金銀花中綠原酸的提取及檢測-烏蘭(完整版)實(shí)用資料

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下,隨著球磨時(shí)間的增加,其剪切應(yīng)力顯著下降。金銀花中綠原酸的提取及檢測_烏蘭（完整版）實(shí)用資料(可以直接使用，可編輯完整版實(shí)用資料，歡迎下載）用冪方程τ=kγm(其中k為稠度系數(shù);m為流動(dòng)特征指數(shù)對(duì)曲線進(jìn)行擬合,結(jié)果如表2所示。由擬合結(jié)果可知,在不同溫度下,相關(guān)系數(shù)R2在0.9850~0.9993之間,這說明方程與曲線有較好的相關(guān)性。同一樣品的稠度系數(shù)k隨著溫度的升高而減小,說明溫度升高可以減小體系的稠度,增強(qiáng)淀粉糊的流動(dòng)性。在同一溫度下隨著球磨時(shí)間的增加,稠度系數(shù)k顯著下降,流動(dòng)指數(shù)m則是呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),說明球磨后的綠豆淀粉更趨近于牛頓流體。3結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,機(jī)械球磨方法可以有效地將綠豆淀粉非晶化,球磨一定時(shí)間后淀粉顆粒的偏光十字消失,X-射線衍射曲線的尖峰衍射特征逐漸減弱,綠豆淀粉顆粒的結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。球磨處理后綠豆淀粉糊的流變特性在不同濃度和溫度下發(fā)生了變化,綠豆淀粉糊隨著球磨時(shí)間的延長稠度系數(shù)k不斷減小,而流動(dòng)特征指數(shù)m則不斷增大,說明球磨處理后綠豆淀粉糊趨向于牛頓流體的特征。參考文獻(xiàn):[1]ShinjiTamaki,MakotoHismatsu,KatsunoriTeranishi,etal.Structuralchangeofmaizestarchgranulesbyball-milltreatment[J].Starch,1998,50(8:342-348.[2]ShinjiTamaki,MakotoHisamatsu,KatsunoriTeranishi,etal.Structuralchangeofpotatostarchgranulesbyball-milltreatment[J].Starch,1997,49(11:431-438.[3]胡飛,陳玲,李琳.馬鈴薯淀粉顆粒在微細(xì)化過程中結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化[J].精細(xì)化工,2002,19(2:114-117.[4]ShermanP.Foodtextureandrheology[M].NewYork:Aca-demicPress,1979.[5]PrenticeJH.Measurementsintherheologyoffoodstuffs[M].London:ElsevierAppliedSciencePublishers,1984.[6]胡飛,李平凡,陳玲.微細(xì)化馬鈴薯淀粉流變性質(zhì)的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2002,(7:41-43.[7]二國二郎.淀粉科學(xué)手冊(cè)[M].王微青,等,譯.北京:輕工業(yè)出版社,1990.31-43,163-167.[8]MohdNurulIMuhd,AzemiBMN,MananDMA.Rheo-logicalbehaviourofsago(Metroxylonsagustarchpaste[J].FoodChemistry,1999,64:501-505.收稿日期:2004-07-14*通訊作者基金項(xiàng)目:天津市教委科研項(xiàng)目(20039902作者簡介:烏蘭(1976-,女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、天然產(chǎn)物開發(fā)。金銀花中綠原酸的提取及檢測烏蘭,張澤生*(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津300222摘要:采用多種方法分別從金銀花中提取綠原酸,用紫外光譜法和高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析。同時(shí)用金銀花乙醇提取物對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抗菌試驗(yàn)。綠原酸提取試驗(yàn)結(jié)果表明:用70%乙醇熱回流提取是金銀花中綠原酸提取的最佳方法,獲得綠原酸的提取率高于其他方法,提取終產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品的最高吸收峰均在324nm處,終產(chǎn)物中綠原酸的含量為43.35%?？咕囼?yàn)結(jié)果表明:金銀花提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性。關(guān)鍵詞:金銀花;綠原酸;提取;檢測;抗菌活性ExtractionandExaminationofChlorogenicAcidfromFlosLoniceraeWULan,ZHANGZe-sheng*(FoodEngineeringandBiologyTechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300222,ChinaAbstract:OptimizationoftheextractingmethodofchlorogenicacidfromFlosLoniceraewasstudiedbyseveraldifferentmethods.TwodifferentwaysofUltraviolet(UVandVisibleSpectrophotometrandHighPerformanceLiquidChromatography(HPLChavebeencarriedoutforthequantitativeandqualitativedeterminationofchlorogenicacidinFlosLonicerae.InhibitiontestagainstpathogenicbacteriahasbeendonewithFlosLoniceraeethanolandchlorogenicacid.Theresultsofchlorogenicacidextractionshowedthatchlorogenicacidtiptopabsorb-apexwas324nm,withethanolof70%concentrationextractionwasremarkablysuperiortoothermethods.Thecontentofchlorogenicacidwith70%ethanolextractionwas43.35%,sotheethanolwith70%concentrationextractionwastheoptimumcondition.TheantibacterialactionofchlorogenicacidinvitroonEscherichiaColiandextractedwith70%ethanolfromFlosLoniceraeshowedthatFlosLoniceraehadstrongantimicrobialactivity.Keywords:FlosLonicerae;chlorogenicacid;extraction;examination;antimicrobialactivity中圖分類號(hào):TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1002-6630(200505-0130-05金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae忍冬屬(Lonicera植物忍冬(Lonicerajaponicathunb及同屬多種植物的干燥花蕾,它是一種“藥食同源”的綠色植物,是臨床常用的中藥之一。