程（例）保存菌種涂布平板點種平板斜面稀釋涂布單菌落點種接斜面擴增生產能力鑒定斜面斜面當前7頁，總共96頁。菌種制備保存方式：1.短期制備保存短期制備保存方式主要用于生產用菌種的擴增制備和短時保存。保證培養(yǎng)物能夠短時的保存在常溫或者冷藏條件下，隨時應用于生產。主要包括：菌落平板試管/茄子瓶斜面麩皮/米孢子培養(yǎng)物2.中長期制備保藏中長期制備保存方式主要用于菌種中長期保存，保證菌種的遺傳特性和活力，保證生產菌種有可靠來源。主要包括：冷凍甘油管保藏冷凍干燥管保藏液氮甘油管保藏沙土/石蠟管保藏

基本原則：低營養(yǎng)/干燥/缺氧/低溫/密封當前8頁，總共96頁。（二）微生物藥物發(fā)酵生產過程發(fā)酵生產流程概況生產菌種培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物藥物的發(fā)酵生產包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵生產兩個階段。種子培養(yǎng)階段通過連續(xù)的擴增培養(yǎng)，獲得足夠量健壯均一的種子投入發(fā)酵生產。發(fā)酵生產包括生長期和生產期，生長期仍以菌量的擴增為目的；當營養(yǎng)消耗等條件適宜后，微生物即開始產生目標產物，進入生產期。當前9頁，總共96頁。發(fā)酵種子培養(yǎng)過程遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期種子生長曲線種齡菌量種子的評價指標：生長健壯旺盛，移入下一級后能迅速生長，遲滯期短菌體穩(wěn)定均一，生長同步性好菌體總量和生長密度適宜無雜菌污染當前10頁，總共96頁。發(fā)酵種子培養(yǎng)的調控

1.培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽、生長因子是微生物生長的四大營養(yǎng)要素。一般而言，種子配方中碳/氮比要求均衡，量以滿足生長為宜，優(yōu)質有機氮源要有一定比例。碳氮源種類選擇上則必須了解菌種的利用能力，并配合考慮種齡種量和發(fā)酵配方中碳氮源組成。2.環(huán)境因素影響菌種生理活性的因素包括了溫度、pH、溶氧、滲透壓、離子強度等。不同的菌種都有著其最適應的范圍，從而進行正常的生理代謝。所有上述因素的選擇在種子階段都應以菌種的生長最適條件來進行選擇。3.種子級數(shù)的設計種子培養(yǎng)級數(shù)越多，培養(yǎng)周期越長，過程中可能出現(xiàn)的不穩(wěn)定因素越多。在設備條件允許的情況下，應盡可能縮減種子培養(yǎng)級數(shù)，提高每一級培養(yǎng)下菌體的擴增量，保證下一級需要。

