第十三章 RNA的生物合成

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RNA的生物合成包括轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制。

轉(zhuǎn)錄（transcription）：以一段DNA的遺傳信息為模板，在RNA聚合酶作用下，合成出對(duì)應(yīng)的RNA的過(guò)程，或在DNA指導(dǎo)下合成RNA。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：mRNA、rRNA、tRNA、小RNA

除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)RNA分子都來(lái)自DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄研究的主要問題

①RNA聚合酶②轉(zhuǎn)錄過(guò)程③轉(zhuǎn)錄后加工④轉(zhuǎn)錄的調(diào)控①~③是基本內(nèi)容，④是目前研究的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同：

一致：要有模板，新鏈延伸方向5’→3’，堿基的參與嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。相異：①?gòu)?fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引物。

②轉(zhuǎn)錄時(shí)，模板DNA的信息全保存，復(fù)制時(shí)模板信息是半保存。③轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，無(wú)5’→3’及3’→5’外切活性。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步?；虮磉_(dá)的終產(chǎn)物：①RNA②蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及兩個(gè)方面①RNA合成的酶學(xué)過(guò)程

②RNA合成的起始信號(hào)和終止信號(hào)，即DNA分子上的特定序列。DNA正鏈：與mRNA序列一致的DNA鏈。負(fù)鏈：與正鏈互補(bǔ)的DNA鏈。

轉(zhuǎn)錄單位的起點(diǎn)核苷酸為+1，起點(diǎn)右邊為下游（轉(zhuǎn)錄區(qū)），轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)左側(cè)為上游，用負(fù)數(shù)表示：-1，-2，-3。

第一節(jié)DNA指導(dǎo)的RNA合成（轉(zhuǎn)錄）

RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以是一個(gè)基因（真核），也可以是多個(gè)基因（原核）。

基因的轉(zhuǎn)錄是有選擇性的，細(xì)胞不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和細(xì)胞環(huán)境條件的改變，將轉(zhuǎn)錄不同的基因。轉(zhuǎn)錄的起始由DNA上的啟動(dòng)子區(qū)控制，轉(zhuǎn)錄的終止由DNA上的終止子控制，轉(zhuǎn)錄是通過(guò)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一、RNA聚合酶

RNA合成的基本特征

①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）②RNA鏈生長(zhǎng)方向：5’→3’

１

③不需引物④需DNA模板反應(yīng)：

RNA聚合酶/DNA模板、Mg2?n1ATP?n2GTP?n3CTP?n4UTP???????????????RNA?(n1?n2?n3?n4)PPi1、E.coliRNA聚合酶（原核）

E.coli和其它原核細(xì)胞一樣，只有一種RNA聚合酶，合成各種RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。一個(gè)E.coli細(xì)胞中約有7000個(gè)RNA聚合酶分子，在任一時(shí)刻，大部分聚合酶（5000左右）正在參與RNA的合成，具體數(shù)量依生長(zhǎng)條件而定。

E.coliRNA聚合酶全酶（|holoenzyme）分子量46萬(wàn)Da，由六個(gè)亞基組成，α2ββ’σω，另有兩個(gè)Zn2+。無(wú)σ亞基的酶叫核心酶，核心酶只能使已開始合成的RNA鏈延長(zhǎng)，而不具備起始合成活性，參與σ亞基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亞基稱為起始因子。

E.coliRNA聚合酶各亞基的大小與功能：

亞基β’βσαω亞基數(shù)11121分子量基因（KD）16015070379rpoCrpoBrpoDrpoA功能與模板DNA結(jié)合與核苷酸結(jié)合，起始和催化部位。起始識(shí)別因子與DNA上啟動(dòng)子結(jié)合不詳不同的細(xì)菌，β’、β、α亞基分子量變化不大，σ亞基分子量變化較大，44KD~92KD。

σ亞基的功能：核心酶在DNA上滑動(dòng)，σ亞基能增加酶與DNA啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)，增加停留時(shí)間，使聚合酶迅速找到啟動(dòng)子并與之結(jié)合，σ亞基本身無(wú)催化活性。