近代研究一般認(rèn)為金銀花的生物活性有效成分為綠原酸類化合物,并且常以綠原酸含量的高低來評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的優(yōu)劣[1]。綠原酸具有顯著的清熱解毒、抗菌消炎和抗衰老作用;對(duì)消化道的癌癥有明顯的抑制作用;還具有抗生育作用及對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用;綠原酸還具有增香和護(hù)色作用,可用于食品和果品保鮮。綠原酸是含有羧基和鄰二酚羥基的有機(jī)酸,易溶于水、醇溶液和丙酮等溶劑。目前,從金銀花中提取綠原酸多采用水煎法、水提醇沉、稀醇回流法、動(dòng)態(tài)浸提法、超聲波法和滲漉法等,國內(nèi)學(xué)者對(duì)綠原酸不同提取工藝的評(píng)價(jià)仍存在分歧,但多數(shù)認(rèn)為乙醇回流法較好。為進(jìn)一步優(yōu)化乙醇回流法的提取工藝,本文進(jìn)行了金銀花中綠原酸的提取試驗(yàn),并采用紫外分光光度法及《中華人民共和國藥典》(2000年版要求采用高效液相色譜法(HPLC等作了相應(yīng)的含量測定,以及經(jīng)典的生物檢測法[2,3]對(duì)金銀花提取物的生物活性進(jìn)行檢測。1材料與方法1.1材料1.2實(shí)驗(yàn)方法對(duì)金銀花中綠原酸定性定量的測定有顏色反應(yīng)法、容量法、極譜法、比色法、紫外分光光度法、三波長分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法、紙層析—比色法、紙層析—紫外分光光度法、薄層光密度法、薄層層析—紫外分光光度法、薄層掃描法、氣相層析法、GC-MC法、高效液相色譜法(HPLC及生物檢測法。本試驗(yàn)采用紫外分光光度法及高效液相色譜(HPLC法,以及經(jīng)典的生物檢測法——管碟法對(duì)金銀花提取物的生物活性進(jìn)行檢測。(1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg,用30%甲醇溶解并定容于50ml容量瓶中。再準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00ml分別于10ml比色管中,用30%甲醇溶液定容。取0.05mol/L的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)于200~500nm掃描。然后選取最大吸收波長分別測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值,以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L為橫坐標(biāo),以其吸光度值(OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2綠原酸含量的測定將不同提取工藝所得供試品各取1ml用30%的甲醇溶液定容至1000ml;在324nm處測其吸光度值,以計(jì)算其中綠原酸的含量及提取率。綠原酸含量=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得含量/原金銀花質(zhì)量綠原酸提取率=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得含量/原金銀花中綠原酸總含量(1分析條件柱:Lab[250mm×4.5mm,C18]分析柱,流動(dòng)相為乙腈:檸檬酸緩沖溶液:水(10:20:70,流速為1.0ml/min,室溫,進(jìn)樣量為20μl,檢測波長為324nm。(2對(duì)金銀花中綠原酸的定性分析本試驗(yàn)利用HPLC在相同色譜條件下,將標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖與樣品色譜圖進(jìn)行對(duì)照,根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的綠原酸等活性物質(zhì)。(3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以不同質(zhì)量濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各20μl分別進(jìn)樣,測定其峰面積。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L為橫坐標(biāo),以與其相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再取不同工藝條件提取的待測液用同樣方法測定其峰面積以求出綠原酸含量。本試驗(yàn)采用測量抗生素效價(jià)的牛津杯法對(duì)金銀花提取物進(jìn)行效價(jià)的測定。牛津杯法(又稱管碟法是利用抗生素在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用,將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知濃度的樣品在含有敏感性實(shí)驗(yàn)菌的營養(yǎng)瓊脂表面進(jìn)行擴(kuò)散滲透,由于抗生素對(duì)被試菌的抑制作用而產(chǎn)生透明抑菌圈,抑菌圈的大小和抗生素的濃度之間有一定的比例,從而確定抗生素效價(jià)的一種方法。這個(gè)方法是利用抗生素可以抑制敏感菌的特點(diǎn),既符合臨床使用的實(shí)際情況,而且靈敏度高,又不需要特殊設(shè)備,因此被國際公認(rèn)。本試驗(yàn)采用管碟法對(duì)綠原酸的最低抑菌濃度(MIC進(jìn)行了測定,利用大腸桿菌(EscherichiaColiG+作為敏感試菌。具體方法如下:無菌操作。取10ml瓊脂培養(yǎng)基于直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿中,鋪勻,待凝固后,放入兩個(gè)牛津杯;取含有活菌數(shù)為106~108/ml的半固體培養(yǎng)基10ml,加到裝有牛津杯的培養(yǎng)皿中,鋪勻,待凝固后,拔出牛津杯;在其中一個(gè)杯孔中加入50μl不同工藝條件提取的、一系列濃度梯度的金銀花提取液或綠原酸純品;另一個(gè)孔作空白對(duì)照以便觀察所接菌的生長情況,37℃培養(yǎng)24~48h后,觀察抑菌圈的大小和透明度,相同條件作三個(gè)平行;恰好沒有抑菌圈出現(xiàn)的培養(yǎng)皿所用的溶液濃度為最小抑菌濃度(MIC。將稀釋一系列的慶大霉素也用上述步驟作陽性對(duì)照試驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1紫外分光光度法對(duì)綠原酸含量的測定將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0.05mol/L,用紫外分光光度計(jì)于200~500nm掃描,如圖1所示,綠原酸的最大吸收峰在波長為324nm處,故選取324nm。分別測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。求得線性回歸方程為Y=57.497x+0.0482,R2=0.9999,說明本方法在綠原酸的質(zhì)量濃度為0.005~0.03g/L時(shí)具有良好的線性。在不同工藝條件對(duì)金銀花的提取液在324nm測其吸光度值經(jīng)過公式計(jì)算結(jié)果如圖3。根據(jù)用紫外分光光度法測定綠原酸的含量、提取率與成本來看,應(yīng)選取70%乙醇進(jìn)行對(duì)綠原酸的提取,提取率可達(dá)96.81%,終產(chǎn)物中綠原酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為43.35%。2.2用高效液相色譜法(HPLC對(duì)金銀花中綠原酸的檢測對(duì)金銀花提取液中是否含有綠原酸進(jìn)行定性分析,標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖4所示,樣品則選取了70%乙醇提取液進(jìn)行譜圖繪制,如圖5。