醫(yī)學分子生物學基因結構與表達分析方法

醫(yī)學分子生物學基因結構與表達分析方法第1頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA序列分析一、雙脫氧末端終止法二、化學降解法三、DNA自動化序列分析四、新一代DNA測序分析第2頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四一、雙脫氧末端終止法DNA合成反應第3頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四ATP、dATP和ddATP的結構第4頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四1.雙脫氧末端終止法原理DNA合成反應中，ddNTP不存在3’-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5’-P端形成3’,5’-磷酸二酯鍵，導致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP.第6頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四DNA測序技術基礎高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)能分離長度為300-500bp，差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸片段7第7頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT8第8頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.DNA測序主要步驟

單鏈DNA模板的制備DNA模板與測序引物退火

摻入法標記反應（如：α-35S）

延伸-終止反應

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

放射自顯影

閱讀測序結果第9頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四二、化學降解法

將待測DNA片段3’或5’端進行同位素標記，標記的DNA片段分成四個反應，分別用不同的化學試劑處理，造成堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種堿基處斷裂。第11頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP三、DNA自動化序列分析

利用雙脫氧末端終止法的原理13第13頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四用熒光化合物分別標記4種ddNTP終止反應產物，替代放射性同位素標記是實現DNA測序自動化的基礎。第14頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四DNA自動測序步驟4種有不同熒光燃料標記的ddNTPsSanger測序反應反應產物毛細管電泳分離激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光熒光信號采集，計算機分析與DNA自動排序第15頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries第16頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四四、新一代DNA測序技術

基于循環(huán)芯片測序法

高通量、測序成本低

焦磷酸測序法SOLiD分析系統(tǒng)：準確度最高Illumina測序儀第17頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)核酸分子雜交（NucleicAcidHybridization）一、核酸分子雜交原理二、Southern印跡雜交三、Northern印跡雜交四、斑點雜交五、原位分子雜交六、液相雜交第18頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四一、核酸分子雜交原理

指兩條互補單鏈核酸在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。

雜交雙方是探針與待測核酸序列。探針+待測核酸

雜交雙鏈第19頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（一）印跡技術

利用各種物理方法使電泳中的生物大分子轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍膜、化學活化膜、濾紙等各種膜上，使之成為固化分子。（二）探針標記技術

用放射性同位素、生物素或熒光染料標記序列已知的多聚核苷酸鏈稱為探針。第20頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四二、Southern印跡雜交（Southern

blotting）將電泳分離的待測DNA片段結合到一定的固相支持物上，然后與存在液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。

用于DNA定性定量分析，基因突變分析，及RFLP分析等第21頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southern印跡雜交

檢測靶分子為DNA,檢測靶分子是否含有目的基因。

預雜交第22頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四三、Northern印跡雜交（Northern

blotting）將RNA變性及電泳分離后，并轉移到固相支持物上，用雜交反應來鑒定其中特定mRNA分子的含量及大小。

用于mRNA定性和定量分析，即基因表達分析。第23頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點：簡單、迅速可在同一張膜上進行多個樣品的檢測核酸粗提樣品的檢測效果也較好四、斑點雜交第25頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四五、原位雜交insituhybridization用于核酸定性、定位分析。

菌落原位雜交

熒光原位雜交第26頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四核酸雜交分類表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測經凝膠電泳分開的DNA分子，需轉印到膜上Northern印跡檢測經凝膠電泳分開的RNA分子，需轉印到膜上斑點印跡雜交檢測未經分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子第27頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四與固相雜交的區(qū)別：直接在液體中雜交，不用純化或固定靶分子，雜交步驟更簡化，雜交速度有所提高，反應的敏感性和特異性更強。1．核酸酶S1保護分析法

2．RNA酶保護分析法六、液相雜交技術第28頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四

利用M13噬菌體合成放射性的ssDNA探針。探針與待測RNA樣品在液相中進行雜交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能專一性地降解未形成雜交的DNA和RNA單鏈，不降解DNA/RNA雙鏈。

還可用于基因轉錄起始點分析、內含子剪切位點分析。

1．核酸酶S1保護分析法（nucleaseS1protectionassay）第29頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四目的：檢測RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern雜交靈敏度更高。原理：探針為ssRNA，雜交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1專一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。2．RNA酶保護分析法（RPA)第30頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)聚合酶鏈式反應

（PolymeraseChainReaction，PCR）一、PCR技術原理

二、耐熱DNA聚合酶

三、PCR引物設計原則

四、PCR條件的優(yōu)化

五、PCR改進技術第31頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四聚合酶鏈式反應(PCR):一、PCR技術原理

MullisK.

