轉(zhuǎn)基因克隆動物課件

1Callaspade，aspade實事求是Afallinpitagaininwit吃一塹長一智Themanwhohasmadeuphismindtowinwillneversay“impossible”一個決心取勝的人從來都不會說“不可能”Fourshortwordssumupwhathasliftedmostsuccessfulindividualsabovethecrowed:alittlebitmore成功的秘訣就是四個簡單的字：多一點點（凡事比別人多一點點，多一點努力多一點實踐多一點瘋狂，多一點點就能創(chuàng)造奇跡）2

你是一個富翁如果早上醒來，你發(fā)現(xiàn)自己還能自由呼吸，你就比在這一周離開人世的100萬人更有福氣。如果你從未經(jīng)歷過戰(zhàn)爭的危險、被囚禁的孤寂、受折磨的痛苦和忍饑挨餓的難受、你已經(jīng)好過世界上5億人。如果你的冰箱里有食物，身上有足夠的衣服，有屋棲身，你已經(jīng)比世界上70%的人更富足。如果你銀行戶頭有存款，錢包里有現(xiàn)金，你已經(jīng)身居世界上最富有的80%的人之列。如果你的雙親仍然在世，并且沒有分居或離婚，你已屬于稀少的一群。如果你能讀到這段文字，那么，你更是擁有雙份的福氣，你比20億不能閱讀的人更幸福。3父母在,不遠游,游必有方。父母之年,不可不記。一則以喜，一則以憂。夫樹欲靜而風(fēng)不止，子欲養(yǎng)而親不待?！弊釉?“古之孝者,是謂能養(yǎng)。至于犬馬,皆能有養(yǎng),不敬,何以別乎?”5休無休時，了無了時人肯當(dāng)下休，便當(dāng)下了。若要尋個歇處，則婚嫁雖完，事亦不少。僧道雖好，心亦不了。前人云：“如今休去便休去。若覓了時無了時?！币娭恳?。6王維《九月九日憶山東兄弟》獨在異鄉(xiāng)為異客，每逢佳節(jié)倍思親。遙知兄弟登高處，遍插茱萸少一人。采桑子重陽-------毛澤東人生易老天難老，歲歲重陽，今又重陽，戰(zhàn)地黃花分外香。一年一度秋風(fēng)勁，不似春光，勝似春光，寥廓江天萬里霜。過故人莊[孟浩然]故人具雞黍，邀我至田家。綠樹村邊合，青山郭外斜。開軒面場圃，把酒話桑麻。待到重陽日，還來就菊花。

76.Ojose

OJOSE是一款免費的科學(xué)搜索引擎，用戶只需要輸入一個檢索字段就可以在60多個不同的數(shù)據(jù)庫之間進行檢索

7.Cogprint

Cogprint系統(tǒng)主要集中于一些認(rèn)知科學(xué)領(lǐng)域的電子存檔文件

學(xué)科領(lǐng)域包括心理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、語言學(xué)和計算機科學(xué)等

8.Socolar

Socolar是開放獲取資源的平臺，提供基于開放獲取期刊和開放獲取機構(gòu)倉儲的導(dǎo)航、免費文章檢索和全文鏈接服務(wù)

收錄7000余種開放獲取期刊，其中90%以上期刊經(jīng)過同行評審,收錄約1100余萬篇文章；900余個開放獲取機構(gòu)倉儲，320余萬條記錄

數(shù)據(jù)每天更新

另外：常用的十七大學(xué)術(shù)搜索引擎

【免費期刊全文數(shù)據(jù)庫】——獲取查找到的論文的全文

1.DOAJ

2003年5月由瑞典Lund大學(xué)圖書館推出，提供2800余種期刊的篇目檢索和900余種期刊的全文檢索，收錄論文16萬余篇。

開放獲取期刊：可以免費進行閱讀、下載、復(fù)制、分發(fā)、打印、檢索和全文鏈接的期刊

其特點是研究性和學(xué)術(shù)性強，且全文免費

92.HighWirePress

1995年由斯坦福大學(xué)HighWire出版社建立

生物醫(yī)學(xué)和其它學(xué)科重要期刊的網(wǎng)絡(luò)版，內(nèi)容涉及生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理科學(xué)以及社會科學(xué)期刊和其它的網(wǎng)絡(luò)出版物

