衛(wèi)生檢驗蛋白質

衛(wèi)生檢驗蛋白質第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三本次課的主要內容.蛋白質代謝檢查.糖代謝檢查三.離子測定第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三一蛋白質代謝檢查(一)TP測定:方法、原理、操作、臨床意義及注意事項(二)ALB測定:方法、原理、操作、臨床意義、注意事項

第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三（一）TP測定TP測定方法簡介:TP測定時常利用蛋白質的一些特性,如重復的肽鍵結構;酪氨酸和色氨酸殘基對酚試劑反應或紫外光吸收;與色素結合的能力;沉淀后的濁度;電泳的遷移率大小等來設計蛋白質的測定方法。經(jīng)典和常見的方法分述如下：①凱氏定氮法:是經(jīng)典的蛋白質測定方法,準確性好、精密度和靈敏度高、是公認的參考方法。但操作復雜、費時,主要用于標準蛋白質的定值和對其他方法的校正。②雙縮脲法：特異性高、準確度和精密度好，方法簡便、顯色穩(wěn)定。雖然靈敏度不高，但能滿足臨床對血清TP定量測定要求，是臨床測定血清TP的常規(guī)方法。第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三（一）TP測定1.TP測定方法簡介:③酚試劑法：靈敏度高達雙縮脲法的100倍，有利于檢出微量蛋白質，較合適于單一蛋白質檢測。④紫外分光光度法：利用蛋白質在280nm處有吸收峰的特點，常用于測定較純的酶和免疫球蛋白。⑤染料結合法：常用氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍、鄰苯三酚紅鉬等，前三者主要用于蛋白電泳，鄰苯三酚紅鉬可用于尿液和腦脊液中蛋白質的測定，簡便快速、靈敏，但不同蛋白質結合力不一樣，且試劑對比色杯有吸附作用。⑥化學比濁法：操作簡便、靈敏度高，但影響濁度大小的因素較多，一般用于測定尿液、腦脊液等蛋白質含量較低的標本。第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三（一）TP測定

2.雙縮脲法測定TP原理:

蛋白質中的肽鍵在堿性溶液中與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡合物,此反應和兩個尿素分子縮合生成的雙縮脲在堿性液中與銅離子作用形成紫紅色的反應相似,故稱之為雙縮脲反應。這種紫紅色絡合物在540nm處有明顯吸收峰,,吸光度在一定范圍內與血清總蛋白含量成正比,經(jīng)與同樣處理的蛋白質標準液比較,即可求得蛋白質含量。至少含2個-CONH-基團才能與Cu2+絡合，故氨基酸及二肽無反應，三肽以上才能反應.

堿性

蛋白質﹢銅離子→紫色絡合物

試劑:成品試劑(液體單一試劑)。雙縮脲試劑含有：硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、NaOH。標準液:蛋白質含量：50g/L、60g/L儀器：生化自動分析儀、分光光度計。

第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)TP測定3.雙縮脲法測定TP操作:(1).生化自動分析儀法按試劑說明書提供的參數(shù)編程測定。(2).手工操作法:

混勻，37℃10min，波長540nm處比色，蒸餾水調零，測各管吸光度。計算第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)TP測定4.雙縮脲法測定TP:臨床意義:

正常成人TP：60-80g/L(1)TP降低:見于蛋白合成障礙(肝功嚴重受損時，蛋白合成減少，以ALB降低最顯著)、蛋白丟失增加(嚴重燒傷,大量血漿滲出;腎病綜合征;潰瘍性結腸炎)、營養(yǎng)不良或消耗增加、血漿稀釋(如靜注過多低滲溶液或各種原因引起的水鈉潴留)。(2)TP增高：見于蛋白合成增加(多發(fā)性骨髓瘤,異常球蛋白增加)、血漿濃縮(急性脫水，外傷失血等)。第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)TP測定2.雙縮脲法測定TP注意事項(1)黃疸、嚴重溶血等有明顯干擾,可用標本空白管消除。如果標本空白管吸光度太高，可影響結果準確度,使測定結果偏高。(2).脂血混濁血清會干擾比色,使測定結果偏高,可用乙醚抽提。(3).顯色溫度控制在37±1℃,使用經(jīng)校正的高級分光光度計(波長帶寬≤2nm),比色杯光徑1Cm比色。(4).血清蛋白質的含量一般用g/L表示,因為各種蛋白質的分子量不同,不能用mol/L表示。(5).生化自動分析儀測定時，黃疸、溶血、脂血等不合格標本一搬不進行測定。第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)TP測定2.雙縮脲法測定TP方法特點(1).雙縮脲顯色反應僅和蛋白質中肽鍵數(shù)成正比,與蛋白質種類,分子量及氨基酸組成無明顯關系,各種蛋白質顯色程度基本相同,顯色穩(wěn)定性好,試劑單一。(2).雙縮脲法重復性好,RCV4%,CCV3.9%;線性范圍0-140g/L,干擾少,使用單一的穩(wěn)定試劑,操作簡單、快速,適于手工操作及自動化分析,為TP測定的參考方法。(3).唯一的缺點是靈敏度較低，比酚試劑法低約100倍,但能滿足臨床生化檢驗需要,對血清總蛋白定量較為適用;對蛋白質含量很低的其他體液如腦脊液、胸腹水和尿液等，不是合適的定量方法。(4).雙縮脲法是臨床測定血清TP首選最方便、最實用的常規(guī)方法。