1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復制過程的核酸體外擴增技術。

TheNobelPrizeinChemistry1993第32頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四1.PCR循環(huán)由三步組成：①變性（denaturation）：93~98℃②退火(annealing)：37~65℃③延伸(extension)：70~75℃第33頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555反應步驟示意圖第34頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第35頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第36頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.PCR擴增終產物大小:介于兩條退火引物5′末端之間的雙鏈DNA片段。循環(huán)一第37頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四循環(huán)二第38頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四循環(huán)三一對引物：正向和反向

限制了PCR擴增的片段的范圍第39頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四

5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC

AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG

AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGC3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT

3.引物設計實例第40頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四Y=A（1+E）n

Y:擴增產物的量

A:最初靶DNA分子數

E:PCR擴增效率

n:循環(huán)次數

4.PCR產量

當E＝100％,A=1時Y=2n>>2n(引物延伸產物的量）第41頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCRthermalcycler第42頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR產物第43頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5.平臺期與平臺效應PCR經過一定數量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數累積，而是進入線性增長期或靜止期，即平臺效應。影響因素：①引物及dNTP底物濃度降低。②酶與模板比例下降。第44頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR平臺效應實際應用提示：

定量PCR應考慮平臺期效應，選擇最適循環(huán)次數。第45頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四二、耐熱DNA聚合酶1.TaqDNA聚合酶（實現了PCR自動化）●95℃的半衰期:40min●最適溫度:72℃～80℃●催化反應速率:150～300核苷酸/秒/酶分子第46頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第47頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；

逆轉錄酶活性；●較弱的非模板依賴性；●缺乏3′→5′外切酶活性，無校正功能。第48頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.無機離子及抑制劑的影響

TaqDNA聚合酶的活性對Mg2+濃度和單價離子（K+或NH4+）的性質和濃度較敏感。最適Mg2+濃度：2mmol/LK+濃度：50mmol/L第49頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四如何提高PCRDNA聚合酶的保真性？（1）使用TaqDNA聚合酶時，摻入少量具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，錯配率可降為原來的1/10。（2）使四種dNTP底物濃度相等；（3）MgCl2濃度盡可能低；（4）減少循環(huán)數。第50頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四3.幾種高保真的耐熱DNA聚合酶TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶PfuDNA聚合酶第51頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四三、PCR引物設計原則引物設計是決定PCR特異性擴增的關鍵。第52頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR引物設計原則：1.引物與模板的序列緊密互補2.引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構3.引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(錯配)第53頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5′CACTGAACGTAGGCCT3′

3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特異擴增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′錯誤引發(fā)

引物與模板的序列要緊密互補引物不能在模板的非目的位點引發(fā)

DNA聚合反應(錯配)第54頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（1）引物之間應避免3′端互補引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構（2）引物自身不應形成發(fā)夾結構第55頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR引物設計原則:①引物長度:10～30nt②堿基分布:A、T、G、C隨機分布③G+C含量：40～60%，Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物之間：避免3′末端互補⑤引物自身：不應形成二級結構⑥

引物3’末端堿基：最好選T/C/G⑦5′末端堿基：可不與模板DNA互補第56頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第57頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+退火變性延伸PCR反應體系：四、PCR條件的優(yōu)化第58頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四1.TaqDNA聚合酶濃度：

1.0～2.5U/100μl反應液

2.dNTP濃度：20～200μmol/L

3.Mg2+濃度：0.5～2.5mmol/L4.引物濃度：0.1～0.5μmol/LPCR條件的優(yōu)化第59頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四五、PCR改進技術反轉錄PCR

(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)以mRNA為模板逆轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進行PCR反應。第60頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四逆轉錄酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最適溫度42℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最適溫度37℃第61頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

以樣本mRNA為模板逆轉錄合成cDNA，在不同引物對引導下共同PCR擴增“管家”基因和目的基因cDNA。第62頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（1）選擇內對照基因

組織中普遍表達、表達量比較恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。（2）半定量標準

計算PCR產物：

靶cDNA/GAPDHcDNA第63頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（3）KPNA2在正常生理狀態(tài)東方田鼠和小鼠體內表達分析第64頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第65頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四3.實時熒光定量PCR

（Real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）PCR擴增指數期內極小的擴增效率改變會極大地影響產量。應用：用于基因DNA拷貝數和mRNA表達定量分析。

第66頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四67（1）SYBRGreen法SYBRGreen能結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號SYBRGreen第67頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第68頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四69與目標序列互補（2）TaqMan法TaqMan水解型熒光標記探針探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第69頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第70頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四。（3）分子信標探針（MolecularBeacon,TM）該探針具有發(fā)夾結構，5′端標記熒光報告基團，3′端標記淬滅基團。第71頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四探針與靶序列雜交結合，報告熒光染料與淬滅染料分離，發(fā)出熒光。第72頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（4）實時熒光定量PCR計算原理PCR擴增效率的差異使相同的樣品最終產量有很大差異第73頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第74頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四CT或Tc或Ct值：臨界點循環(huán)（Thresholdcycle），即從基線到指數增長的拐點所對應的循環(huán)數第75頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第76頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四●傳染病診斷、監(jiān)測與療效預后評估：●揭示疾病發(fā)病機制第77頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四熒光定量PCR儀帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，配有電腦系統(tǒng)及分析軟件。第78頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四六、其它PCR技術1.反向PCR(inversePCR)

對已知片段兩側的未知序列進行擴增和研究。第79頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.Alu-PCR

利用Alu高度保守序列設計引物擴增哺乳動物未知DNA片段的方法。

第80頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四3.原位PCR(in-situPCR)

是指直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增，然后用特異探針進行原位雜交檢測含該特異序列的細胞的一種方法。第81頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四4.巢式PCR（nestedPCR）

兩對引物：內引物、外引物

可檢出低拷貝原始模板。

第82頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5.不對稱PCR（