實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)(第四章)

第一節(jié)基本概念1.放射性濃度──單位體積溶液中含有的放射性活度，Bq/L、Bq/ml。2.放射化學(xué)純度──放射性標(biāo)記化合物的放射性活度占該樣品的總放射性活度的百分比。3.放射性比活度──單位質(zhì)量放射性物質(zhì)的放射性比活度。重要參數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。第一頁，共44頁。4.同位素標(biāo)記──各種化合物上的元素被該種元素的放射性同位素所取代的標(biāo)記。5.非同位素標(biāo)記──利用性質(zhì)接近的放射性核素代替需標(biāo)記化合物上的元素的標(biāo)記。6.定位標(biāo)記──把放射性核素標(biāo)記到化合物指定位置上的標(biāo)記。7.非定位標(biāo)記──無法確定放射性核素標(biāo)記到化合物上的某部位的標(biāo)記。

全標(biāo)記（一般標(biāo)記）──標(biāo)記化合物上原子被取代的機(jī)會均等的標(biāo)記。準(zhǔn)定位標(biāo)記──在定位標(biāo)記時，由于中間過程，可能也標(biāo)記在其它位置上的標(biāo)記。第二頁，共44頁。第二節(jié)標(biāo)記化合物的制備一、放射性核素的選擇1.基本不改變原有化合物的物理化學(xué)性質(zhì)；2.標(biāo)記核素與化合物的結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好；3.合適的半衰期；4.射線容易測量；5.其它，標(biāo)記難易、價格、防護(hù)等。第三頁，共44頁。二、考慮因素1.原材料及其價格；2.標(biāo)記物的穩(wěn)定性；3.微量操作技術(shù)；4.冷試驗(yàn)；5.防護(hù)措施及防污染、廢物處理方案。第四頁，共44頁。三、基本方法1.同位素交換法：某一放射性核素或其化合物與待標(biāo)記化合物中相同元素的非放射性核素進(jìn)行交換反應(yīng)。2.化學(xué)合成法：應(yīng)用放射性核素的原原料，通過各種化學(xué)反應(yīng)，將放射性核素合成到待標(biāo)記化合物的特定位置上。3.生物合成法：全生物合成──利用生物的生理代謝作用，將簡單的放射性原料轉(zhuǎn)化成所需的標(biāo)記物；酶促合成──利用酶的生物活性，將放射性前體轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧臉?biāo)記物。4.絡(luò)合物/鰲合物生成法：將放射性金屬離子和具有特定功能的化合物進(jìn)行絡(luò)合或鰲合反應(yīng)。利用了金屬離子易生成絡(luò)合物或鰲合物的原理。第五頁，共44頁。第三節(jié)常用標(biāo)記化合物的制備C、H──生命物質(zhì)的主要組分，生命科學(xué)中常用14C、3H來標(biāo)記所需化合物。125I──性質(zhì)活潑，易與蛋白質(zhì)和多肽發(fā)生取代反應(yīng)，且發(fā)射的γ射線易測量。P、S──核酸、蛋白質(zhì)的組成元素，32P、33P、35S在DNA測序等分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用。第六頁，共44頁。一、14C標(biāo)記化合物的制備C的主要同位素14C的特點(diǎn)：1.半衰期長；2.發(fā)射的β-射線能量低，可用液閃測量，易防護(hù)；3.