第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)白蛋白測定（ALB）1.溴甲酚綠法測定ALB:原理

ALB在PH4.2的緩沖液中帶正電荷，在有非離子型表面活性劑存在時,可與帶負電荷的染料溴甲酚綠結合形成藍綠色復合物，在波長630nm處有吸收峰,其顏色深淺與ALB濃度成正比例,與同樣處理的ALB標準比較,可求出ALB含量。

pH4.2

白蛋白﹢溴甲酚綠→藍綠色復合物試劑:成品試劑,琥珀酸緩沖液、溴甲酚綠、聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）、疊 氮鈉白蛋白標準液:40g/L第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定2.溴甲酚綠法測定ALB操作(1).生化自動分析儀分析法(2).手工操作法波長628nm,空白管調零,試劑與血清標本混合后,立即在30±3s讀取吸光度。計算

第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定3.溴甲酚綠法測定ALB臨床意義：參考值34-48g/L(1).ALB增高:常見于嚴重脫水所致血漿濃縮。(2).ALB降低:與TP降低原因大致相同,主要見于:蛋白合成障礙，蛋白丟失增加,

營養(yǎng)不良或消耗增加,血漿稀釋。急性降低主要見于大出血和嚴重燒傷；慢性降低見于腎病蛋白尿、肝功受損、腸道腫瘤及結核病、慢性出血、營養(yǎng)不良和惡性腫瘤等。血清ALB低于20g/L,臨床出現(xiàn)水腫。(3).A/G比值正常為1.5-2.5/1,ALB減少和/或球蛋白升高，A/G降低,嚴重者A/G﹤1.0，稱為A/G比值倒置。(4).先天性ALB缺乏癥：ALB合成障礙，極少見。第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定4.溴甲酚綠法測定ALB注意事項(1).BCG是一種PH指示劑,變色域PH3.8(黃色)-5.4(藍綠色),控制反應液

PH是本方法的關鍵。(2).BCG試劑也可用其他緩沖液如枸櫞酸鹽或乳酸鹽緩沖液。但琥珀酸鹽緩沖液的校正曲線通過原點,線性好,靈敏度高,為首選推薦配方。(3).Brij-35也可用其他表面活性劑代替,如吐溫-20或吐溫-80,靈敏度和線性范圍不變。(4).60g/L的白蛋白標準液與BCG結合后,在光徑1.0cm,630nm測定吸光度應為0.811±0.035，如達不到此值，靈敏度較差。(5).BCG不但與ALB呈色,與血清中多種蛋白成分呈色,其反應速度較ALB慢.

故BCG與血清混合后，在30s內讀取吸光度,可明顯減少非特異呈色反應。為減少基質效應，最好用參考血清作標準。第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定5.溴甲酚綠法測定ALB方法特點(1).本法操作簡便、快速,黃疸、溶血和中度脂血無干擾,可手工操作,也可自動化分析,是目前國內測定ALB的常用方法。(2).本法線性范圍10-60g/L，RCV﹤4%。與溴甲酚紫法(BCP)比較,對

ALB特異性較差.