根據(jù)圖4、圖5表明檢測物均在10.211min處出現(xiàn)最大吸收峰,可以初步斷定兩種物質(zhì)為同一化合物。綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。求得線性回歸方程為Y=1.0066×108x+8530000,R2=0.9985,說明本方法在綠原酸的質(zhì)量濃度為0.005~0.025g/L時(shí)具有良好的線性。用不同工藝條件提取的待測液每次進(jìn)樣20μl,測其峰面積以求出綠原酸含量結(jié)果如圖7所示。從結(jié)果可以看出,紫外分光光度法測定的結(jié)果含量往往較高,重現(xiàn)性不好。而用高效液相色譜法測定的結(jié)果較穩(wěn)定,偏差小。根據(jù)以上的不同檢測結(jié)果可以看出,紫外分光光度法與高效液相色譜法得出的結(jié)果趨勢(shì)一致,故在提取綠原酸時(shí)應(yīng)選取70%乙醇作為提取溶劑,用HPLC測的綠原酸的提取率為85.63%。2.3生物檢測法測定金銀花提取物的最低抑菌濃度(MIC本試驗(yàn)采用管碟法對(duì)不同提取工藝得到的金銀花提取物和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的最低抑菌濃度(MIC進(jìn)行了測定,并設(shè)陰性對(duì)照與陽性對(duì)照(慶大霉素1.0g/L。結(jié)果如表1。樣品MIC(g/L水提取0.87060%乙醇提取0.90070%乙醇提取0.83580%乙醇提取1.000綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品1.110慶大霉素0.750表1不同工藝條件提取的綠原酸及綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的最低抑菌濃度(MICTable1ResultsofdistillsolutionantimicrobialactivityofMIC根據(jù)以上結(jié)果表明:(1金銀花中所含綠原酸并非唯一抑菌成分,其它成分也有抑菌作用,有待于進(jìn)一步研究;(2確定了金銀花中綠原酸提取的最佳工藝為:70%乙醇提取。本試驗(yàn)又比較了70%乙醇提取液和慶大霉素的抑菌圈,從中可以看出,0.8g/L的慶大霉素與1.0g/L的70%乙醇提取液效果相當(dāng)(圖8、圖9。慶大霉素,雖對(duì)大腸桿菌具有強(qiáng)抑菌作用,但它對(duì)人體有腎毒性、耳毒性、過敏反應(yīng)等,而金銀花提取液的毒副作用還未見文獻(xiàn)報(bào)道,又因?yàn)榻疸y花來源豐富、價(jià)格低廉,所以金銀花與慶大霉素等比較,在臨床應(yīng)用上更為安全、方便,可供臨床選用防治大腸桿菌等感染的參考[4]。3討論3.1在金銀花的提取中,采用70%乙醇提取能有效提取出金銀花中的綠原酸,純度較高。且金銀花中的有效成分以綠原酸為指標(biāo),再根據(jù)其生物有效性來看,應(yīng)選取70%乙醇提取。3.2在綠原酸的檢測中,紫外分光光度法所測結(jié)果與高效液相所測結(jié)果相比偏差較大,但趨勢(shì)相同,故檢測綠原酸應(yīng)采用高效液相法為佳。3.3抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,金銀花的提取物具有很好的體外抑菌作用,對(duì)臨床有指導(dǎo)意義,而且說明提取物中除綠原酸以外還存在其它較強(qiáng)的抑菌物質(zhì),有待于對(duì)其它成分的進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn):[1]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(第一部[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2000.177.[2]杜連祥,等.工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].科學(xué)技術(shù)出版社,1992.[3]鄔行彥,熊宗貴,胡章助.抗生素生產(chǎn)工藝學(xué)[M].化學(xué)工業(yè)出版社,1987.[4]戴自英.臨床抗菌藥物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1985.219-223.efefefef信息efefefeffef2021年11月Vol.30No.11November2021ChineseJournalofChromatography1166~1171研究論文*通訊聯(lián)系人:潘家榮,博士,教授,研究方向?yàn)槭称钒踩?E-mail:panjr@263.net.基金項(xiàng)目:國家科技支撐計(jì)劃課題(2021BAK10B04.收稿日期:2021-06-28全二維氣相色譜-四極桿質(zhì)譜法檢測植物油脂中脂肪酸鄭月明1,2,馮峰2,國偉2,儲(chǔ)曉剛2,潘家榮1,3*,賈瑋2(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京100193;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京100123;3.中國計(jì)量學(xué)院,浙江杭州310018摘要:建立了植物油脂中31種脂肪酸成分的全二維氣相色譜-四極桿質(zhì)譜(GC×GC-qMS分析方法。樣品經(jīng)甲酯化衍生后,以DB-1柱(30m×0.25mm×0.25μm作為一維柱、DB-Wax柱(3.2m×0.1mm×0.1μm作為二維柱組成柱系統(tǒng)進(jìn)行分離,在調(diào)制周期為3.5s、四極桿質(zhì)量掃描范圍為m/z40~350的條件下,植物油脂中31種脂肪酸成分可以在50min內(nèi)得到準(zhǔn)確和靈敏的檢測。將本方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析,靈敏度較傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜法提高了100倍以上,一些植物油中微量的脂肪酸成分也因此被檢出。該研究不僅為植物油中脂肪酸成分的分析提供了新的技術(shù)手段,同時(shí)對(duì)于確保食用植物油的質(zhì)量安全、消除食用植物油的摻假偽劣等均有重要意義。關(guān)鍵詞:全二維氣相色譜-四極桿質(zhì)譜;脂肪酸;植物油中圖分類號(hào):O658文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1000-8713(202111-1166-06Determinationoffattyacidsinvegetableoilsusingcomprehensivetwo-dimensionalgaschromatographycoupledtoquadropolemassspectrometryZHENGYueming1,2,FENGFeng2,GUOWei2,CHUXiaogang2,PANJiarong1,3*,JIAWei2(1.InstituteofAgro-FoodProductProcessingScienceandTechnology,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100193,China;2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100123,China;3.ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,ChinaAbstract:Comprehensivetwo-dimensionalgaschromatographywithquadropolemassspectrome-try(GC×GC-qMSwasappliedtothedetectionof31fattyacidsinvegetableoils.Thesetsofcol-umns,modulationperiod,scanrangeofquadropolemassspectrometerwereoptimized.Theresultsdemonstratedthattheseparationwasachievedin50minwiththecolumnsetofDB-1(30m×0.25mm×0.25μmasthe1stcolumnandDB-Wax(3.2m×0.1mm×0.1μmasthe2ndcolumn.Allfattyacidswereaccuratelyandsensitivelydeterminedwhilethemodulationperiodwas3.5sandthescanrangeofquadropoleMSwasm/z40-350.MostofthefattyacidswereidentifiedbyNISTlibraryspectrasearch,theotherfattyacidisomerswereidentifiedbysinglestandardinjec-tionanalysis.Whenapplyingthismethodtotherealvegetableoilsamples,notonlythesensitivi-tieswere100timeshigherthanthoseobtainedwithGC-qMSmethods,butalsosomeminorfattyacidswereidentified.Thisworksuggestedanewtechnicalapproachinanalyzingfattyacidcompo-nentsinvegetableoils,whichismeaningfultoprohibitadulterationandensuringthequalitysafetyofediblevegetableoils.Keywords:comprehensivetwo-dimensionalgaschromatography-quadropolemassspectrometry(GC×GC-qMS;fattyacids;vegetableoils植物油是人類膳食的重要組成成分,其主要成分是由一分子甘油和三分子脂肪酸合成的甘油三酸酯,另外還有少許游離脂肪酸。研究表明,植物油中的脂肪酸種類及含量對(duì)人體健康有重要影響[1]。由第11期鄭月明,等:全二維氣相色譜-四極桿質(zhì)譜法檢測植物油脂中脂肪酸于不同種類的植物油以及同一種類但來自于不同產(chǎn)地或是不同采收期的植物油所含脂肪酸種類、含量也都有一定差異[2,3],因此建立植物油中脂肪酸組成和含量的分析方法,獲取不同種類食用植物油的特征脂肪酸標(biāo)識(shí)物,對(duì)于確保食用植物油的質(zhì)量安全,消除食用植物油的摻假偽劣等都有重要意義。針對(duì)植物油中的脂肪酸成分分析已經(jīng)有一些方法報(bào)道,例如氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[4-6]。這些方法在對(duì)植物油中常見的高含量脂肪酸成分的分析中發(fā)揮了較大的作用,但是由于植物油中的脂肪酸成分復(fù)雜,且有許多脂肪酸的含量較低,使用上述方法可能無法對(duì)植物油中的所有脂肪酸進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和定量。近年來,全二維氣相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(GC×GC-TOFMS由于其高峰容量、高分離度及高靈敏度而受到廣大分析工作者的重視,其在復(fù)雜基質(zhì)成分分析等領(lǐng)域也已經(jīng)顯示了明顯的優(yōu)越性[7-9]。但采用全二維氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(GC×GC-qMS進(jìn)行植物油中脂肪酸成分分析的研究尚未見報(bào)道。本研究建立了植物油中脂肪酸成分的GC×GC-qMS定性定量分析方法,一些植物油中微量的脂肪酸成分也得到了識(shí)別。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器、試劑與材料QP2021UltraGC×GC-MS儀(日本,島津公司配冷噴調(diào)制器ZX1(美國Zoex公司,一維數(shù)據(jù)采集由GC-MSsolution2.5軟件完成,二維數(shù)據(jù)采集由GCImageR2.2完成。37種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司;甲醇和正己烷(HPLC級(jí),Fisher公司;13%~15%三氟化硼甲醇溶液(上海安普科學(xué)儀器;正庚烷、無水Na2SO4(500℃灼燒4h,置于干燥器中備用(天津市化學(xué)試劑一廠。所用試劑除特別標(biāo)注外,均為分析純。0.45μm聚四氟乙烯(PTFE膜(Waters公司。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:取500μL質(zhì)量濃度為10g/L的混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液用正己烷定容至5mL,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,密封后置于4℃保存?；ㄉ?、玉米油、葵花油、大豆毛油、橄欖油、橄欖葵花油,市售。1.2色譜-質(zhì)譜條件一維色譜柱:DB-1(30m×0.25mm×0.25μm(REXTEK,美國;二維色譜柱:DB-Wax(3.2m×0.1mm×0.1μm(Agilent,美國。進(jìn)樣口溫度250℃;恒線速度操作模式;進(jìn)樣量為1μL,分流比10∶1;程序升溫:140℃保持5min,以4.5℃/min升溫至200℃,再以1.5℃/min升溫至240℃保持10min;離子源溫度230℃;電離能量70eV;檢測器電壓0.98kV;接口溫度250℃;質(zhì)量掃描范圍m/z40~350;冷氣流量7L/min,熱氣溫度370℃;調(diào)制周期3.5s;熱噴時(shí)間350ms。1.3脂肪酸的衍生化處理植物油中脂肪酸的衍生參考脂肪酸檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行,簡述如下:準(zhǔn)確稱取0.100g植物油置于100mL平底燒瓶中,加入8mL20g/L氫氧化鈉-甲醇溶液,連接回流冷凝器,80℃水浴直至油滴消失;加入三氟化硼甲醇溶液7mL,繼續(xù)水浴回流2min后用去離子水沖洗冷凝器。將平底燒瓶取出水浴鍋并冷卻至室溫后,準(zhǔn)確加入10mL正庚烷并振搖2min,再加入飽和氯化鈉溶液,靜置分層,取適量上清液加入4g無水硫酸鈉,振蕩1min后靜置5min,取上層清液稀釋適當(dāng)倍數(shù),經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾待測。2結(jié)果與討論2.1GC×GC-MS條件優(yōu)化2.1.1色譜柱的選擇GC×GC-MS的色譜柱系統(tǒng)由2根具有不同極性的氣相色譜柱通過一個(gè)冷噴調(diào)制器連接而成,這種組合使得分析物可以同時(shí)按沸點(diǎn)和極性兩方面性質(zhì)的差異獲得分離,因而有效地提高了整個(gè)色譜系統(tǒng)的峰容量和分離度。同時(shí)由于冷噴調(diào)制器的冷凍聚焦作用,使得分析物的色譜峰變得尖銳,從而提高了靈敏度[11]。為了獲得最大的峰容量和分離度,本研究對(duì)GC×GC-MS中的色譜柱系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化,由于化合物在經(jīng)過二維氣相色譜柱的時(shí)間必須要小于冷噴調(diào)制器的一個(gè)工作周期,所以二維色譜柱一般選用柱長較短的極性色譜柱。本研究選擇DB-Wax作為二維色譜柱,該色譜柱以聚乙二醇為固定相,可根據(jù)化合物的極性不同從而達(dá)到較好的分離。本研究主要選用了3種一維色譜柱進(jìn)行對(duì)比分析,以確定最優(yōu)柱系統(tǒng)。首先考察了與DB-Wax極性有明顯差異的DB-1型非極性色譜柱和Rxi-5sil型弱極性色譜柱(二者均為30m×0.25mm×0.25μm,REXTEK,美國對(duì)脂肪酸成分的分離效果。