用于自顯影，影像清晰；4.14C的化合物較穩(wěn)定，輻射自分解速度慢。核素半衰期衰變方式射線能量(MeV)天然豐度生產(chǎn)核反應(yīng)11C20.38分β+0.960811B(p,n)12C穩(wěn)定98.89213C穩(wěn)定1.10814C5730年β-0.15514N(n,p)第七頁，共44頁。（一）14C標(biāo)記化合物的化學(xué)合成起始原料：Ba14CO3或14CO2中間體：由原料經(jīng)一步或兩步反應(yīng)制得簡單14C標(biāo)記物第八頁，共44頁。例1：制備14C標(biāo)記的維生素K2第九頁，共44頁。例2：[1-14C]-乙酸的制備方法1：方法2：第十頁，共44頁。核素標(biāo)記的位置一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩x擇。例3：例4：β-14C-絲氨酸14C-甲酸甘氨酸第十一頁，共44頁?；瘜W(xué)合成法的優(yōu)點(diǎn)：能定位標(biāo)記；純化較容易；放射性比活度高。缺點(diǎn)：需特定的原料或中間體；需特殊的微量操作和射線防護(hù)技術(shù)；合成步驟較多，對復(fù)雜化合物的標(biāo)記有困難。第十二頁，共44頁。（二）14C標(biāo)記化合物的生物合成1.全生物合成采用一些低等生物，如細(xì)菌、綠藻、酵母等，利用它們的代謝活潑，繁殖迅速，可把簡單的放射性原料（如14CO2）摻入到細(xì)胞內(nèi)，再進(jìn)一步處理得到所需標(biāo)記物。第十三頁，共44頁。特點(diǎn)：方法簡單；可制得結(jié)構(gòu)復(fù)雜化合物；保留化合物天然生物活性和天然構(gòu)型。缺點(diǎn)：無法控制定位；分離純化較難；標(biāo)記率較低。第十四頁，共44頁。2.酶促合成利用特定的酶，通過一步或幾步反應(yīng)，將標(biāo)記前身物轉(zhuǎn)化為所需的標(biāo)記產(chǎn)物。2-14C-胸腺嘧啶尿嘧啶核苷2-14C-胸腺嘧啶核苷尿嘧啶特點(diǎn)：定位標(biāo)記，可得生物活性、光學(xué)構(gòu)型的標(biāo)記物缺點(diǎn)：需有相應(yīng)的前體和合適的酶第十五頁，共44頁。二、氚標(biāo)記化合物的制備氫的同位素優(yōu)點(diǎn)：1.來源豐富，測量簡便；2.能量弱，射程短，無需特別防護(hù)；3.可獲高分辨率自顯影效果，可觀察亞細(xì)胞形態(tài)；4.制備較簡單，可獲高比活度產(chǎn)物，靈敏度高；5.半衰期長，易運(yùn)輸、貯存、安排實(shí)驗(yàn)。核素半衰期射線及能量(keV)天然豐度生產(chǎn)核反應(yīng)1H(H)氕穩(wěn)定99.9852％2H(D)氘穩(wěn)定0.0148％3H(T)氚12.33年β-，18.614N(n,p)第十六頁，共44頁。缺點(diǎn)：1.3H在分子中易丟失；2.高比活度產(chǎn)物易發(fā)生輻射自分解；3.標(biāo)記物與非標(biāo)記物質(zhì)量相差大，標(biāo)記位置可能會影響反應(yīng)速率。同位素效應(yīng)：因同位素的原子質(zhì)量不同而引起反應(yīng)速率改變的現(xiàn)象。標(biāo)記位置遠(yuǎn)離反應(yīng)部位，可減少同位素效應(yīng)。常用標(biāo)記方法：同位素交換法化學(xué)合成法生物合成法第十七頁，共44頁。（一）同位素交換法RH+T2?RT+HT操作簡單，但氚常標(biāo)在不穩(wěn)定位置，難于定位，產(chǎn)品比活度低，較難純化。1.