酶的定向進(jìn)化

酶的定向進(jìn)化第一頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日酶分子的定向進(jìn)化（directedevolution）：模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。

屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。第二頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日4.6.1定向進(jìn)化的特點(diǎn)適應(yīng)面廣；目的性強(qiáng)；效果顯著。第三頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日4.6.2定向進(jìn)化的原理以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+定向選擇。第四頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日4.6.3酶基因的隨機(jī)突變1、易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無性進(jìn)化

無性突變：向單一酶分子基因內(nèi)隨機(jī)引入突變，制造突變酶庫(kù)以便篩選。

易錯(cuò)PCR：從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的情況下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，使擴(kuò)增得到的基因出現(xiàn)堿基配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起基因突變的技術(shù)過程。

反應(yīng)條件：提高M(jìn)g2+濃度；添加Mn2+；改變四種底物濃度比等。第六頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日易錯(cuò)PCR技術(shù)特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，隨機(jī)突變豐富。缺點(diǎn)：正突變基因少，需多次PCR。注意：控制好基因突變頻率。適用：較小基因的定向進(jìn)化。第七頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日2、DNA重排技術(shù)為代表的有性進(jìn)化

DNA重排技術(shù)：又稱DNA改組技術(shù)，有性PCR（sexualPCR）。從正突變基因文庫(kù)中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。第八頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日DNA改組原理第九頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日DNA改組技術(shù)特點(diǎn)：正突變頻率高，進(jìn)化速度快。注意：需多次進(jìn)行。第十頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日3、基因家族之間的同源重組

從自然界中存在的基因家族出發(fā)，利用它們之間的同源順序進(jìn)行DNA改組實(shí)現(xiàn)同源重組。

如：Stemmer等從4種微生物中選擇編碼頭孢菌素酶的4個(gè)同源基因，對(duì)它們進(jìn)行單獨(dú)進(jìn)化或同源重組進(jìn)化。結(jié)果對(duì)單基因進(jìn)化得到的突變酶中，對(duì)頭孢羥羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重組進(jìn)化的方法使抗性比其中兩種微生物來源的天然酶提高270倍，比另外兩種酶提高了540倍。第十一頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日1、突變基因文庫(kù)的構(gòu)建定義：將各種不同突變基因與載體重組，再轉(zhuǎn)入適宜的細(xì)胞或包裝成重組λ噬菌體的技術(shù)過程。質(zhì)量要求：文庫(kù)包容性和文庫(kù)完整性過程：載體選擇基因重組形成基因文庫(kù)質(zhì)粒噬菌體DNA黏粒載體噬菌粒載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)第十二頁(yè)，共十四頁(yè)，2022年，8月28日2、突變基因的篩選（1）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定（2）高通量篩選技