結(jié)果表明,一維柱為Rxi-5sil時(shí)的分離效果要明顯差于一維柱為DB-1時(shí)的分離效果。圖1為C18和C20類脂肪酸在上述2個(gè)色譜柱系統(tǒng)上的分離譜圖。在此基礎(chǔ)上,又比較了DB-1型色譜柱(長度均為30m,內(nèi)徑0.25mm固定相涂層的厚度對(duì)脂肪·7611·色譜第30卷酸分離的影響,結(jié)果表明盡管1μm膜厚的分離效果稍優(yōu)于0.25μm膜厚的分離效果,但柱流失嚴(yán)重,易干擾微量脂肪酸成分的分析,因此,本研究最終確定的柱系統(tǒng)中一維柱使用0.25μm膜厚的DB-1氣相色譜柱,二維柱使用DB-Wax型色譜柱進(jìn)行油脂中脂肪酸的分析。圖1不同柱系統(tǒng)下脂肪酸甲酯的分離情況Fig.1Separationoffattyacidmethylestersbydifferentcolumnsystems1Dcolumn:DB-1orRxi-5sil(30m×0.25mm×0.25μm;2Dcolumn:DB-Wax(3.2m×0.1mm×0.1μm;GCtemperatureprogram:140℃for5min,riseto200℃at4.5℃/min,200-240℃at1.5℃/min,holdat240℃for10min;injectortemperature:250℃;ionsourcetemperature:230℃;MStransferline:250℃;electronionization:70eV;scanrangeofm/z:40-350;injectvolume:1μL;splitratio:10∶1;modulationperiod:3.5s;hotpulse(370℃:350ms;liquidN2flow:7L/min.1.C18∶3n6;2.C18∶3n3;3.C18∶2n6c;4.C18∶2n6t;5.C18∶1n9c;6.C18∶1n9t;7.C18∶0;8.C20∶5n3;9.C20∶4n6;10.C20∶3n6;11.C20∶3n3;12.C20∶2;13.C20∶1;14.C20∶冷噴調(diào)制器參數(shù)優(yōu)化冷噴調(diào)制器是二維色譜的核心部件,其中包含冷噴氣和熱噴氣兩路氣體,分析物從第一根色譜柱流出,經(jīng)冷噴氣低溫聚焦后再由熱噴氣高溫脫附釋放到第二根色譜柱中。在二維色譜運(yùn)行過程中,冷噴氣持續(xù)釋放,熱氣脈沖式噴射,前后兩次熱噴之間的時(shí)間稱為調(diào)制周期(Pm,每次熱氣釋放的時(shí)間稱為熱噴時(shí)間[12]。冷噴氣的流速對(duì)于不同化合物有所不同,此處溫度需低于化合物流出溫度120~140℃方可達(dá)到捕集聚焦效果,對(duì)于碳數(shù)為4~40的化合物來說,其所需冷氣量隨碳數(shù)增加逐漸降低,一般為15.5~1.5L/min[13]。通過觀察本研究中的目標(biāo)分析物在不同冷氣量條件下的一維色譜峰是否被切開,確定冷氣量為7L/min。調(diào)制周期時(shí)間對(duì)目標(biāo)分析物在二維色譜上的信號(hào)強(qiáng)度和分離情況有重要的影響,過短的調(diào)制周期時(shí)間會(huì)導(dǎo)致一個(gè)化合物被分割在多個(gè)調(diào)制周期從而導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度降低,另外可能使二維保留時(shí)間超過調(diào)制周期的化合物在下一個(gè)周期與下一個(gè)周期的化合物共流出;過長的調(diào)制周期會(huì)降低一維色譜的切割次數(shù)使其不足3次,降低一維色譜的分辨率。圖2為不同調(diào)制周期下棕櫚酸(C16∶0在二維色譜上的響應(yīng)情況。由圖2可以看出,調(diào)制周期為3s時(shí),其信號(hào)強(qiáng)度為另兩個(gè)調(diào)制周期(3.5s和4s的1/10;調(diào)制周期為3.5s和4s時(shí)棕櫚酸的信號(hào)強(qiáng)度盡管在同一個(gè)數(shù)量級(jí),但3.5s時(shí)信號(hào)強(qiáng)度更高些。另外18碳脂肪酸在3.5s調(diào)制周期下的分離情況較4s時(shí)的效果好(見圖3。因此,本研究的調(diào)制周期最終定為3.5s。對(duì)于熱噴時(shí)間,分別考察了250、300、350ms,其中350ms使得目標(biāo)物在一維色譜柱上基本不拖尾,即這段時(shí)間恰好將分析物釋放到二維色譜柱中,二維進(jìn)樣時(shí)間剛好合適?！?611·第11期鄭月明,等:全二維氣相色譜-四極桿質(zhì)譜法檢測植物油脂中脂肪酸圖2不同調(diào)制周期時(shí)間下棕櫚酸甲酯(C16∶0在二維色譜上的色譜圖Fig.2SliceprofileofGC×GCofpalmiticacidmethylester(C16∶0underdifferentmodulationperiods(Pm1Dcolumn:DB-1;2Dcolumn:DB-Wax.OtherconditionsasinFig.1.圖3不同調(diào)制周期下18碳脂肪酸的二維色譜圖Fig.3GC×GCcontourplotsoffattyacidchainswith18carbonsunderdifferentmodulationperiods1Dcolumn:DB-1;2Dcolumn:DB-Wax.OtherconditionsasinFig.質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍的確定為了對(duì)植物油中所有可能存在的脂肪酸進(jìn)行識(shí)別和檢測,需要采用全掃描模式進(jìn)行分析。由于二維色譜峰非常窄,一般為0.1~0.6s,為增加定性定量的準(zhǔn)確度和靈敏度,需要使用盡可能高的掃描頻率。四極桿型質(zhì)譜檢測器掃描的質(zhì)量范圍大小與掃描頻率成反比,為提高掃描頻率,需要選擇盡量窄的質(zhì)量范圍?？紤]到植物油中的脂肪酸甲酯通常含有質(zhì)荷比為41、43的離子,且響應(yīng)較高,為保證譜圖的完整性,起始掃描質(zhì)荷比需設(shè)為40;對(duì)于掃描質(zhì)荷比的上限,盡管本研究使用的37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的最大質(zhì)量數(shù)為24個(gè)碳原子的脂肪酸,但植物油中的脂肪酸一般為10~22個(gè)碳原子[14],質(zhì)量數(shù)在350以內(nèi),因此對(duì)于混合標(biāo)準(zhǔn)品中大于22個(gè)碳原子的脂肪酸(C23∶0,C24∶0,C24∶1,本研究未作檢測,僅選擇350為掃描的最大質(zhì)荷比。在上述質(zhì)量范圍內(nèi),當(dāng)設(shè)定四極桿的掃描速率為20000amu/s時(shí),掃描頻率可達(dá)33.3Hz,此時(shí)一個(gè)二維峰包含9~12個(gè)點(diǎn),保證了化合物的準(zhǔn)確定性定量。此外,根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn),本研究使用的溶劑為正庚烷,如果要檢測37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品中小于10個(gè)碳原子數(shù)的3種脂肪酸(C4∶0,C6∶0,C8∶0,必須要降低并延長起始溫度的時(shí)間,而植物油中幾乎不含小于10個(gè)碳原子數(shù)的脂肪酸,因此不檢測這3種脂肪酸并不影響對(duì)植物油中脂肪酸的分析。圖4即為優(yōu)化條件下剩余的31種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(C10~C22的二維色譜圖。圖4脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的二維色譜圖Fig.4GC×GCcontourplotofmixedfattyacidmethylesterstandards1Dcolumn:DB-1;2Dcolumn:DB-Wax.OtherconditionsasinFig.1.2.2靈敏度的比較為了考察GC×GC-qMS相對(duì)于傳統(tǒng)的GC-MS的靈敏度,本研究比較了優(yōu)化條件下脂肪酸甲酯在GC×GC-qMS和GC-MS上信噪比的差異。