當前11頁，總共96頁。發(fā)酵生產流程培養(yǎng)基投料溶解移入發(fā)酵罐定容調節(jié)滅菌前pH值高壓蒸汽滅菌降溫至培養(yǎng)溫度種子液移入調節(jié)空氣流量、攪拌速度、罐頂壓至規(guī)定值，開始發(fā)酵當前12頁，總共96頁。發(fā)酵生長曲線遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期發(fā)酵周期生長期生產期次生代謝發(fā)酵原理：當微生物生長到一定階段，由于營養(yǎng)減少和有害代謝物積累，使比生長速率下降趨零。為了維持生存，微生物體觸發(fā)有關次生代謝基因，產生次生代謝物。以取得環(huán)境競爭優(yōu)勢，保存自身。當前13頁，總共96頁。影響發(fā)酵的相關因素—培養(yǎng)基1.碳源碳源用于提供微生物能量來源、構建細胞和形成產物。碳源包括單糖、雙糖、多糖、天然復合物、油脂、低級醇烴等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。當培養(yǎng)基中碳源達到5%以上就形成高滲透壓溶液，影響發(fā)酵。同時在一定濃度下碳源會阻遏產物合成酶，形成碳分解代謝物阻遏。2.氮源氮源是微生物蛋白質和其他含氮有機物的來源，也參與形成含氮產物。氮源包括無機氮源和有機氮源，如氨鹽、硝酸鹽、玉米漿粉、蛋白胨等。無機氮中的銨離子及有機氮通過降解得到的銨離子也有阻遏產物合成酶的性質。3.礦物鹽磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽是微生物能量代謝和生長的參與因素。鋅、鐵、鉬、鈷等是微生物所需要的微量元素。碳酸鈣可以調節(jié)發(fā)酵液pH，但鹽濃度達到一定程度則成為生長抑制和產抗調節(jié)因素。當前14頁，總共96頁。4.生長因子許多微生物生長需要它們所不能合成的生長因子，如特殊氨基酸、維生素、生物素、嘌呤等。一般在天然復合物（如酵母粉、玉米漿）中有存在，但有時也必須單獨添加以保證需要。5.消泡劑發(fā)酵過程中，由于營養(yǎng)物分解代謝和菌體老化，加上發(fā)酵罐內通氣和攪拌效果，易導致泡末產生，造成溶氧不足和逃液等問題?？赏ㄟ^消泡劑的添加控制泡末。一般消泡劑為高分子聚合物，如泡敵，聚乙二醇等。油類也具有類似效果，如豆油、葵花子油等。6.前體物質次生代謝產物的合成往往需要特定化學結構物質作為反應起始物。這些物質雖然也能夠通過微生物代謝合成得到，但如果予以人為添加則可以有效減少限制，促進產物合成。如青霉素發(fā)酵中添加苯乙酸，紅霉素發(fā)酵中添加正丙醇，達托霉素發(fā)酵中添加癸酸，雷帕霉素、環(huán)孢菌素等添加特定氨基酸效價可以提高好幾倍。影響發(fā)酵的相關因素—培養(yǎng)基當前15頁，總共96頁。發(fā)酵工業(yè)中，一些常見前體物質產品前體產品前體青霉素G青霉素V金霉素灰黃霉素紅霉素達托霉素苯乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇癸酸核黃素類胡蘿卜素L-異亮氨酸L-色氨酸L-絲氨酸西索霉素丙酸鹽β-紫羅酮-氨基丁酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸蛋氨酸當前16頁，總共96頁。前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利如苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07%，癸酸必須培養(yǎng)15h后加入。前體添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，分解等。

因此，前體在使用過程中，常采用流加方法。用法：前體普遍采用流加的方法，流加有利于提高前體的轉化率。當前17頁，總共96頁。產物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑。產物促進劑當前18頁，總共96頁。

促進劑提高產量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的（機理不詳）。有些促進劑本身是酶的誘導物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產；也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。當前19頁，總共96頁。在發(fā)酵培養(yǎng)基設計中，一般先用合成成分鑒別特殊需要，再轉為天然培養(yǎng)基，以擴大生產。在發(fā)酵培養(yǎng)基成分選擇是，除傳統(tǒng)營養(yǎng)外，可選用各種農副產品、工業(yè)副產品、廢料等。開發(fā)天然培養(yǎng)基時，應考慮：新選微生物及其工藝的特殊營養(yǎng)需求；為保持培養(yǎng)基成分穩(wěn)定，改善儲藏條件和加工條件；原料的性質及配制、滅菌、發(fā)酵條件對產物提取的影響；培養(yǎng)基價格。發(fā)酵培養(yǎng)基設計當前20頁，總共96頁。培養(yǎng)基優(yōu)化（1）目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方。（2）只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照他人所使用的比較適合某一類菌種、某一類產品發(fā)酵的經(jīng)驗配方。（3）采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。當前21頁，總共96頁。培養(yǎng)基優(yōu)化的基本原則注意事項：（1）菌種特性，同化能力（2）合適的C、N比。（3）合適的快速利用碳源、氮源。（4）合適的生理性酸性與堿性（5）pH、離子強度等沒有最好，只有更好當前22頁，總共96頁。提高生產率降低物耗、能耗、三廢排放提高發(fā)酵單位縮短生產時間價廉的原料替代，降低成本培養(yǎng)基優(yōu)化目標當前23頁，總共96頁。正交實驗均勻設計神經(jīng)網(wǎng)絡其他方法聚類分析響應面分析單因子實驗成本發(fā)酵單位方法結果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法當前24頁，總共96頁。影響發(fā)酵的相關因素—培養(yǎng)條件1.溫度溫度影響微生物酶系的活力，這些酶分別決定微生物的初級代謝生長和次級代謝產抗。不同微生物菌種的生長溫度不一樣，而生長和產抗階段的最適溫度也有差異。發(fā)酵溫度的設計要綜合考慮能源消耗、發(fā)酵周期、穩(wěn)定培養(yǎng)和產率水平因素，必要時可考慮變溫培養(yǎng)。2.pHpH對微生物的影響，主要也是作用于酶。另外對營養(yǎng)利用和細胞結構也有重要影響。無控制的條件下，pH呈現(xiàn)如下變化規(guī)律。有機氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用碳源消耗產生有機酸菌體老化，進入鳥氨酸循環(huán)形成大量NH4+菌體二次生長當前25頁，總共96頁。影響發(fā)酵的相關因素—培養(yǎng)條件