不同的σ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子，從而表達(dá)不同的基因。

不同的原核生物，都具有一致的核心酶，但σ亞基有所區(qū)別，這決定了原核基因表達(dá)的選擇性。

RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)部分解開，轉(zhuǎn)錄后DNA依舊保持雙鏈的結(jié)構(gòu)。

P360圖20-1RNA聚合酶的活性中心

核心酶覆蓋60bp的DNA區(qū)域，其中解鏈部分17bp左右，RNA-DNA雜合鏈約12bp。

純的RNA聚合酶，在離體條件下可轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA，但在體內(nèi)，DNA的兩條鏈中只有一條可用于轉(zhuǎn)錄，這可能是由于RNA聚合酶在分開時(shí)丟失了σ亞基引起的。

解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的內(nèi)在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活體狀況中，可能還有其它酶活性來(lái)幫助調(diào)整DNA的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。

２

37℃時(shí)，RNA聚合酶的聚合速度可達(dá)40~100個(gè)核苷酸/秒

2、真核生物RNA聚合酶

真核生物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制要繁雜得多，有三種細(xì)胞核內(nèi)的RNA聚合酶：RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄rRNA，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄mRNA，RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA和其它小分子RNA。這三種RNA聚合酶分子量都在50萬(wàn)左右，亞基數(shù)分別為6-15。

P362表20-3真核生物RNA聚合酶的分類、分布及各自的功能

動(dòng)物、植物、昆蟲等不同來(lái)源的細(xì)胞，RNApolⅡ的活性都可被低濃度的α-鵝膏蕈堿抑制，而RNApolⅠ不受抑制。

動(dòng)物RNApolⅢ受高濃度的α-鵝膏蕈堿抑制，而酵母、昆蟲的RNApolⅢ不受抑制。

除了細(xì)胞核RNA聚合酶外，還分開到線粒體和葉綠體RNA聚合酶，它們的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能轉(zhuǎn)錄所有種類的RNA，類似于細(xì)菌RNA聚合酶。

3、噬菌體T3和T7編碼的RNA聚合酶

僅為一條分子量11KD的多肽鏈，這些聚合酶只需要識(shí)別噬菌體DNA的少數(shù)啟動(dòng)子，并無(wú)選擇地與其作用，37℃時(shí)的聚合速度200nt/秒。

二、RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程（E.coli）

P361圖20-2

1、起始

RNA聚合酶結(jié)合到DNA雙鏈的特定部位，局部解開雙螺旋，第一個(gè)核苷酸摻入轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，此后開始RNA鏈的延伸。

在新合成的RNA鏈的5’末端，尋常為帶有三個(gè)磷酸基團(tuán)的鳥苷或腺苷（pppG或pppA），即合成的第一個(gè)底物是GTP或ATP。

起始過(guò)程中，σ因子起關(guān)鍵作用，它能使聚合酶迅速地與DNA的啟動(dòng)子結(jié)合，σ亞基與β’結(jié)合時(shí)，β’亞基的構(gòu)象有利于核心酶與啟動(dòng)子緊湊結(jié)合，。

正鏈：與mRNA序列一致的兩、鏈。負(fù)鏈：模板鏈。

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是+1，上游是-1。

2、延長(zhǎng)

轉(zhuǎn)錄起始后，σ亞基釋放，離開核心酶，使核心酶的β’亞基構(gòu)象變化，與DNA模板親和力下降，在DNA上移動(dòng)速度加快，使RNA鏈不斷延長(zhǎng)。

轉(zhuǎn)錄起始后，σ亞基便從全酶中解離出來(lái)，然后nusA亞基結(jié)合到核心酶上，由nusA亞基識(shí)別序列序列。

３

3、終止

RNA聚合酶到達(dá)轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)時(shí)，在終止輔助因子的幫助下，聚合反應(yīng)中止，RNA鏈和聚合酶脫離DNA模板鏈，nusA又被σ亞基所取代。。