其中圖·9611·色譜第30卷5a為肉豆蔻酸在一維色譜上的響應(yīng)情況,圖5b為肉豆蔻酸在二維色譜時(shí)的響應(yīng)情況。肉豆蔻酸在二維色譜上被調(diào)制成3個(gè)碎片峰,其信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度比一維色譜提高了20倍以上,信噪比則比一維色譜提高了100倍以上。圖5肉豆蔻酸甲酯(C14∶0在(a一維色譜和(b二維色譜上的靈敏度Fig.5Sensitivitiesofmyristicacidmethylester(C14∶0on(aGC-MSand(bGC×GC-qMS表1不同植物油樣品中脂肪酸的含量Table1Contentsoffattyacidsindifferentvegetableoils%FattyacidBeanoilCornoil1Cornoil2Sunfloweroil1Sunfloweroil2Oliveoil1Oliveoil2Oliveoil3OlivesunflowerblendoilC14∶0(肉豆蔻酸0.06-------0.17C15∶0(十五烷酸--------0.07C16∶0(棕櫚酸11.7013.0212.725.766.0616.8011.3410.198.10C16∶1(棕櫚油酸-----1.2570.7300.5870.20C17∶0(十七烷酸0.13-------0.14C17∶1(十七烯酸--------0.08C18∶0(硬脂酸3.991.831.965.775.672.043.903.409.11C18∶1n9c(油酸20.0831.5630.4321.3222.1564.7075.5977.0231.49C18∶1n7c(異油酸1.300.710.800.550.533.202.452.301.15C18∶2n6c(亞油酸53.5352.0052.9965.5264.6410.885.055.5346.51C18∶3n6(γ-亞麻酸0.070.060.09--0.05---C18∶3n3(α-亞麻酸8.500.450.63--0.520.630.73-C20∶0(花生酸0.350.380.370.280.280.450.310.230.82C20∶1(花生烯酸--------0.38C20∶3n6(11,14,17-順-二十碳三烯酸--------0.11C20∶3n3(8,11,14-順-二十碳三烯酸--------0.10C22∶0(山芋酸0.27--0.350.60---1.57Saturatedfattyacid(飽和脂肪酸16.5115.2315.0612.6212.6819.2915.5413.8219.98Monounsaturatedfattyacid21.3932.2731.2321.8622.6868.2678.7879.9133.30(單不飽和脂肪酸Polyunsaturatedfattyacid62.1152.5253.7265.5264.6411.465.686.2646.72(多不飽和脂肪酸-:notdetected.2.3定性和定量分析方法本研究中31種脂肪酸的定性,主要通過將標(biāo)準(zhǔn)品二維譜圖中各峰點(diǎn)質(zhì)譜圖導(dǎo)入NIST譜庫檢索的方式而實(shí)現(xiàn);對(duì)于譜圖接近、無法識(shí)別的幾種順式/反式異構(gòu)體種類,則是通過單一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣的方式進(jìn)行判定。結(jié)果表明本研究所檢測的31種脂肪酸都得到了較好的分離,未發(fā)現(xiàn)在二維色譜上出現(xiàn)重組的現(xiàn)象。由于本研究旨在確定不同油脂中脂肪酸組成的差異,所以無須對(duì)脂肪酸的絕對(duì)含量進(jìn)行確定?？紤]到目標(biāo)化合物為同系物,其在質(zhì)譜上的響應(yīng)值相近,因此,可用面積歸一化法測定脂肪酸的相對(duì)含量。2.4實(shí)際樣品分析本研究選取市場上包括大豆油、玉米油、葵花油、橄欖油及橄欖葵花調(diào)和油等5種植物油進(jìn)行了定性定量分析(結(jié)果見表1。從表1可以看出,上述植物油均以不飽和脂肪酸為主要成分,但各成分含量差異顯著。橄欖油以油酸為主,含量高達(dá)64.70%~77.02%;大豆油、玉米油、葵花油以亞油酸為主,含量分別為52.00%~65.52%;5種油中除葵花油、橄欖葵花油外均含0.5%左右的亞麻酸,其中大豆毛油的亞麻酸含量較高,為8.50%。文獻(xiàn)[15]報(bào)·0711·１期第１鄭月明，等：全二維氣相色譜－四極桿質(zhì)譜法檢測植物油脂中脂肪酸·１１７１·道，亞麻酸是大豆毛油的豆腥味來源之一，本研究的結(jié)果進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。比較脂肪酸的組成和含量可以看出，上述５種植物油中橄欖葵花油的脂肪酸組成最為復(fù)雜。圖６即為橄欖葵花油樣品脂肪酸成分的二維色譜圖，在識(shí)別出的１５種脂肪酸當(dāng)除了傳統(tǒng)方法所能檢出的脂肪酸外，還檢出了中，）、８，１１，１４－順－二十碳三烯酸（０．１０％１１，１４，１７－順－）、）、二十碳三烯酸（十五烷酸（十七烷０．１１％０．０７％）、）酸（十七烯酸（等微量脂肪酸。０．１４％０．０８％樣品的脂肪酸分析檢測可以有效確保檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度。該方法可望在保障食品安全過程中發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)：［］：畢艷１ｉＹＬ．ＯｉｌＣｈｅｍｉｓｔｒ．ＢｅｉｉｎＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒＰｒｅｓｓ（Ｂｙｊｇｙ，蘭．油脂化學(xué)．北京：化學(xué)工業(yè)出版社）２００５［］２ｏｒｒｅｓＶａｚＦｒｅｉｒｅＬ，ＧｏｍｅｓｄａＳｉｌｖａＭＤＲ，ＣｏｓｔａＦｒｅｉｔａｓＡＴ－，Ｍ．ＡｎａｌＣｈｉｍＡｃｔａ２００９，６３３：２６３［］］：３ＮＮ．［ＭＳＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ．ＺｈｅｎｚｈｏｕＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＷＵｇｙ吳娜娜．［碩士學(xué)位論文］．鄭州：河南工業(yè)大Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（，學(xué)）２００８［］李雪４ｉＸＱ，ＬｉＨＨ，ＭｉａｏＸＬ．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏＬｇｙ（，（）：琴，黎海紅，苗笑亮．食品科技）２００８，３４３２５９［］，ｅ５ｕＨＱ，ＨｕａｎＸＬ，ＬｉｎＸＳｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＷｇ吳惠勤，黃曉蘭，林曉珊，等．分析化ＣｈｅｍｉｓｔｒＡｎａｌｔｉｃａｌｙ（ｙ，（）：學(xué)）２００７，３５７９９８［］６ｉａｎＮＮ，ＺｈａｎＬＸ，ＷａｎＸＬ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｇｇｇ梁楠楠，張良曉，王向利，等．分析化ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｙ（，（）：學(xué)）２０１１，３９８１１６６［］，７ｕｒｃａｒｏＧ，ＴｒａｎｃｈｉｄａＰＱ，ＤｕｏＰ，ｅｔａｌ．ＪＳｅＳｃｉ２０１０，Ｐｇｐ３３：２３３４圖６橄欖葵花調(diào)和油樣品的二維色譜圖Ｆｉ６ＧＣ×ＧＣｃｏｎｔｏｕｒｌｏｔｏｆｏｌｉｖｅｓｕｎｆｌｏｗｅｒｂｌｅｎｄｏｉｌｇ．ｐ２：：ｃｏｌｕｍｎＤＢ１；ＤｃｏｌｕｍｎＤＢ－Ｗａｘ．Ｏｔｈｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｓｉｎ１Ｄ－Ｆｉ１．ｇ．