pH的調節(jié)首要在基礎培養(yǎng)基的設計，如生理酸堿性物質的搭配、緩沖體系的設計等。另外可以加入外源性的酸堿物質調控，如鹽酸、氨水等。在流補體系中，往往通過葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同時也兼具營養(yǎng)補充功能。3.氧的供應工業(yè)微生物大都為好氧微生物，氧的供應和利用影響初級生長和次級代謝。工業(yè)發(fā)酵中，將無菌空氣通入培養(yǎng)基，通過攪拌槳分散氣體以實現(xiàn)有效利用，同時維持一定罐頂壓以增大氧的溶解度。反映氧的供給和利用情況的數(shù)值包括：DO溶解氧、OUR攝氧率、Kla氧傳遞速率等，可通過溶氧電極、發(fā)酵尾氣分析儀等獲得。類似的，生長和產抗往往有不同的氧需求。通過調節(jié)通氣量、攪拌速率、罐壓可以有效控制和保證氧的供給。而發(fā)酵黏度、泡沫等因素往往導致氧利用的惡化，需要警惕和控制。當前26頁，總共96頁。影響發(fā)酵的相關因素—培養(yǎng)條件

4.滅菌條件發(fā)酵罐和培養(yǎng)基滅菌是無菌培養(yǎng)的必要前提，同時也導致營養(yǎng)損失和毒性物質積累。因此對于敏感菌種往往需要對部分養(yǎng)分單獨滅菌，以降低影響。但是這些影響因素往往會成為控制生長、調節(jié)微生物產抗的必要因素。通過滅菌溫度、時間的調整來控制微生物發(fā)酵也是常用的手段。5.剪切力發(fā)酵生產培養(yǎng)中，攪拌促進氧的分散利用，但槳葉尖端末速形成的剪切力也會損傷菌體，造成菌體斷裂破碎，進而導致二次生長、黏度提高、菌種變異等情況，使發(fā)酵惡化。對于剪切，可以篩選耐剪切力菌種，提高菌種抵抗能力。在設備上也可以選擇低剪切、高分散效率的攪拌槳，如軸流推進式槳葉。當前27頁，總共96頁。影響發(fā)酵的相關因素—其他因素

1.種子質量的影響2.設備的影響良好可靠的發(fā)酵設備是發(fā)酵生產的必要因素。設備對于發(fā)酵生產的負面影響表現(xiàn)如：軸封磨損、管路接頭縫隙、過濾器失效導致染菌問題；攪拌不平衡導致罐體震動，影響供氧；開關閥門動作失靈導致溫度、pH控制不穩(wěn)等等。3.人員操作的影響人員操作是發(fā)酵生產控制的重要因素,對發(fā)酵生產各環(huán)節(jié)都有決定性影響。只有嚴格按照操作規(guī)程操作，才能避免由于粗略和錯誤的影響。4.環(huán)境因素環(huán)境因素往往導致發(fā)酵水平的季節(jié)性波動。如環(huán)境空氣的溫濕度會使無菌空氣的溫濕度有差異，導致培養(yǎng)體積隨時間的增減，影響發(fā)酵環(huán)境。（健壯均一、足夠數(shù)量、縮短遲滯期）當前28頁，總共96頁。發(fā)酵終點的判斷

