土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)優(yōu)秀公開課

專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)背景：問：1尿素如何被利用的呢？

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。2細(xì)菌利用尿素的原因是什么呢？本課題“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)”的目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌思考：如何研究細(xì)菌的分離與計數(shù)，你的研究思路是什么呢？

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)篩選菌株；統(tǒng)計菌落數(shù)目；設(shè)置對照。1、實例：

DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株

提出的問題

？

解決問題的思路？如果讓你篩選某一目的菌株，從中你會得到了什么啟示？解決問題的原理？高溫（）其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，從（）菌種提取耐高溫酶。如何尋找耐高溫的酶？尋找什么環(huán)境？15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4請設(shè)計：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：問：1從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？

2在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？3此培養(yǎng)基能否篩選出選擇分解尿素的細(xì)菌？

4怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？問怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌作對照判斷實驗組培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長分解尿素的細(xì)菌生長多種微生物是配置好培養(yǎng)基后，該實驗流程的下一步是什么？1、顯微鏡直接計數(shù)法（菌株）：

利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。由于此法計得的是活菌和死菌的總和，又稱總菌計數(shù)法。㈡.統(tǒng)計菌落的數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；難以計數(shù)微小的細(xì)菌。缺點優(yōu)點：直觀、快速，能觀察微生物的形態(tài)特征且技術(shù)簡單例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。

2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。

你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？甲：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板）

乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值。你從中得到什么啟示？?

㈡.統(tǒng)計菌落的數(shù)目：

2、稀釋涂布平板法（活體計數(shù)法或間接計數(shù)法）如何計算每克樣品中的菌株數(shù)？每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V)*M

C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。㈡.統(tǒng)計菌落的數(shù)目：

2、稀釋涂布平板法（活體計數(shù)法或間接計數(shù)法）總結(jié)：1為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選30～300個菌落的平板進行統(tǒng)計2為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。3統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。4每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V)*M

C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106

倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。原因⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者混入了其他的含氮物質(zhì))方案三：配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基實驗流程土壤取樣樣品稀釋取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察細(xì)菌的計數(shù)實驗操作（1）土壤取樣：從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣。將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。注意事項：無菌操作：鐵鏟和信封都要滅菌。后面稱取土壤、將稱好的土樣倒入錐形瓶、稀釋土壤溶液，每一步都要在火焰旁操作。實驗操作（2）制備培養(yǎng)基：制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可作為對照，判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。將菌液稀釋103～107倍。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，一個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。因此共需要15個選擇培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。準(zhǔn)備（）支滅菌的試管和（）支滅菌的移液管。（）支滴管。注意事項：

做好標(biāo)記：本實驗使用的平板和試管比較多。為避免混淆，最好在使用前就做好標(biāo)記。例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時，應(yīng)注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。在進行系列稀釋的時候，為避免試管相互混淆，可以將已經(jīng)進行過稀釋操作的試管，按稀釋度遞增的順序，依次放置在試管架的另一行。這樣，試管的位置就能清楚地表示出稀釋進行到哪一步。實驗操作（5）細(xì)菌的計數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。結(jié)果分析與評價1、培養(yǎng)物中是否有雜菌污染

對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長，說明培養(yǎng)基未被雜菌污染。反之，則被雜菌污染。結(jié)果分析與評價3、樣品的稀釋操作是否成功

如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。結(jié)果分析與評價4、重復(fù)組的結(jié)果是否一致

如果不同同學(xué)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠，需要分析產(chǎn)生差異的原因。五.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。本課題知識小結(jié):六、例題解析

在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時期是

A．調(diào)整期B．對數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期C1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（）

A.在液體培養(yǎng)基上進行B.至少接種一種細(xì)菌

C.接種一個細(xì)菌D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐訓(xùn)練A

CD4.下列說法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值

C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC例3．（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟價值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時代的意義。⑴青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是