氚氣曝射交換法：將待標(biāo)記物均勻途布在反應(yīng)容器中，減壓真空，通入純氚氣，密閉反應(yīng)數(shù)日～數(shù)周，回收氚氣，純化標(biāo)記物。一般適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜化合物（中藥有效成分）的標(biāo)記。提高比活度，縮短反應(yīng)時間：①活化氚氣，將氚分子解離為氚原子或氚離子；②盡可能分散待標(biāo)記樣品，擴(kuò)大反應(yīng)接觸面；③加入催化劑，如鈀黑或鉑黑。第十八頁，共44頁。缺點(diǎn)：①不定位；②氚的利用率低；③易導(dǎo)致待標(biāo)記物化學(xué)鍵斷裂；④分離純化較難。2.溶液中的催化交換法（1）均相催化交換法氚化溶液：氚水、3H-醋酸催化劑：多為酸性試劑──乙酸、三氯乙酸、硫酸、磷酸、過氯酸、氯化鋁等；一般需加熱數(shù)小時～數(shù)十小時。第十九頁，共44頁。（2）非均相催化交換法──快速、簡便①氚化溶液中的非均相交換操作簡便，反應(yīng)時間短，雜質(zhì)少，不飽和鍵一般不發(fā)生加氚反應(yīng)；但標(biāo)記位置難以預(yù)定，不適用熱不穩(wěn)定化合物。②氚氣在溶液中的非均相催化交換法第二十頁，共44頁?？色@得高純度、高比活度標(biāo)記物，適用于芐基化合物、雌激素、嘌呤核苷、嘌呤核苷酸及糖的標(biāo)記，不適用于不飽和鍵化合物、鹵代化合物的標(biāo)記，標(biāo)記位置不確定。（二）化學(xué)合成法是目前制備高比活度的定位標(biāo)記的最成熟、最重要的方法。合適的前體：烯烴、炔烴、有機(jī)鹵化物、腈、羧基化合物。還原劑：氚氣，氚化金屬（NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4）方法：催化加氚法、催化鹵氚置換法、氚化金屬還原法。第二十一頁，共44頁。1.催化加氚法適用于含不飽和鍵前體的標(biāo)記，及嘌呤類核苷酸、核苷酸、激素等標(biāo)記，對還原糖可定位標(biāo)記在醛基上，對含芐基的化合物，可定位在亞甲基上。2.催化鹵素置換法一般還在反應(yīng)中加入有機(jī)胺類的添加劑，可中和反應(yīng)產(chǎn)物鹵化氫（3HX），利于反應(yīng)進(jìn)行。簡便，可定位標(biāo)記，產(chǎn)物比活度較高，但需合適的鹵化物前體。第二十二頁，共44頁。注意事項(xiàng)：①催化劑的使用：鉑、鈀及其氧化物。鈀更好。提高催化效率，可加用活性炭、BaSO4、CaCO3等載體，增加有效表面活性，5％、10％Pd/C。②若氚水濃度高，輻射自分解重，需稀釋；氚氣無此問題，需專門真空系統(tǒng)中操作。③一般會產(chǎn)生放射化學(xué)雜質(zhì)，需純化處理。3.氚化金屬還原法用氚化金屬(NaB3H4、LiB3H4、KB3H4、LiAl3H4)選擇性地將羧酸、酯、酮、醛、腈類化合物還原成相應(yīng)的醇類、胺類。定位標(biāo)記。把氚加成到不飽和鍵的碳原子上。第二十三頁，共44頁。（三）生物合成法以氚的標(biāo)記物為底物，利用專一性很強(qiáng)的酶為催化劑，將該標(biāo)記物轉(zhuǎn)化為另一所需的標(biāo)記物。標(biāo)記物一般可定位標(biāo)記，且保留生物活性。第二十四頁，共44頁。如3H-TdR的制備：[甲基-3H]胸腺嘧啶尿嘧啶核苷[甲基-3H]胸腺嘧啶核苷尿嘧啶第二十五頁，共44頁。