。

第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定6.溴甲酚紫法測定ALB原理

ALB在PH5.2的緩沖液中帶正電荷,在有Brij-35存在，可與帶負電荷的染料溴甲酚紫(BCP)結合形成綠色復合物，在波長603nm處的吸光度與ALB濃度成正比，與同樣處理的ALB標準比較，可求出血清中的ALB含量。

pH5.2ALB﹢溴甲酚紫→綠色復合物試劑:成品試劑。醋酸緩沖液、溴甲酚紫、聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）、疊氮鈉。ALB標準液:40g/L儀器:生化自動分析儀、分光光度計。第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定7.溴甲酚紫法測定ALB操作(1).生化自動分析儀分析法(2).手工操作法

混勻，1min后603nm比色，空白管調零，讀取吸光度。計算加入物（ml）BSU血清——0.025ALB標準液—0.025—0.154mol/LNaCl0.025——BCP試劑5.05.05.0第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(二)ALB測定8.溴甲酚紫法測定ALB參考值：36-46g/L注意事項：(1).BCP溶液PH必須控制在5.20±0.03范圍內。(2).嚴重脂血對測定有干擾，應加做標本空白予以校正。評價:BCP反應最適PH為5.20,接近-和-球蛋白的等電點,抑制了這兩種球蛋白與BCP的非特異性反應,對測定ALB有較高的特異性.進口試劑多為此法。BCP與ALB的反應為即時完全反應,不受時間和溫度變化的影響,呈色后穩(wěn)定1h以上。本法兼有BCG法的所有優(yōu)點,克服了BCG的多數(shù)缺點,成為測定血清ALB染料結合法中較好的一種方法。BCP法優(yōu)點:受球蛋白和其他血漿蛋白干擾較小,對測定ALB有較高的特異性.

與BCG法相比,靈敏度較低.此外,溴甲酚紫與非人源性的白蛋白結合力相當弱,與牛、豬等動物血清反應性僅為BCG的1/3，不適用于測定動物標本中的白蛋白,

機制尚待闡明。第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三二糖代謝檢查(一)血糖測定:原理、操作、臨床意義及注意事項(二)糖化血紅蛋白測定:原理、操作、臨床 意義、注意事項

第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定1.葡萄糖氧化酶法(glucoseoxidase,GOD)測定葡萄糖原理:利用氧和水將GLU氧化為葡萄糖酸,并釋放H2O2。過氧化物酶(POD)在色原性氧受體存在時將H2O2分解為水和氧,并使色原性氧受體4-氨基安替比林和酚去氫縮合為紅色醌類化合物,即Trinder反應.紅色醌類化合物的生成量與GLU含量成正比。試劑:成品試劑(液體雙試劑).R1:磷酸鹽緩沖液:磷酸鹽、4-氨基安替比林、葡萄糖氧化酶;R2:過氧化物酶、苯酚.葡萄糖標準液:5mmol/L儀器：生化自動分析儀、分光光度計第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定2.葡萄糖氧化酶法(glucoseoxidase,GOD)測定葡萄糖操作：（1）生化自動分析儀法按儀器說明書操作。（2）手工操作法混勻,置37℃水浴15min，在波長505nm處比色，空白管調零，讀取標準管和測定管吸光度。計算第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定3.血糖測定臨床意義空腹血清葡萄糖為3.90-6.10mmol/L血糖升高見于：(1)生理性高血糖:攝入高糖食物后或情緒緊張腎上腺素分泌增加.(2)病理性高血糖見于：ａ.糖尿病:胰島素絕對或相對不足.ｂ.內分泌腺功能障礙:甲亢、腎上腺皮質及髓質功能亢進及對抗胰島素的激素分泌過多.ｃ.應激性高血糖：顱內壓增高刺激血糖中樞,如顱外傷、顱內岀血、腦膜炎等．第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定3.血糖測定臨床意義