1.發(fā)酵的評價指標發(fā)酵產率：單位體積的產物含量g/L發(fā)酵總億：發(fā)酵液中產物總產量十億單位/kg發(fā)酵系數(shù)：產物總產量/總發(fā)酵體積*總發(fā)酵時間kg/m3*h發(fā)酵成本：發(fā)酵(原料+動力+人員+其他)成本/總產量元/kg2.終點判斷標準發(fā)酵終點的判斷主要從技術和經(jīng)濟指標兩方面來衡量。技術上需要尋找發(fā)酵總億與發(fā)酵系數(shù)的平衡點，當總億增加，發(fā)酵系數(shù)卻趨低時即應考慮放罐。同時從分離角度考慮，一方面殘余營養(yǎng)物要盡量減少，另一方面菌體自溶不能大量出現(xiàn)。此外，一旦難分離雜質組分有升高趨勢，也將影響分離得率和總的成本。從經(jīng)濟角度考慮，發(fā)酵終點應處于最低發(fā)酵成本位置，但同時也應兼顧分離提取需要。當前29頁，總共96頁。（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹當前30頁，總共96頁。（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹當前31頁，總共96頁。當前32頁，總共96頁。當前33頁，總共96頁。當前34頁，總共96頁。當前35頁，總共96頁。當前36頁，總共96頁。工業(yè)發(fā)酵攪拌器技術的發(fā)展適用發(fā)酵過程的攪拌器徑向流圓盤攪拌器：

－Rushton渦輪

－半彎管圓盤渦輪

－BT-6軸向流攪拌器：

－窄葉高效軸流

A310，CBY,HE3，ZCX等

－寬葉高效軸流

A315，KSX,MaxFlo等

當前37頁，總共96頁。工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術紅霉素370噸發(fā)酵罐當前38頁，總共96頁。工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術酶制劑-糖化酶當前39頁，總共96頁。長城最新發(fā)酵攪拌技術發(fā)酵罐設計幾點經(jīng)驗發(fā)酵罐的長徑比H/D的考慮：考慮氣體的停留時間以及熱管的布置國內一般考慮2.5到3。考慮攪拌的整體穩(wěn)定、換熱的能力以及罐體水柱背壓對壓縮機背壓的影響從而極大影響壓縮機能耗，國外例如DSM青霉素H/D=2，韓國希杰氨基酸H/D=1；由于攪拌能力提高靠大H/D提高氣含率，與低H/D沒有太大區(qū)別。氣含率的控制：對于目前高的氣含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建議對于通氣比在1：0.5以內的攪拌控制氣含率在6~8%，抗生素在8~12%之間。

當前40頁，總共96頁。長城最新發(fā)酵攪拌技術3換熱管的布置：豎型列管，大蛇管，排管，圓形列管束（列管式換熱器型），彈簧管，蜂窩擋板等等。采用形式與發(fā)酵液黏度、固形物含量，發(fā)酵液熱值等等有關。擋板（換熱管就是一定的擋板）的大小靠近全擋板的75%到80%為佳。豎管大蛇管彈簧管當前41頁，總共96頁。工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術小結大量的工業(yè)生物過程需要攪拌技術和設備，攪拌設備隨著發(fā)酵罐的容積的增大也越來越大；新的攪拌技術也不斷應用于工業(yè)發(fā)酵過程。發(fā)酵罐的高徑比設計，換熱管的設計等都與攪拌設計密切相關，有許多經(jīng)驗可供參考。