［］，，８ＩｎｄｒａｓｔｉＤ，ＣｈｅＭａｎＹＢ，ＭｕｓｔａｆａＳｅｔａｌ．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１０，１２２：１２７３［］９ｅｒｒｅｒｏＭ，ＩｂáｎｅｚＥ，ＣｉｆｕｅｎｔｅｓＡ，ｅｔａｌ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｒＡ，Ｈｇ２００９，１２１６：７１１０［］／１０ＢＴ２２２２３２００８Ｇ－［］１１ｏｓｔａｆａＡ，ＥｄｗａｒｄｓＭ，ＧｏｒｅｃｋｉＴ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｒＡ，２０１０．Ｍｇ：／．ｃｈｒｏｍａ．２０１２．０２．０６４１０．１０１６ｄｏｉｊ［］：１２ｕＧＷ．ＭｏｄｅｒｎＰｒａｃｔｉｃａｌＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｒａｈ．ＢｅｉｉｎＸｇｐｙｊｇ許國旺．現(xiàn)代實(shí)用氣相色譜法．北ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒＰｒｅｓｓ（ｙ，京：化學(xué)工業(yè)出版社）２００４：２４６［］，１３ａｉｎｅｓＲＢ，ＦｒｓｉｎｅｒＧＳ．ＪＳｅＳｃｉ２００４，２７：３８０Ｇｙｇｐ［］］：１４ｕａｎＹＹ．［ＭＳＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ．ＺｈｅｎｚｈｏｕＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔＨｇｇｙ黃月華．［碩士學(xué)位論文］ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏ．鄭州：河南工業(yè)大ｇｙ（，學(xué)）２０１０［］，，Ｗ鄒１５ｏｕＪＺｈａｏＷＪａｎＨＦ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎａＯｉｌｓａｎｄＦａｔｓ（Ｚｇ，（）：潔，趙維佳，汪海峰，等．中國油脂）２００９，３４４７３３結(jié)論本研究建立了植物油脂中脂肪酸成分的全二維氣相色譜－四極桿質(zhì)譜分析方法。相對(duì)于傳統(tǒng)的氣本方法的靈敏度提升了１相色譜－質(zhì)譜法，００倍以上。將本方法應(yīng)用于市售植物油樣品的檢測，不僅常規(guī)脂肪酸的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的方法相一致，而且一些微量的脂肪酸在部分樣品中被檢出。這表明，使用全二維氣相色譜－四極桿質(zhì)譜法進(jìn)行食用油脂收稿日期:2007-06-10基金項(xiàng)目:寧夏自治區(qū)科技攻關(guān)項(xiàng)目(06273;教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(03142作者簡介:楊敏麗(1965-,女,教授,博士,研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)的開發(fā)與應(yīng)用。金銀花中綠原酸的分離純化工藝研究楊敏麗,郝鳳霞(寧夏大學(xué)能源化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏銀川750021摘要:目的:對(duì)金銀花中的綠原酸的提取、分離工藝進(jìn)行研究。方法:綠原酸經(jīng)乙醇熱回流提取后,采用聚酰胺柱層析法進(jìn)行分離除雜,對(duì)主要工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果:將待分離的綠原酸粗品和聚酰胺(80~100目按物料比1:5裝入柱徑與柱長比為1:7的層析柱中,常壓下用10%的乙醇以最大流速洗脫至14倍柱體積,收集綠原酸含量較高(A322/A216≥0.9的流分,濃縮后得到純度為70%的綠原酸產(chǎn)品,經(jīng)重結(jié)晶后純度可提高到93%。結(jié)論:該工藝簡單、成本較低,適于工業(yè)化。關(guān)鍵詞:金銀花;綠原酸;聚酰胺柱層析;分離;純化StudyonIsolationandPurificationofChlorogenicAcidinFlosLoniceraeYANGMin-li,HAOFeng-xia(KeyLaboratoryofEnergySourcesChemicalEngineering,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,ChinaAbstract:Objecive:Tostudytheisolationandpurificationconditionsofchlorogenicacid(CAfromFlosLonicerae.Method:TheisolationandpurificationofCAwereachievedbypolyamidecolumnchromatographyandthemainisolationfactorswereoptimized.Results:Theoptimumisolationisasfollowing:therateofcrudeCAtopolymideis1:5,therateofdiametertolongis1:7,10%alcoholwashedathighspeedunderusualpressure,CAiscollectedbetweenthevolumeof5~14timesofcolumnvolume(A322/A216≥0.9,undertheconditions,theproductwithabove70%CAisobtained,whichcanbefurthercrystalledbyEtoAcandthepurityisenhancedto93%.Conclusion:Thismethodissimple,lowcost,andsuitabletobeusedinindustry.Keywords:FlosLonicerae;chlorogenicacid;polyamidecolumnchromatography;isolation;purification中圖分類號(hào):Q946.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1002-6630(200707-0255-05金銀花屬忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb的干燥花蕾或初開的花,是傳統(tǒng)的清熱解毒常用中藥[1],其主要活性成分為綠原酸。綠原酸是一種多酚類化合物,異名咖啡鞣酸,是植物在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的苯丙素類化合物[2]。綠原酸具有抗菌、抗病毒、止血、抗氧化、消除自由基、抑制突變和抗腫瘤等多種生物活性[3-5],在醫(yī)藥、衛(wèi)生等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用價(jià)值,因此,從植物中提取分離綠原酸具有重要的意義。目前,有關(guān)綠原酸的分離方法主要有沉淀法,萃取法,大孔樹脂法等[6-9],沉淀法簡單,但在堿性條件下,綠原酸易發(fā)生水解,得率低;萃取法產(chǎn)品質(zhì)量有所提高,但工序復(fù)雜,需大量有機(jī)溶劑;大孔樹脂法分離速度快,但除雜效果不理想,所得產(chǎn)物綠原酸含量較低。本實(shí)驗(yàn)以金銀花的花蕾為原料,采用乙醇熱回流法提取綠原酸,然后以聚酰胺為吸附劑,通過聚酰胺柱層析對(duì)粗提物進(jìn)行分離除雜,并對(duì)影響分離的主要工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化選擇,在優(yōu)化的工藝條件下,可得到純度為70%的綠原酸產(chǎn)品,經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶后,產(chǎn)品純度可提高到93%。該方法工藝簡單,成本低,可以為綠原酸的工業(yè)化提供參考。1材料與方法1.1材料與試劑金銀花采自寧夏固原市原州區(qū)。