血糖降低見于：（1）.生理性低血糖見于：饑餓和劇烈運動（2）.病理性低血糖：特發(fā)性功能性低血糖最多見,依次是藥源性、肝源性、胰島素瘤等．ａ.胰島β細胞增生或胰島β細胞瘤等,使胰島素分泌過多ｂ.對抗胰島素的激素分泌不足,如垂體前葉、腎上腺皮質和甲狀腺功能減退而使生長素、腎上腺皮質激素分泌減少．ｃ.嚴重肝病患者,由于肝臟儲存糖原及糖異生等功能低下,肝臟不能有效調節(jié)血糖.第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定4.葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖注意事項：（1）.葡萄糖氧化酶（GOD）對β-D-葡萄糖高度特異,葡萄糖完全氧化需要α型到β型的變旋反應.某些試劑盒含葡萄糖變旋酶,可加速變旋.終點法中,延長孵育時間可自發(fā)變旋.新配的葡萄糖標準液主要是α型,需放置2h以上方可應用.（2）.本法可直接測定CSF葡萄糖含量,但不能直接測定尿葡萄糖含量.因尿中尿酸等物質濃度過高,干擾過氧化物酶(POD)反應,造成結果假性偏低.（3）.標本以草酸鉀-氟化鈉抗凝血漿較好.可抑制糖分解．（4）.本法用血量甚微,操作中應直接加標本至試劑中,再吸試劑反復沖洗吸管,以保證結果可靠．（5）.嚴重黃疸、溶血及乳糜血應先制備無蛋白血濾液,再測定．第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定4.葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖注意事項（6）.過氧化物酶(POD)特異性比葡萄糖氧化酶(GOD)低得多,一些還原性物質如尿酸,抗壞血酸,多巴胺,膽紅素和谷胱甘肽等,可與色原性物質競爭H2O2,,使結果偏低．（7）.住院患者血糖低于參考值而無低糖表現(xiàn),可能的原因是：ａ.GOD-POD法受藥物影響,住院患者每天輸液,VitC、多巴胺廣泛應用,血液中高濃度的藥物引起負干擾.ｂ.標本采集不合格，血液凝固后未能及時離心,建議重新采集標本．ｃ.新生兒膽紅素對該法有負干擾．（8）.住院患者血糖異常升高,應與臨床聯(lián)系,查詢是否為糖尿病患者,與其尿糖是否相符,一旦不符,應詢問標本采集時是否正輸葡萄糖.如是建議重新采集標本．第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)血糖測定5.葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖方法特點：（1）.線性范圍可達22.24mmol/L,回收率94-105%,變異系數(shù)批內0.7-2.0%,批間CV2%左右,日間2-3%.準確度和精密度都能達到臨床要求，操作簡便，適用于常規(guī)檢驗。GOD法也適于測定腦脊液葡萄糖濃度。GOD法不能直接用于尿標本測定，可使用離子交換樹脂除去尿中干擾物再測定。（2）.本法反應式中第一步是特異反應,第二步特異性較差.一些還原性物質如尿酸,抗壞血酸,多巴胺,膽紅素和谷胱甘肽等,可與色原性物質競爭H2O2,,從而消耗反應產生的H2O2,,使結果偏低．第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三

三.離子測定

(一)鉀、鈉測定:原理、操作、臨床意義及注意事項(二)氯化物測定:原理、操作、臨床意義及注意事項第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定

鉀鈉測定方法有火焰發(fā)射光譜法、離子選擇性電極法等，目前采用離子選擇性電極法比較多。離子選擇電極(ISE)法原理：以測量電池電動勢為基礎的定量分析方法。將離子選擇電極和一個參比電極連接起來，置于待測電解質溶液中，構成一個測量電池，此電池的電動勢與被測離子活度的對數(shù)符合能斯特(Nernst)方程。離子選擇電極由鉀、鈉離子活度的作用產生不同電位。這種電位變化由離子活度決定，與鉀、鈉離子濃度成正比。離子選擇電極法測定鉀、鈉分直接電位法、間接電位法、多層膜干片法。第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定離子選擇電極法（ISE）1.直接電位法樣本或標準液不經(jīng)稀釋直接進入ISE管道作電位分析，因為ISE只對水相中離解離子選擇性的產生電位，與樣品中脂肪、蛋白質所占體積無關，即不受能改變血清中水體積比例的高蛋白血癥和高脂血癥等影響。2.間接電位法樣本或標準液要用指定離子強度與pH值的稀釋液作高比例稀釋，再輸入電極管道測定。該法會受到樣品中脂類和蛋白質占據(jù)體積的影響。一些沒有電解質失調而有嚴重高脂血癥和高蛋白血癥的樣品，由于單位體積血清中水量明顯減少，定量吸取樣品作稀釋后，間接電位法測定會得到假性低鈉、鉀血癥。3.多層膜干片法采用樣本間相互獨立的干式離子敏感卡片，參比測量池與離子測量池之間用鹽橋連通，測量參比池與測量池的電位差。第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定試劑