由此形成RNA聚合酶起始復(fù)合物與終止復(fù)合物兩種形式的循環(huán)。

三、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子

啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列。

轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常需要一些輔助因子（蛋白質(zhì)）參與作用，此類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。

蹤跡法和DNA測(cè)序法確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。P363

（一）原核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能

分析比較上百種啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)不同的啟動(dòng)子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。

（1）、-10序列（Pribnow框）

在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游大約-10處，有一個(gè)6bp的保守序列TATAAT，稱Pribnow框。此段序列出現(xiàn)在-4到-13bp之間，每個(gè)位點(diǎn)的保守性在45%-100%。

頻度：T89A89T50A65A65T100

據(jù)預(yù)計(jì)，Pribnow框中，一開始的TA和第6位最保守的T在結(jié)合RNA聚合酶時(shí)起十分重要的作用。目前認(rèn)為，Pribnow框決定轉(zhuǎn)錄方向。酶在此部位與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，Pribnow框中DNA序列在轉(zhuǎn)錄方向上解開，形成開放型起始結(jié)構(gòu)，它是RNA聚合酶穩(wěn)固的結(jié)合位點(diǎn)，是啟動(dòng)子的關(guān)鍵部位。

RNA聚合酶的結(jié)合，誘導(dǎo)富含AT的Pribnow框的雙鏈解開，然后進(jìn)一步擴(kuò)大成17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的泡狀物，在泡狀物中RNA聚合酶從模板鏈開始轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物。

（2）、-35序列（Sexfamabox）（識(shí)別區(qū)域）

只含-10序列的DNA不能轉(zhuǎn)錄，在-10序列上游還有一個(gè)保守序列，其中心約在-35位置，稱為-35序列，此序列為RNA酶的識(shí)別區(qū)域。

各堿基出現(xiàn)頻率如下：T85T83G81A61C69A52，其中TTG十分保守。

-35序列的功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始識(shí)別位點(diǎn)。因此，-35序列對(duì)RNA聚合酶全酶有很高的親和性。-35序列的核苷酸結(jié)構(gòu)，在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度，RNA聚合酶易識(shí)別強(qiáng)的啟動(dòng)子。

-35序列提供RNA聚合酶識(shí)別信號(hào)，-10序列有助于DNA局部雙鏈解開，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性決定了轉(zhuǎn)錄的方向。P364圖20-4原核型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

４

（二）真核啟動(dòng)子

真核基因的轉(zhuǎn)錄十分繁雜，對(duì)啟動(dòng)子的分析要比原核基因的困難得多。

真核生物有三種RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分別轉(zhuǎn)錄rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA，這三類聚合酶的啟動(dòng)子各有其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1、RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子

RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子有三個(gè)保守區(qū)：（1）、TATA框（Hogness框）中心在-25至-30，長(zhǎng)度7bp左右。

堿基頻率：T82A97A85A63（T37）A83A50（T37）（全為A-T，少數(shù)含有一個(gè)G-C對(duì)）。

此序列功能：使DNA雙鏈解開，并決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)位置，失去TATA框，轉(zhuǎn)錄將可能在大量位點(diǎn)上開始。

TATA框的改變或缺失，直接影響DNA與酶的結(jié)合程度，會(huì)使轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)偏移，因此，TATA是絕大多數(shù)真核基因正確表達(dá)所必需的。

由于RNA聚合酶分子有相對(duì)固定的空間結(jié)構(gòu)，同此框的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)催化位點(diǎn)的距離，決定了起始位點(diǎn)的正確選擇。啟動(dòng)子特定序列和酶的正確結(jié)構(gòu)，這兩者把酶置于一種正確的構(gòu)象中，決定了識(shí)別的正確性和轉(zhuǎn)錄起始的正確性。

（2）、CAAT框

中心在-75處，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT功能：與RNA聚合酶結(jié)合。（3）、GC框

在CAAT框上游，序列GGGCGG，與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。CAAT和GC框均為上游序列，對(duì)轉(zhuǎn)錄的起始頻率有較大影響。

2、RNApolⅢ的啟動(dòng)子

RNApolⅢ的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部。

P365圖20-5由RNA聚