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純、磷酸(分析純天津化學(xué)試劑;乙醇(工業(yè)級(jí)寧夏銀川市好利頓酒業(yè);聚酰胺為80~100目浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠。1.2儀器玻璃層析柱Φ2.5×50cm上海滬試分析儀器有限工藝流程圖分離工藝正交試驗(yàn)法優(yōu)化了乙醇提取綠原酸的工藝,結(jié)果表明,當(dāng)乙醇濃度為70%,料液比為1:8,提取時(shí)間為3h,共提取三次時(shí),綠原酸的得率最高。在優(yōu)化的工藝條件下,將乙醇提取液過濾,濃縮,拌入聚酰胺,真空烘干,研磨,過篩,得粗品,經(jīng)聚酰胺柱層析分離,以產(chǎn)品得率和產(chǎn)品純度(綠原酸含量為指標(biāo),分別考察了聚酰胺目數(shù)、洗脫劑、物料比、柱徑與柱長比、流速、洗脫劑用量等影響因素,優(yōu)化出最佳的分離工藝參數(shù)。對(duì)分離后的產(chǎn)品,選用不同的溶劑進(jìn)行重結(jié)晶,標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取綠原酸標(biāo)品5.0mg,置50ml容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻得0.1mg/ml的標(biāo)液。分別吸取1、3、5、7、9ml標(biāo)液于五個(gè)10ml容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,得到系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。色譜條件的選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按以上色譜條件測定,記錄峰面積,并對(duì)樣品濃度作圖,得線性回歸方程為:y=14613.54x-3.09,r=0.9999;綠原酸在0.01~0.09mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2結(jié)果與分析以0.2mol/L的HCl為溶劑,綠原酸標(biāo)品在322nm和216nm處兩個(gè)吸收峰,這兩個(gè)波長下吸光度的比值(A322/A216為1.37,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)產(chǎn)品中綠原酸含量變化時(shí),這個(gè)比值也隨之改變,產(chǎn)品純度越高,比值越接近1.37,反之,產(chǎn)品純度越低,比值越小。如當(dāng)產(chǎn)品中綠原酸含量為37.8%,A322/A216為0.94,而當(dāng)產(chǎn)品中綠原酸含量為49.7%,A322/A216為1.08。因此,可以通過測量這個(gè)比值大小初步判斷產(chǎn)品中綠原酸的純度。2.1聚酰胺目數(shù)和洗脫劑的選擇分別稱取目數(shù)不同的兩種聚酰胺(80~100目、100~200目各7.0g,裝入柱長和內(nèi)徑完全相同的柱子,將綠原酸的粗提液濃縮后拌入適量聚酰胺,烘干,研磨,過60目篩,記為綠原酸粗提物。稱取該粗提物1.0g,兩份,分別裝入目數(shù)不同的兩根柱子頂端,然后依次用等體積的水和10%~40%乙醇洗脫,收集各自粉碎1.240%的乙醇A322/A216洗脫劑80~100目100~200目30%的乙醇20%的乙醇10%的乙醇水圖1聚酰胺目數(shù)和洗脫劑的選擇Fig.1Selectionofpolyamideandsolvent200160120804040%的乙醇綠原酸質(zhì)量(mg洗脫劑80~100目100~200目30%的乙醇20%的乙醇10%的乙醇水由圖3和表2可以看出,在物料比為1:5的前提下,當(dāng)柱徑與柱長比為1:7時(shí),流分中綠原酸出現(xiàn)較集中,所得產(chǎn)品的綠原酸純度最高,產(chǎn)品得率無明顯差別,故選擇1:7為合適的柱徑與柱長比。2.4流速的選擇稱取8.0g聚酰胺(80~100目兩份,裝入兩根相同柱子(2.0cm×14.0cm中,柱徑與柱長比為1:7,稱取2.7g粗品(含綠原酸粗品1.6g兩份,分別裝入柱子頂端,使物料比為1:5,用10%的乙醇洗脫,分別調(diào)節(jié)柱子的活塞至最大流速(2.2ml/min及較小流速(1.2ml/min處,比較不同流速下綠原酸的洗脫效果,優(yōu)選出較理想的洗脫速度。由圖4可以看出,當(dāng)流速為2.2ml/min和1.2ml/min的洗脫液,以洗脫液中綠原酸的含量(A322/A216和質(zhì)量為指標(biāo),比較不同目數(shù)的聚酰胺和不同洗脫劑對(duì)綠原酸的分離提純效果。結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,聚酰胺的型號(hào)對(duì)綠原酸的分離效果影響不大,但100~200目的聚酰胺分離速度明顯小于80~100目的聚酰胺,故選擇80~100目的聚酰胺柱層析法分離綠原酸的吸附劑。用不同的洗脫劑進(jìn)行洗脫時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫劑為10%乙醇時(shí),綠原酸質(zhì)量和綠原酸含量都是最高的,所以選擇10%乙醇為聚酰胺柱層析的洗脫劑。2.2物料比的選擇稱取8.0g聚酰胺(80~100目三份,裝入柱長內(nèi)徑完全相同的柱子(2.0cm×14.0cm,分別稱取4.5、2.7、1.35g拌入聚酰胺后粗品(含綠原酸粗品分別為2.7、1.6、0.8g,裝入相同的三根柱子頂端,使物料比(綠原酸粗品與聚酰胺質(zhì)量比分別為1:3、1:5、1:10,用10%的乙醇洗脫,一倍柱體積為一流分別收集,對(duì)每個(gè)流分別進(jìn)行紫外掃描,計(jì)算每個(gè)流分中的綠原酸的含量(A322/A216,當(dāng)A322/A216≥0.9時(shí),流分與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外圖譜比較相似,故合并A322/A216≥0.9的流分,濃縮、干燥得綠原酸產(chǎn)品,比較不同物料比所得產(chǎn)品得率和產(chǎn)品中綠原酸的純度,優(yōu)選出一種理想的物料比。表1物料比對(duì)產(chǎn)品得率和綠原酸純度的影響Table1EffectsofrateofcrudeCAtopolymideonproductrecoveryandCApurity物料比1:31:51:10產(chǎn)品得率(%1.741.691.62綠原酸純度(%53.661.050.7表2柱徑與柱長比對(duì)產(chǎn)品得率和綠原酸純度的影響Table2EffectsofrateofdiametertolongonproductrecoveryandCApurity柱徑與柱長比1:31:71:14產(chǎn)品得率(%1.811.691.55綠原酸純度(%50.161.029.7由圖2和表1可以得出,當(dāng)物料比為1:5時(shí),流分中綠原酸出現(xiàn)較集中,所得產(chǎn)品綠原酸純度最高,產(chǎn)品得率無明顯差別,故選擇1:5為合適的物料比。2.3柱徑與柱長比的選擇稱取8.0g聚酰胺(80~100目三份,分別裝入不同直徑的柱子中(3.0cm×9.0cm、2.0cm×14.0cm、1.5cm×21cm,則柱徑與柱長比分別為1:3、1:7、1:14,稱取2.7g粗品(含綠原酸粗品1.6g三份,使物料比為1:5,分別裝入柱徑與柱長比不同的三根柱子中,用10%的乙醇洗脫,一倍柱體積為一流分別收集,對(duì)每個(gè)流分進(jìn)行紫外掃描,計(jì)算每個(gè)流分綠原酸的含量(A322/A216,合并A322/A216≥0.9的流分,濃縮、干燥得綠原酸產(chǎn)品,比較不同物料比所得產(chǎn)品得率和產(chǎn)品中綠原酸的純度,優(yōu)選出一種理想的柱徑與柱長比。瓶號(hào)圖2物料比的選擇Fig.2SelectionofrateofcrudeCAtopolymide024物料比1:3物料比1:5物料比1:10瓶號(hào)圖3