間接ISE法時高低濃度斜率液及血清用指定pH、離子強度的稀釋液作高度稀釋。直接ISE法是測定離子活度的，離子活度與溶液pH值及離子強度有關。儀器鈉、鉀離子選擇性電極的分析儀1.鉀電極是對K＋有選擇性響應的纈氨酶素液膜電極。此敏感膜的一側與電極電解液接觸，另一面與樣品液接觸，膜電位的變化與樣品中K＋活度的對數(shù)成正比2.鈉電極由對Na＋具有選擇性響應的特殊玻璃毛細管組成。鈉電極與參比電極之間的電位差隨樣品溶液中Na＋活度的變化而變化3.參比電極通常由Ag/AgCl組成，保持一個恒定不變的電位第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定臨床意義參考值血清鉀:3.5-5.5mmol/L鉀在人體的主要生理功能是:①參與細胞內的正常代謝；②維持細胞內容量、離子、滲透壓及酸堿平衡；③維持神經(jīng)肌肉的應激性；④維持心肌的正常功能。第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定臨床意義血清鉀參考范圍：3.5-5.5mmol/L1.低鉀血癥:血清鉀低于3.5mmol/L(1)鉀攝入不足:如慢性消耗性疾病長期進食不足使鉀來源減少,而腎照常排鉀.(2)鉀排出增多:如嚴重嘔吐、腹瀉、胃腸減壓和腸瘺等因消化液丟失造成低鉀.腎上腺皮質激素可促進排鉀，長期應用可能引起低血鉀.(3)細胞外鉀轉移:如靜脈輸入過多葡萄糖,尤其是加用胰島素時,為促進葡萄糖進入細胞合成糖原,鉀也進入細胞內,很易造成低血鉀。代謝性堿中毒或輸入過多的堿性藥物，形成急性堿血癥，H+從細胞內移出到細胞外中和堿性,細胞外鉀進入細胞內,造成低血鉀.(4)血漿稀釋也可造成低血鉀癥。

低血鉀改變了細胞內外鉀含量的比例而影響神經(jīng)肌肉的興奮性，也影響細胞膜的功能，使患者出現(xiàn)低血鉀的臨床癥狀。最重要的是影響心肌功能，表現(xiàn)為室上性心動過速、心傳導阻滯、室性期外收縮和室性心動過速，嚴重者心跳停止于收縮期。第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定臨床意義參考值血清鉀:3.5-5.5mmol/L2.高鉀血癥：血清鉀高于5.5mmol/L(1)輸入過多:如鉀溶液輸入過快或量過大,特別是腎功能不全、尿量減少時,又輸入鉀溶液,尤其容易引起高血鉀癥。(2)排泄障礙:如少尿或無尿,如急性腎功能衰竭。(3)細胞內鉀向細胞外轉移:如大面積燒傷組織細胞大量破壞，細胞內鉀大量釋放入血。代謝性酸中毒,血漿H+往細胞內轉移,細胞內的鉀轉移到細胞外。與此同時,腎小管上皮細胞泌H+增加,泌鉀減少,使鉀潴留于體內。高血鉀主要表現(xiàn)神經(jīng)肌肉癥狀，如肌肉酸痛、蒼白和肢體濕冷等一系列類似缺血現(xiàn)象。神經(jīng)及神經(jīng)肌肉聯(lián)接處的興奮性抑制,可發(fā)生心內傳導阻滯,出現(xiàn)心跳變慢及心律不齊,引起循環(huán)機能衰竭,甚至引起纖維性顫動,最后,心臟停跳于舒張期。第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期三(一)鉀、鈉測定臨床意義參考值血清鈉:136-146mmol/L

3.低鈉血癥：可由鈉減少或水增多引起，常見引起原因有：（1）腎性因素:有滲透性利尿、腎上腺功能低下、腎素生成障礙以及急、慢性腎功能衰竭等。

(2).非腎性因素:如嘔吐、腹瀉、腸瘺、大量出汗和燒傷等。除鈉丟失外還伴有水丟失，血漿滲透壓降低，引起水份向細胞內轉移，出現(xiàn)細胞水腫，嚴重者可出現(xiàn)腦水腫。4.高鈉血癥:可因攝入鈉過多或水丟失過多而引起。主要見于水排出過多而無相應的鈉丟失，如水樣瀉、尿崩癥、出汗過多以及糖尿病由于水隨大量糖尿排出而引起高鈉血癥等。第34頁，共