臨床微生物檢測的基因同源性分析

;..;..臨床微生物檢測的基因同源性分析醫(yī)院感染的流行病學(xué)研究是臨床微生物學(xué)工作者的重要課題，在醫(yī)院感染監(jiān)測的研究中，一個很重要的問題就是如何確定感染途徑和傳播途徑，以采取有效預(yù)防和控制措施，從而防止醫(yī)院感染或者暴發(fā)流行，因此對微生物鑒定和菌株同源性分析提出了更高的要求。目前，傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定和同源性分析技術(shù)已不能很好地滿足醫(yī)院感染診斷和流行病學(xué)調(diào)查的需要，從型、亞型、株，甚至分子水平上去認(rèn)識細(xì)菌變得愈來愈重要了。近年來分子生物學(xué)的理論和技術(shù)在細(xì)菌感染診斷中的滲透和廣泛應(yīng)用，使得細(xì)菌鑒定、耐藥基因的檢測、分子流行病學(xué)調(diào)查變得更加準(zhǔn)確、簡潔和快速。細(xì)菌 同源性分析技術(shù)如脈沖場凝膠電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA探針雜交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析細(xì)菌的主要手段，它在鑒定細(xì)菌感染的爆發(fā)、確定院內(nèi)交叉感染、感染病原菌之間的基因同源性等方面有著重要的作用，本文將對常用基因同源性分析方法的機(jī)理和過程做簡要綜述。一、質(zhì)粒分型1、原理：質(zhì)粒是可移動的染色體外元件，可以自發(fā)丟失或者被宿主穩(wěn)定地獲得，因此流行病學(xué)上相關(guān)的分離菌株有可能表現(xiàn)出不同的質(zhì)粒圖譜。把質(zhì)粒提取出來，進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖電泳分析，就可以知道分離菌株攜帶質(zhì)粒的大小和數(shù)目。2實驗過程：質(zhì)粒抽提； 瓊脂糖電泳； 染色、凝膠成像。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：優(yōu)勢：;..;..步驟比較簡單，對實驗儀器要求不高。在評價那些從局限的時間和地點（如一個醫(yī)院中的急性爆發(fā)）分離出來的菌株非常有效。缺點：實驗結(jié)果的重復(fù)性不好。分辨力不高。二、染色體 的限制性內(nèi)切核酸酶分析（RestriEcntdioonnuclAesassaeRyEA）1、原理：限制性內(nèi)切核酸酶（ ）在特異的核酸識別序列切割 ，被消化后，所得到的限制性片段的數(shù)目和大小是由酶的識別位點和 的組成共同決定的。在傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切核酸酶分析中，人們用含有相對多的限制性位點的內(nèi)切核酸酶消化細(xì)菌的 ，這樣就會得到成百上千條長度在 范圍內(nèi)的 片段。恒定的電場瓊脂糖電泳，可以根據(jù)分子質(zhì)量的大小將這些片段分開，然后通過 染色并在紫外燈下觀察其圖譜。同一種的不同分離菌株的 序列的變異可造成限制性位點數(shù)目和分布的變化，所以可以導(dǎo)致其圖譜出現(xiàn)差異。、實驗流程：染色體抽提；限制性內(nèi)切酶消化（主要是 I瓊脂糖電泳；染色、凝膠成像。、實驗方法的評價：實.驗流程簡單。所有的菌株都可以這個方法來分型。缺點：圖譜包括成百上千條帶，一些條帶可能不能檢測到，一些條帶可能會重疊。圖譜分析復(fù)雜。分辨力不高。三、染色體 的脈沖場凝膠電泳(PulsedG-eFliEeelldectropPhFoGrEe)sis1、原理：用識別位點相對多的酶進(jìn)行的一個重要的局限性，是分析那些大量的、重疊的、分辨力較差的限制性酶切片段構(gòu)成的圖譜相當(dāng)困難。如果用限制性位點相對少的酶消化細(xì)菌的基因組，那么就可以得到數(shù)量相當(dāng)少但更大的限制性片段，這樣在電泳中，穿過瓊脂糖的電場作周期性的改變，就可以產(chǎn)生一個有5-2條0清晰的分辨較好的圖譜。2實驗流程：染色體抽提；限制性內(nèi)切酶消化 (主要是)I凝膠電泳脈沖場； 染色、凝膠成像；軟件分析。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：方法的分辨力和可重復(fù)性都很高，方法是腸球菌腸桿菌和葡萄球菌基因分型的;..;..金標(biāo)準(zhǔn)。