當前42頁，總共96頁。（四）幾種抗生素的發(fā)酵工藝實例（1）青霉素的發(fā)酵工藝青霉素的產生菌——產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）51-20和點青霉（P.notatum），目前全世界用于青霉素生產的高產菌株幾乎都是以產黃青霉為出發(fā)菌株，經(jīng)不同的改良途徑得到的。目前青霉素的發(fā)酵單位最高達到120000U/ml。當前43頁，總共96頁。In1928,AlexanderFleming(left),aScottishbacteriologist,discoveredamoldwithbacteria-killingpowerssoincredibleitwaseffectiveevenwhendiluted800times.CourtesyoftheUSDA.Right,astrainofP.notatumwasusedforsomeofthefirsttestsofpencillin.CourtesyoftheFDA’sCenterforDrugEvaluationandResearch.當前44頁，總共96頁。甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)砂土孢子生產孢子的制備大米或小米固體培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7d，孢子成熟后真空干燥，低溫保藏備用。當前45頁，總共96頁。采用三級發(fā)酵，其目的是使青霉菌菌體數(shù)量逐步擴大和適應發(fā)酵，其次是使發(fā)酵罐連續(xù)使用，縮短發(fā)酵周期。一級發(fā)酵：小罐，使孢子萌芽形成菌絲；二級發(fā)酵：大量繁殖青霉菌菌絲體；三級發(fā)酵：繼續(xù)大量繁殖菌絲體，生產青霉素。大規(guī)模發(fā)酵生產當前46頁，總共96頁。發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌體的生長；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素發(fā)酵中采用連續(xù)流加葡萄糖的方法，在發(fā)酵初期使青霉菌大量迅速強壯地繁殖菌絲體；發(fā)酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米漿是青霉素發(fā)酵最好的氮源。

玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質，含大約40%～50%固體物質。在玉米浸泡過程中若長有乳酸菌和酵母菌，則提高玉米漿的質量；若長有腐敗性細菌則降低玉米漿的質量。（含有大量乳酸）玉米漿是微生物生長很普遍應用的有機氮源，它還能促進青霉素等抗生素的生物合成。當前47頁，總共96頁。前體的影響和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作為青霉素G側鏈的前體物直接結合到青霉素分子中，也可以作為養(yǎng)料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等對菌體生長和生物合成均有毒性。采用間歇或連續(xù)添加低濃度前體物質的方法，保持前體的供應率僅大于生物合成的需要，可以起到提高產量的作用。當前48頁，總共96頁。pH的影響和控制：青霉素發(fā)酵的最適pH一般認為是，應盡量避免pH超過7.0。當pH高于最適pH時，通過補糖和生理酸性物質（硫酸銨等無機氮源）降低pH；當pH低于最適pH時，通過補加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通氣量，促進有機酸氧化來提高pH?？衫米詣蛹尤胨峄驂A的方法維持pH。當前49頁，總共96頁。溫度的影響和控制：青霉菌生長的適宜溫度是30℃，分泌青霉素的適宜溫度是20℃，通常采用分段變溫控制法，使溫度適合不同階段的需要。0-56h維持在27.2℃，然后恒速降溫至18.7℃，并維持到184h，最后24h回復到27.2℃培養(yǎng)。這樣變溫培養(yǎng)法可比常溫25℃培養(yǎng)產量增加16%。當前50頁，總共96頁。補料控制：中間補糖以控制糖濃度和pH；補加氮源可延長發(fā)酵周期、調節(jié)pH、提高青霉素產量，控制發(fā)酵液中的氨基氮含量在0.01%-0.05%。補加表面活性劑，如新潔爾滅50mg/L、聚氧乙烯、山梨糖醇酐等也能增加青霉素的產量。當前51頁，總共96頁。加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能使青霉素產率提高38%。（1）當發(fā)酵罐使用較大的攪拌功率和較快的攪拌葉尖速時，這些高分子化合物能使臨近攪拌葉的液體速度梯度降低，避免打斷菌絲，而且促進氧在培養(yǎng)基中充分溶解的同時還有利于除去CO2。（2）菌絲生長時，由于高分子化合物起到分散劑的作用，菌絲不致成團，界面面積得以增加，因而增加了氧傳遞到菌絲體內的總速度。當前52頁，總共96頁。鐵離子的影響和控制：Fe3+對青霉素生物合成有顯著影響，一般當發(fā)酵液中含量超過30-40μg/ml，則發(fā)酵單位增長緩慢。鐵制發(fā)酵罐在使用前必須進行處理，可在罐壁涂上環(huán)氧樹脂等保護層，使Fe3+含量控制在30μg/ml以下。當前53頁，總共96頁。冷凍干孢子瓊脂斜面米孢子種子罐發(fā)酵罐提取工序菌種工藝：自身耐受性突變前體或前體類似物抗性突變營養(yǎng)缺陷型的回復突變耐消泡劑的菌株細胞膜滲透性良好的菌株構建基因工程菌株發(fā)酵的優(yōu)化控制碳、氮源pH溫度微量元素：鐵離子的影響補料:糖、硫酸銨、尿素、玉米漿前體化合物、水溶性高分子化合物、表面活性劑青霉素生產工藝流程當前54頁，總共96頁。（2）達托霉素的發(fā)酵工藝達托霉素的產生菌——玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)當前55頁，總共96頁。daptomycin的分子結構福建省微生物研究所由連接到一個環(huán)狀13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸?；鶄孺湗嫵?。