三、放射性碘標(biāo)記物的制備常用的放射性碘同位素核素半衰期射線及能量(MeV)(%)主要生產(chǎn)方式123I13.06hEC：Eγ＝0.159，85121Sb(α，2n)Eγ＝0.564，18125I60dEC：Eγ＝0.0335，6.7124Xe(n,γ)125Xe(EC)Eγ＝0.027，119Eγ＝0.031，26127I穩(wěn)定無輻射天然豐度100％131I8.04dβ-：Eβ＝0.336，13130Te(n,γ)131Te(β-)Eβ＝0.607，86EC：Eγ＝0.364，81Eγ＝0.637，7.2第二十六頁，共44頁。特點(diǎn)：①化學(xué)性質(zhì)活潑，標(biāo)記技術(shù)易掌握；②所需設(shè)備簡單③特別適用于蛋白質(zhì)、多肽的碘標(biāo)記；④半衰期適中，易于商品化、貯存、廢物處理；⑤發(fā)射低能γ射線，易測量；⑥輻射自分解較小，標(biāo)記物較穩(wěn)定；⑦比活度較高，靈敏度高。第二十七頁，共44頁。（一）同位素交換法RI+Na*I?R*I+NaI方法簡單，產(chǎn)物易純化，可得較高比活度的標(biāo)記物，但須合適的前體，及特定的條件（溫度、壓力、酸堿度）。碘-溴交換法，可得高比活度、高純度產(chǎn)物。第二十八頁，共44頁。（二）蛋白質(zhì)、多肽的碘標(biāo)記技術(shù)前提：1.待標(biāo)記物要有易被碘原子結(jié)合或取代的基團(tuán)（酪氨酸、組氨酸、色氨酸）；2.必須先把125I-氧化成125I2。酪氨酸組氨酸色氨酸第二十九頁，共44頁。影響碘化反應(yīng)因素：1.可結(jié)合基團(tuán)數(shù)量，及暴露程度；2.氧化劑性質(zhì)、反應(yīng)條件(pH、濃度、溫度、反應(yīng)時間)。一般來說，在保證一定標(biāo)記率得前提下，盡可能減少氧化物得用量，以保證標(biāo)記物得生物活性和免疫活性。碘化反應(yīng)種類：1.氯胺-T法：方法簡便，標(biāo)記率高，重復(fù)性好，試劑易得，是迄今最常用方法之一。Cl-T（N-氯代對甲苯磺酰胺鈉鹽）：性質(zhì)溫和，在水溶液中水解產(chǎn)生次氯酸，次氯酸氧化碘離子成碘分子。第三十頁，共44頁。注意事項(xiàng)：①氧化劑Cl-T不穩(wěn)定，臨用時配置；②用量適當(dāng)；③反應(yīng)完需用等量的還原劑偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5)中和,臨用時配置；④pH在7～8，常用0.2～0.5M磷酸緩沖液；⑤反應(yīng)體積適當(dāng)，50～300μl；⑥溫度和時間，室溫1～3min，若4℃，增加時間；⑦不適用于生物活性不穩(wěn)定物質(zhì)，如一些補(bǔ)體、某些激素、酶、受體等。第三十一頁，共44頁。2.乳過氧化物酶法（LPO）：過氧化物酶作用于H2O2，放出新生態(tài)氧，氧化125I-為碘分子。常用乳過氧化物酶。注意事項(xiàng)：①用量少，為待標(biāo)記蛋白的1％；②pH范圍較寬，4～8.5；③H2O2用量少；④反應(yīng)時間30～60min⑤也能用于各種脂肪、細(xì)胞、細(xì)胞膜的標(biāo)記；⑥過氧化物酶來源困難，標(biāo)記率低；⑦酶本身也可能被標(biāo)記而產(chǎn)生雜質(zhì)。第三十二頁，共44頁。3.固相氧化法：

將氧化物或過氧化物酶以固體的形式，或制成固體顆粒，進(jìn)行液-固氧化反應(yīng)。目前常用Iodogen法。Iodogen：1,3,4,6-四氯3α,6α-二苯-甘脲，氧化劑，與Cl-T同屬氯酰胺類。注意事項(xiàng)：①Iodogen不溶于水，可用二氯甲烷溶解；②制備Iodogen涂管（5～25μg/管），封口冷藏；③無需配置氧化劑、還原劑④將反應(yīng)液倒出或稀釋，即終止反應(yīng)；⑤對標(biāo)記物損傷程度小，標(biāo)記率較高。第三十三頁，共44頁。4.聯(lián)接標(biāo)記法：