3.BioMedCentral

BMC屬獨立的非贏利性血紅素出版機構(gòu)，致力于提供生物醫(yī)學(xué)文獻的開放獲取180余種生物醫(yī)學(xué)開放獲取期刊

內(nèi)容涵蓋生物學(xué)和醫(yī)學(xué)兩大領(lǐng)域

4.PLoSjournal

PLoS于2000年10月成立，屬非營利性組織出版商，致力于使全球范圍內(nèi)的科技和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的文獻成為可以免費獲取的公共資源

5.免費生物醫(yī)學(xué)期刊

400多種期刊，9種語言

免費生物醫(yī)學(xué)圖書導(dǎo)航

6.Biovisa

收集了1000余種在選生物醫(yī)學(xué)期刊信息

7.BiolineInternational

10提供來自發(fā)展中國家的開放獲取的期刊的全文

8.SciELO

提供近200種巴西網(wǎng)絡(luò)版科技期刊

可看到英文文摘，論文全文為葡萄牙語或者英語

9.PubMedCentral

生命科學(xué)期刊文獻全文免費檢索系統(tǒng)

共收錄100余種期刊

10.國外大學(xué)免費碩博全文數(shù)據(jù)庫

UniversitatsbibliothekMunchen(Germany)

UniversityofCampinasFacultyofEducation

UniversityofFlorida

AustralianDigitalThesesProgram

UniversityofNewOrleans

UniversityofPretoria:ElectronicThesesandDissertations

11

1.全球免費全文科技期刊

2.中國研學(xué)資源網(wǎng)——免費學(xué)習(xí)資源,免費論文全文期刊,電子書下載,開放課程,專業(yè)學(xué)習(xí)網(wǎng)站,碩博論文庫

3.國外免費-開放獲取期刊

免費全文期刊大全

4.知網(wǎng)，維普，萬方等各大數(shù)據(jù)庫的免費賬號：

5.【最后一招】：通過免費搜索引擎搜索到的論文，在開放獲取數(shù)據(jù)庫沒有找到全文的話，免費獲取自己所需的論文全文的一個相當(dāng)不錯的方法：

在小木蟲上【文獻求助】版塊——

求助您所需要的論文，幾個小時就可以獲取到全文了，不知道大家有沒有這個感受，“幫助來得太快了”，這就是小木蟲。不過前提是您有些金幣，這個就得要您為論壇做出一點貢獻了，發(fā)些好資源，好經(jīng)驗，與蟲友一起分享。13

（immunodeficientanimal)

T淋巴細胞缺陷裸小鼠、裸大鼠B淋巴細胞缺陷性連鎖免疫缺陷NK細胞缺陷Beige小鼠聯(lián)合免疫缺陷T、B缺陷SCID

TB、NK聯(lián)合缺陷鼠

獲得性免疫缺陷

小鼠、猴、等AIDS模型

免疫缺陷動物先天免疫缺陷第七章免疫缺陷動物14一）裸小鼠(nudemice)BALB/c裸基因位于11號染色體，主要特征：無毛（Hairless）、裸體（Naked）和無胸腺（Athymus）。毛發(fā)發(fā)育異常，不能讓T細胞正常分化，細胞免疫低下，B細胞功能正常繁殖：雄鼠精子尾部呈盤卷狀，無活動力，由于純合雌裸鼠受孕率低，會食仔因此繁殖：純合雄鼠（nu/nu)