當前56頁，總共96頁。達托霉素的作用機制福建省微生物研究所改變細胞膜電位，攪亂細胞膜對氨基酸等的轉運從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成；改變細菌細胞質膜的性質，破壞細菌細胞膜使細菌內容物外泄等。daptomycin是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能抑制G＋細菌細胞膜上特有成分脂磷壁酸合成的抗生素。

當前57頁，總共96頁?；瘜W半合成法首先經(jīng)玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵獲得達托霉素原形藥然后經(jīng)微生物轉化、化學半合成最終形成達托霉素。工藝路線長，存在兩步發(fā)酵，發(fā)酵效率和提取收率低，不適于工業(yè)化生產。生物定向合成法利用癸酸作為發(fā)酵的前體物直接由微生物發(fā)酵產生達托霉素。一步發(fā)酵，發(fā)酵效率高，工藝路線短，提取收率也比較高。達托霉素生物合成途徑當前58頁，總共96頁。

從抗生素A21978C到daptomycin

當前59頁，總共96頁。誘變推理選育高產菌種搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化常規(guī)誘變：紫外輻射、NTG、抗生素處理等遺傳穩(wěn)定性菌種保藏工藝單因素、正交、響應曲面法等搖瓶流加癸酸鹽癸酸耐受性菌種遺傳改良當前60頁，總共96頁。菌種工藝菌種用冷凍干燥法或甘油管法保存，并嚴格控制有效使用期；所有生產用菌種或斜面都保存于低溫冷庫內（0-4℃），并限制其使用期限；嚴格控制生產菌落在斜面上的傳代次數(shù)，一般以3代為限，用單菌落轉種，以使用新鮮斜面為原則；定期進行菌種的純化篩選，淘汰退化的菌落；不斷選育高單位的新菌種。達托霉素產生菌容易發(fā)生變異當前61頁，總共96頁。大規(guī)模發(fā)酵生產采用高度通氣攪拌、3-4級的擴大深層培養(yǎng)法發(fā)酵。菌種（冷凍干燥管或甘油管）→斜面→搖瓶種子（1-2級）→種子罐種子（1-3級）→大罐發(fā)酵（7-8d）發(fā)酵過程控制pH（流加氨水）適當時機補料前體物質癸酸（采用不同的形式：癸酸鹽或溶于有機溶劑）當前62頁，總共96頁。發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：首選碳源是馬鈴薯糊精；可利用碳源：葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、麥芽糊精等等有機氮源以黃豆餅粉為佳，無機氮源以硫酸銨和尿素最常用，氨水可用來調節(jié)發(fā)酵pH。有機氮源：酵母粉、黃豆粉、黃豆餅粉、玉米漿粉、蛋白胨、棉籽粉無機氮源：硫酸銨、尿素、硝酸銨、檸檬酸三銨、磷酸氫二銨等當前63頁，總共96頁。無機鹽及微量元素的影響和控制：磷酸鹽對菌體生長和抗生素的合成非常重要，一般采用較低的磷酸鹽濃度，15-150mmol/L（46.5-465mg/L）；Fe2+一般適用量在20μg/ml（FeSO4、(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O