間接標(biāo)記法。先將放射性碘標(biāo)記到較活潑試劑上，再聯(lián)接到待標(biāo)記化合物上。常用Bolton-Hunter試劑，3-(對-羥基苯)丙酸-N-琥珀亞胺酯（HPNS）。步驟：①125I標(biāo)記HPNS；②125I-HPNS上的酰基與蛋白質(zhì)或多肽上的游離氨基發(fā)生縮合反應(yīng)?？杀苊獾鞍踪|(zhì)與氧化劑直接接觸，防止生物活性損傷；對于在體內(nèi)不穩(wěn)定的酪氨酸殘基碘標(biāo)記物，提供一種選擇。較麻煩，引入一較大基團(tuán)會影響示蹤性質(zhì)。第三十四頁，共44頁。四、32P、33P和35S標(biāo)記化合物的制備32P：射線能量較強(qiáng)（1.7MeV），易檢測，但輻射危害大，半衰期短（14d），自顯影條帶有擴(kuò)散，分辨率低；35S：能量較低（0.167MeV），半衰期較長(87d)，自顯影條帶清晰，分辨率高，無需特殊防護(hù)，自顯影前需制成凝膠干膠板；33P：能量適中（0.25MeV），半衰期為25d，自顯影清晰度、分辨率適中，無需特殊防護(hù)。制備方法：化學(xué)合成、生物合成、酶促法、同位素交換法?，F(xiàn)一般均有商品供應(yīng)。第三十五頁，共44頁。第四節(jié)純化與鑒定放射性核素檢測的靈敏性，應(yīng)用時的微量，都必需要求標(biāo)記化合物的放射化學(xué)純度達(dá)到一定的高度（至少大于95％），這樣才能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，結(jié)果才可靠。雜質(zhì)來源：①未標(biāo)記上的游離放射性核素；②待標(biāo)記物的不純物被標(biāo)記上放射性核素；③貯存時，由于標(biāo)記物的不穩(wěn)定，或發(fā)生輻射自分解，產(chǎn)品性質(zhì)、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。第三十六頁，共44頁。一、標(biāo)記率的測定

常用紙層析、TLC法測定分析。（一）原理：樣品中各組分性質(zhì)不同，在固定相上的吸附能力和在流動相中的溶解度不同，隨流動相的移動速度也就不同。一般隨固定相的不同，而有不同的分離效果。第三十七頁，共44頁。（二）基本操作1.固定相的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求或標(biāo)記物的性質(zhì)。2.展開劑的選擇重要因素，直接影響分離效果。根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)差異，通過各種極性不同的溶液配伍組成展開劑，以有效分離。3.點(diǎn)樣與展開樣品、參考樣，展開距離。第三十八頁，共44頁。（三）結(jié)果測量1.放射自顯影一般不用。2.分段測量常用手段。3.放射性掃描快速、簡便、直觀，但要求一定的活度。（四）注意事項(xiàng)1.分離條件要確保各組分有效分離。2.高比活度樣品需加適量載體，防止吸附。3.放射性濃度低時，可重復(fù)點(diǎn)樣。第三十九頁，共44頁。二、分離純化層析法──紙層析、薄板層析、柱層析透析法、電泳法一般與標(biāo)記率測定的分離方法一樣，根據(jù)標(biāo)記物性質(zhì)選擇固定相、流動相。三、標(biāo)記物的鑒定1.放射化學(xué)純度鑒定2.放射性濃度3.放射性比活度的測定4.生物活性和免疫活性的測定第四十頁，共44頁。第五節(jié)放射性標(biāo)記化合物的

輻射自分解輻射自分解：由于標(biāo)記化合物分子