X雜合雌鼠(+/nu)--正常鼠（繁殖）和裸鼠（實驗用）153、裸鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用（1）組織移植（人類腫瘤移植）研究結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腎癌、宮頸癌等移植成功，并可傳代。我國：人體結(jié)腸癌、直腸癌、食道癌、乳腺癌、宮頸癌、咽癌、骨巨噬細胞癌的移植均獲得了成功。17（2）腫瘤藥物治療和腫瘤免疫研究移植發(fā)囊，視網(wǎng)膜母細胞瘤等人的Burkitt淋巴瘤的裸鼠移植后對環(huán)磷酰胺有較高的敏感性，也與臨床結(jié)果相符。其它腫瘤如乳腺癌和結(jié)腸癌裸鼠移植，對前者阿霉素和苯丙氨酸氮芥（7mg/kg）均有一定的抑瘤效能，對后者甲基-CCNO和絲裂毒素也明顯療效。有人用胸腺嘧啶核苷等444～888mg/kg給腫瘤裸鼠連續(xù)灌注96～140小時，發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制人體黑色素瘤及畸胎瘤的生長，并導(dǎo)致腫瘤消退而對宿主無明顯毒性，這些新結(jié)果已引起了臨床重視。18（3）免疫和遺傳研究先天性無胸腺裸鼠的遺傳因素，免疫動物原缺陷指標(biāo)以及剖檢所見和組織學(xué)觀察等特征，均與人類免疫缺陷性疾病中的原發(fā)性細胞免疫病相似。各品系裸鼠因遺傳背景的不同，所表現(xiàn)的細胞免疫反應(yīng)和實驗室檢查指標(biāo)亦各不相同，這些裸鼠種群是研究人類各種免疫缺陷性疾病的發(fā)病機理和遺傳規(guī)律的動物模型。我國所應(yīng)用的自發(fā)性免疫缺陷小鼠，主要應(yīng)用的是BALB/c為遺傳背景的裸鼠，個別實驗室也應(yīng)用了NIH、ICR等非近交系裸鼠19（5）生物制品和藥品的檢定生物制品（疫苗、菌苗）的安全性的免疫原性是制品必不可少的內(nèi)容之一。它涉及制品是否有潛在致癌性、感染因子以及它的毒力是否有返祖的可能性。特別是在應(yīng)用動物組織培養(yǎng)疫苗或人類二倍體細胞株時，對檢出這些細胞潛在的致癌性，某些制品引起的異常發(fā)應(yīng)及其發(fā)生機理，對藥物致癌性或抗癌藥物的研究等諸方面，先天性胸腺機能缺陷的裸鼠是很好的動物模型和實驗手段。21（6）微生物學(xué)上的研究以往麻風(fēng)桿菌只在背上有九條紋的犰狳（Armadillo）身上才能生長，而這種產(chǎn)于南美等地的動物難于尋找，也不易飼養(yǎng)和操作。1975年Colston等將麻風(fēng)桿菌接種于裸鼠足掌，發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)桿菌可大量繁殖，引起瘤型麻風(fēng)。又如淋巴細胞性脈絡(luò)膜腦膜炎（LCM）病毒經(jīng)腦內(nèi)接種于無本病毒隱性感染的正常小鼠，可引起腦膜炎，感染細胞被當(dāng)作靶細胞而受到破壞，在腦、脊髓內(nèi)發(fā)生了明顯的細胞免疫反應(yīng)，但在T細胞缺損的裸鼠所見卻完全相反，未導(dǎo)致動物的死亡，僅出現(xiàn)持續(xù)病毒血癥，體內(nèi)不出現(xiàn)LCM抗體，也無任何免疫反應(yīng)。22二）裸大鼠(nuderat)一、生物學(xué)特點1953年發(fā)現(xiàn)，裸大鼠(nuderat)無胸腺，缺T細胞，B細胞功能正常（血清更多）四肢有少量毛23五）嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（severe-combinedimmuodeficientmiceSCID）外觀正常，造成T細胞不能分化成功能淋巴細胞，無抗體反應(yīng).胸腺、脾、淋巴結(jié)重量不及正常的30%,組織學(xué)上淋巴細胞顯著缺乏，T、B細胞功能陰性，對外來抗原無細胞免疫和抗體反應(yīng)，但其巨噬細胞、紅細胞、自然殺傷細胞等功能正常。25許多人類寄生蟲不能感染其它小鼠，而SCID小鼠不但可被人類絲蟲病所感染，而且所出現(xiàn)的病變也與人類相似，因此是研究人類寄生蟲病的新動物模型SCID小鼠腫瘤移植存活率高達36.9％，一般裸鼠為16.8％．少數(shù)可恢復(fù)免疫功能，稱為滲漏現(xiàn)象繁殖：純合子兄妹交配2629二腫瘤的不同移植途徑1）皮下移植（2）腹腔注射：0.2ml細胞懸液注入腹腔,若注入皮下可形成實體瘤（3）腎包膜下移植（人卵巢癌細胞系雙側(cè)移植）（4）原位移植（orthotopic)：如肝癌、肺癌移植到肝、肺中乳腺癌細胞，用1ml注射器將腫瘤細胞接種于裸小鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊，接種量每只為只0.2ml含有2X106個細胞；1個月后(腫瘤長、短徑大于1mm)開始治療。