）生物素（biotin）、維生素C、維生素B12；當前64頁，總共96頁。通氣和攪拌的影響和控制：增加通氣量，保持一定攪拌速度，避免長期停止攪拌和悶罐。當前65頁，總共96頁。溫度、pH的影響和控制：玫瑰孢鏈霉素發(fā)酵溫度以30℃為宜；玫瑰孢鏈霉素菌絲生長的最適pH為7.0左右，適于達托霉素合成的pH為。當前66頁，總共96頁。補加葡萄糖、硫酸銨和氨水，不僅為菌體生長和產物合成提供營養(yǎng)物質，還能調節(jié)發(fā)酵液的pH。前體物癸酸對細胞毒性大，很小劑量就可以抑制細胞生長，甚至導致死亡；但是作為達托霉素的側鏈，在發(fā)酵適當時機加入可以大大提高達托霉素產量（約5~10倍）由于癸酸對細胞具有毒性，而且其在常溫下是呈固體狀。所以必須通過溶劑溶解后再由補料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶解在油酸甲酯或乙醇中的癸酸仍然對細胞具有較大毒性，并且溫度低時容易結晶析出，影響流加效果。而癸酸鹽在常溫下能夠以液體的形式存在，并且游離癸酸根離子對細胞的毒性相對效價。因此可以作為達托霉素側鏈的供體。

補料控制當前67頁，總共96頁。種子罐為200L，裝料70%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：0.03-0.05MPa，空氣流量：1：1vvm，攪拌轉速150～300rpm，發(fā)酵過程用濃氨水調節(jié)pH不低于6.5。菌容達到30%左右，約30h移入2噸二級罐（培養(yǎng)基同發(fā)酵罐）裝液量為70%，移種量為5%～10%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：0.03-0.05MPa，空氣流量：1：1vvm，攪拌轉速150～250rpm，發(fā)酵過程用濃氨水調節(jié)pH不低于6.5。在培養(yǎng)15hr左右（菌容為20%），移入發(fā)酵罐10噸，移種量15%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：0.03-0.05MPa，空氣流量：1：1vvm，攪拌轉速150～250rpm，發(fā)酵過程用濃氨水調節(jié)pH不低于6.5。發(fā)酵24h后開始補料流加癸酸鹽溶液（癸酸鈉、癸酸鉀、癸酸銨），流速0.5----3.0ml/L/H至發(fā)酵結束時發(fā)酵液中達托霉素效價達到1000～1700mg/l左右。

當前68頁，總共96頁。發(fā)酵前期控制：原材料、滅菌、種子質量、菌體形態(tài)溶氧對發(fā)酵的影響：攪拌、通氣、罐壓、補水等菌體比生長速率跟抗生素產量的關系淀粉酶活性的變化規(guī)律糖氮、溶磷曲線規(guī)律前體物的添加策略：癸酸的組分形式、補料時機、流加速度、發(fā)酵液中殘余癸酸濃度等最大限度的發(fā)揮高產菌株的生產性能連續(xù)多批次在100L發(fā)酵罐上實現(xiàn)高產，在工廠3噸發(fā)酵罐以及10噸生產罐上實現(xiàn)工藝重復。達托霉素發(fā)酵過程控制研究當前69頁，總共96頁。發(fā)酵曲線分析當前70頁，總共96頁。當前71頁，總共96頁。發(fā)酵曲線分析當前72頁，總共96頁。發(fā)酵液預處理：加熱、調酸、加絮凝劑、硅藻土過濾：濾布的孔徑、陶瓷膜的孔徑超濾、納濾溶媒萃取樹脂分離分離提煉工藝當前73頁，總共96頁。

本實驗室在一株鏈霉菌NOV-0827產生的次級代謝產物中發(fā)現(xiàn)香豆素類抗生素新生霉素（novobiocin），大環(huán)內酰胺類抗生素BE-14106（GT-32A）和GT-32B。

（3）新化合物的發(fā)現(xiàn)及發(fā)酵工藝優(yōu)化當前74頁，總共96頁。原始菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天。待菌體發(fā)育成熟后，將斜面接入種子培養(yǎng)基，種子在28℃，轉速220rpm條件下培養(yǎng)48h后，再以5%的接種量接到裝液量60ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，220rpm條件下培養(yǎng)144h。流程為：斜面

7天，28℃種子培養(yǎng)基

48h，28℃發(fā)酵培養(yǎng)基

144h，28℃

發(fā)酵液菌株發(fā)酵基本流程當前75頁，總共96頁。原始菌株經(jīng)自然選育，得到了14株不同形態(tài)的菌株，編號依次為1#-14#。再對這14株菌株進行篩選，以新生霉素的產量為指標，篩選出效價較高的4#和5#菌株。菌株形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：無孢子的菌株相對于有孢子的菌株，新生霉素的效價更高。各篩選菌株相對效價的比較圖