缺點：必須使所有的酶和緩沖液都能浸透凝膠塊，準(zhǔn)備合適的樣品需要延長培育時間。近來也有報道葡萄球菌和腸球菌可以用相當(dāng)短的時間來進(jìn)行 分析。需要昂貴的專業(yè)設(shè)備。四、核糖體分型（ ）1、原理：核糖體操縱子包括編碼 和 以及一種或多種的核苷酸序列。核糖體序列高度保守，針對大腸桿菌 制備的探針，或者是克隆的核糖體操縱子，可與許多細(xì)菌的染色體核糖體操縱子雜交，細(xì)菌的基因組中通常有多個核糖體基因，分別存在于不同長度的酶切片段中，因此核糖體分型可以得到類似指紋的結(jié)果，因此是可以分型的。2實驗流程：堿性磷酸酶脫去 末端磷酸；Y 末端標(biāo)記上述 ；抽提限制性內(nèi)切酶消化 （主要是 ）；凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；用標(biāo)好的 探針進(jìn)行 印記、放射性自顯影。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：

核.糖體序列高度保守,用大腸桿菌制備的探針核.糖體序列高度保守,用大腸桿菌制備的探針能對所有的細(xì)菌進(jìn)行分型。缺點：分辨力中等。流行病學(xué)上無關(guān)的菌株，有可能有相同的核糖體型圖譜。需要用到放射性同位素，成本很高。實驗步驟繁瑣。五、限制性內(nèi)切核酸酶片段長度多態(tài)性（ ）的核酸雜交分析1、原理：在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段 的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致的產(chǎn)生。、實驗流程：裂解細(xì)菌，抽提基因組 、 酶消化；凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；過氧化物酶標(biāo)記過的 探針雜交、 膠片顯影； 軟件分析。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：能對所有攜帶V探針同源基因的菌株進(jìn)行分型。實驗的重復(fù)性很高。缺點：樣.品用量大、純度要求高。探針設(shè)計的難度大。分析技術(shù)步驟繁瑣，工作量大，成本較高。六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandAommplifPioeldymorDpNhAicRAPD-PCR)1、原理：由于整個基因組存在眾多反向重復(fù)序列，單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合。使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。引物結(jié)合位點 序列的改變以及兩擴(kuò)增位點之間 堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過染色以檢測 片段的多態(tài)性。2實驗流程：抽提； 合成引物， 普通， 瓊脂糖電泳，凝膠成像； a， 尿素多聚丙烯酰胺凝膠電泳，干膠 顯影。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：分辨力高。缺點：可重復(fù)性差。圖譜很難解釋。實驗步驟繁瑣，過程中需要用到同位素。七、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）P、原理：由于不同物種的基因組 大小不同，基因組 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，只有那些限制性位點側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上指紋的有無來檢出多態(tài)性。2實驗流程：裂解細(xì)菌，抽提基因組 ；限制性內(nèi)切酶消化；擴(kuò)增；毛細(xì)管電泳；用 分析電泳結(jié)果。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：分辨力高。缺點：引物需要同位素標(biāo)記。對樣品 質(zhì)量要求嚴(yán)格。實驗中需要用到毛細(xì)管電泳，一般實驗室不具備此儀器。A、重復(fù)片段 （ ）1、原理：所使用的引物是以短的基因外重復(fù)序列為基礎(chǔ)的。腸桿菌科成員、一些革蘭氏陽性菌和真菌中，都有這些序列，一般說來，這種序列在細(xì)菌染色體上有許多位點。