篩選菌株形態(tài)圖注：從左至右依次為：1#、8#（有孢子);4#、5#（無孢子）當前76頁，總共96頁。傳代次數(shù)相對效價（100%）1#8#4#5#F1100100100100F2107.496.2118.492.3F3113.5100.8120.699.4F498.2114.3123.6101.2F5107.8108.5118.9103.6篩選菌株傳代穩(wěn)定性考察對篩選出的4株菌株進行分別5次傳代培養(yǎng)，以生長良好的第一代菌株為對照，分別考察各代新生霉素產量的穩(wěn)定性。結果顯示：各篩選菌株的遺傳穩(wěn)定性良好，可作為下一步的實驗菌。當前77頁，總共96頁。顯微鏡下菌絲體形態(tài)圖注：A：4倍；B：10倍；C：40倍；D：100倍ABCD對種子及發(fā)酵培養(yǎng)液進行取樣、涂片、染色后，鏡檢觀察菌絲體形態(tài)，鏡檢結果顯示：菌絲體長勢良好，菌絲茁壯、茂密、舒展，無結團現(xiàn)象。當前78頁，總共96頁。

在本部分的研究中，對原始出發(fā)菌株經(jīng)自然選育和初步篩選，得到了1株編號為4#，菌株形態(tài)觀察無孢子的菌株，其新生霉素的效價最高。且傳代穩(wěn)定性實驗表明其遺傳穩(wěn)定性良好，可作為下一步實驗菌。因此，選擇效價最高的4#菌株為下一步的實驗菌株，其新生霉素的效價較原始菌株提高了272.6%。當前79頁，總共96頁。發(fā)酵罐總發(fā)酵液HPLC圖化合物B化合物C化合物A實驗過程中，初步發(fā)現(xiàn)了3個較明顯的化合物峰，標記為化合物A、B、C。首先以效價較高的化合物B為指標，利用單因素實驗優(yōu)選出合適的碳氮源及微量元素。進一步利用正交實驗設計法，分別以化合物B和化合物C的產量為指標，優(yōu)選出各自合適的培養(yǎng)基配比，得到各自培養(yǎng)基的優(yōu)勢配方。當前80頁，總共96頁。●單因素實驗設計(碳源、氮源及微量元素的選擇)●正交實驗設計（研究碳源、氮源以及微量元素之間的交互作用）●發(fā)酵過程的影響因素及其控制（從發(fā)酵周期、淀粉酶、裝液量、轉速、接種量、消泡劑等方面來考察）當前81頁，總共96頁。單因素實驗設計結果1、發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的選擇由圖可見，糊精和甘油作為新碳源，相較原始培養(yǎng)基的碳源葡萄糖和玉米淀粉，四者化合物B的效價未見顯著差異。因此，選用糊精、甘油、葡萄糖、玉米淀粉作為候選碳源進行下一步的分析比較。當前82頁，總共96頁。2、發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的選擇由圖可見，只有蛋白胨作為新氮源，相較原始培養(yǎng)基的氮源黃豆餅粉和酵母粉，三者化合物B的效價未見顯著差異。因此，選用蛋白胨、黃豆餅粉、酵母粉作為候選氮源進行下一步的分析比較。當前83頁，總共96頁。3、發(fā)酵培養(yǎng)基微量元素的選擇

由圖可見，NH4Cl和MgSO4作為新微量元素，相較原始培養(yǎng)基的微量元素NaCl和KH2PO4，四者化合物B的效價未見顯著差異。因此，選用NH4Cl、MgSO4、NaCl、KH2PO4作為候選微量元素進行下一步的分析比較。當前84頁，總共96頁。正交實驗設計結果因素黃豆餅粉酵母粉蛋白胨葡萄糖甘油玉米淀粉糊精氯化銨氯化鈉磷酸二氫鉀硫酸鎂110.50.5111100.500232233330.120.10.1第一次正交設計因素水平表L12(211)（%）因素黃豆餅粉酵母粉葡萄糖甘油玉米淀粉糊精氯化鈉磷酸二氫鉀硫酸