當(dāng)兩個序列的距離足夠近時，那么位點之間的 片段將被有效的復(fù)制。因為重復(fù)序列的數(shù)目和位點變化很大，所以不同菌株擴(kuò)增產(chǎn)生重復(fù)片段的大小和數(shù)目也就相應(yīng)的不同。2實驗流程：抽提基因組 ；合成引物、； 瓊脂糖電泳；軟件分析結(jié)果。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：有較好的重復(fù)性。實驗步驟比較簡單。缺點：中等的分辨力。該方法的結(jié)果分析是基于軟件分析，一般實驗室很少有此軟件。九、核苷酸序列分析(Nucleosteiqdueendceetermi)nation1、原理：在細(xì)菌界中，核糖體的某些學(xué)列高度保守，人們可以設(shè)計幾乎從任何細(xì)菌都可以擴(kuò)增到核糖體序列的引物。通過測定擴(kuò)增產(chǎn)物以及分析核糖體操縱子相對變化的區(qū)域，就可以確定感染性微生物的類型。2實驗流程：細(xì)菌基因組抽提； 擴(kuò)增； 產(chǎn)物測序；序列比對，得出鑒測序結(jié)果與序列比對，得出鑒定結(jié)果。3、實驗方法的評價：優(yōu)勢：實驗步驟比較簡單，結(jié)果容易分析。對一些難于分型的菌株也能得到很好的結(jié)果。缺點：代測菌株必須有足夠的差異序列以保證切實有效。目前還不清楚單一位點的測序能否提供可靠的鑒定結(jié)果。隨著越來越多的分子技術(shù)應(yīng)用到醫(yī)院感染的病原菌研究中，為流行病學(xué)調(diào)查和患者的治療提供了快捷準(zhǔn)確的支持。然而，醫(yī)院感染病原菌存在廣泛而迅速的變異，這些變異使得菌株的基因同源性分析資料的解釋變得錯綜復(fù)雜。在任何一種分析系統(tǒng)中，一個單一遺傳事件（如單個代謝酶的變化或者一條電泳條帶的變化）組成的改變，不足以得出兩個菌株代表不同菌株的結(jié)論，也就是說它們不一定在流行病學(xué)上無關(guān)。因此，多種分子分析技術(shù)的聯(lián)用，已成為分子流行病學(xué)調(diào)查和臨床微生物診斷的趨勢。脈沖場凝膠電泳年， 和 發(fā)明了交變脈沖場凝膠電泳，技術(shù)，與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)到左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。的基本原理脈沖電泳分離大分子的介質(zhì)是瓊脂糖，大于的線性雙鏈片段，在瓊脂糖凝膠的網(wǎng)孔中的泳動，就像蛇行似的尋找彎曲蜿蜒的孔隙。普通的單方向恒定電場給分子的泳動動力方向確定且不發(fā)生變化，所以嚴(yán)重影響凝膠電泳分離大分子量片段的效果。施加在凝膠上至少有兩個電場方向，時間與電流大小也交替改變，使得 分子能夠不斷地調(diào)整泳動方向，以適應(yīng)凝膠中不規(guī)則的孔隙變化，達(dá)到分離大分子線性 的目的，最大分辨率為 大小的線性 分子。在交變脈沖電場中，大分子量線性 改變泳動方向所需時間比小分子線性要長，因為前者變形能力低于后者。當(dāng)某一線性 在脈沖場中改變形狀調(diào)整方向進(jìn)行遷移所需的時間大于脈沖場脈沖維持時間時，該 的遷移速度將減為最低。線性分子改變形狀和泳動方向所需時間與其分子量大致成正比，也是基于不同 分子量的差異作為分離不同 分子的依據(jù)。當(dāng)分子變形轉(zhuǎn)向所需時間與脈沖時間較接近時，遷移率與分子量成反比。根據(jù)被分離分子的范圍選擇適當(dāng)?shù)拿}沖時間，經(jīng)過較長時間不斷變形轉(zhuǎn)向泳動，不同大小的就被分離。分子的凈遷移方向與普通電泳一樣，垂直于樣品孔。影響 分辨率的因素包括幾方面：兩個脈沖場的均一性；兩個脈沖場的脈沖時間以及它們之間的比率；兩個脈沖場的強(qiáng)度和方向。為了增強(qiáng) 對大小差異較大的樣品的分辨率，可采用交變脈沖梯度電場，即在電泳過程中，先用較短的交變脈沖時間使較小的分子分離，然后用較長的交變脈沖時間分離較大的分子。分類一正交交變電場凝膠電泳正交交變電場凝膠電泳 ，，兩交變電場的電流方向相互垂直。二反轉(zhuǎn)電場凝膠電泳反轉(zhuǎn)電場凝膠電泳 ， ，交變電場均一并且是‘反向的。的電泳條件凝膠中瓊脂糖的濃度一般為?％??％,常用％。電泳緩沖液為.,也可用緩沖液。在 中對于X的凝膠，選擇以上的電壓，在? 中的電流為 一，以達(dá)到/的電壓。在中，一般選擇的電壓，.中的電流為? ，