30舉例結(jié)腸癌原位移植：0.1ml細胞懸液注入腸壁肺癌原位移植：１）支氣管移植：0.03ml細胞懸液注入支氣管２）瘤塊直接植入：１mm3

瘤塊（５塊左右）縫入肺腫瘤保存：細胞懸液保存－－－液氮保存２年甚至１０年3132三影響移植模型成功的因素一激素

如乳腺癌細胞在雌鼠可生長，卵巢切除后不生長，但注射雌激素可生長．前列腺癌細胞可在雄鼠中生長二鼠年齡有關(guān)

小鼠（３周齡）更容易生長三腫瘤自身特征

結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤最高，乳腺癌低，分化低的也高四滲漏現(xiàn)象（少數(shù)ＳＣＩＤ鼠會恢復(fù)免疫功能），通過射線照射解決33五移植部位：腋下好，腎包膜下高于皮下，腦內(nèi)接種最高（IgM不能通過血腦屏障），皮下很少轉(zhuǎn)移，腹腔易轉(zhuǎn)移六健康高清潔的環(huán)境中的裸鼠更易成功3435第八章基因工程動物一）轉(zhuǎn)基因動物通過基因工程對DNA進行體外操作，添加或刪除一個特殊的DNA序列，然后導(dǎo)入早期胚胎細胞中，產(chǎn)生遺傳結(jié)構(gòu)得以修飾的動物，其改變的性狀可以遺傳給后代。二）基因敲除動物三）克隆動物36轉(zhuǎn)基因動物和

基因敲除轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)基因敲除(geneknockout)37血友病B的治療38基因工程產(chǎn)生的問題：價格高?只能生產(chǎn)簡單的小分子擔(dān)保，不能生產(chǎn)有著復(fù)雜結(jié)構(gòu)的大分子蛋白?環(huán)境污染？數(shù)量有限？39第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物一、概述轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal):用人工方法將外源DNA導(dǎo)入或整合到動物基因組內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的動物。1982年Brinster&Palmiter大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫?0supermice41各種轉(zhuǎn)基因生物424344454647二、基本原理外源基因構(gòu)成順式作用元件+結(jié)構(gòu)基因+報告基因（融合基因）報告基因常為熒光素酶、β-半乳糖苷酶和綠色熒光蛋白（GFP)48外源基因的引入顯微注射注射入受精卵結(jié)合克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物胚胎干細胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法發(fā)育植入受體動物的子宮或輸卵管轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的檢測Southern雜交、Northern雜交、Western印跡49三、基本方法1.顯微注射法優(yōu)點:導(dǎo)入速度快、操作簡單對DNA大小無限制缺點:實驗設(shè)備昂貴簡化流程目的DNA制備——基因工程準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）準(zhǔn)備供體母鼠——提供受精卵顯微注射入雄性原核植入養(yǎng)母子宮、輸卵管外源基因整合及表達檢測通過互交、回交等育種手段獲得純合子傳代純合子轉(zhuǎn)基因鼠（若外源基因的整合發(fā)生在細胞分裂后則只能得到嵌合體小鼠）50注射量僅一微微升512結(jié)合克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物52克隆胚胎發(fā)育階段53去核過程注射過程54各種克隆動物5556573.胚胎干細胞法——ES細胞特點：ES具有全能性。簡化流程獲取ES細胞穩(wěn)定傳代防止分化轉(zhuǎn)化ES細胞（引入新基因、誘導(dǎo)基因突變、基因組改造等）篩選后克隆注射入囊胚期的胚胎中植入養(yǎng)母子宮，篩選嵌合體子代通過回交、互交等育種手段獲得純合子后代穩(wěn)定傳代5859604.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法主要適合于家禽類，其受精卵在出生時已發(fā)展至桑椹胚期5.精子載體法將外源DNA吸附到精子中洗滌精子電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等優(yōu)點：便宜機制未明：懷疑與CD4蛋白有關(guān)6162注射過程

去核過程63四、轉(zhuǎn)基因動物的可能應(yīng)用基因產(chǎn)品的制備——生物制藥使用乳球蛋白的啟動子可以使外源基因在乳腺中特異表達異種器官移植——轉(zhuǎn)基因豬（實驗階段）建立人類疾病動物模型等高脂血癥（HLP）、AS、高血壓、低血壓等心血管疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型已成功建立培育新品種加速生長抵抗疾病擴大生存范圍——耐寒能力等64656667三、轉(zhuǎn)基因植物安全性探討緣起1998年，蘇格蘭免疫學(xué)家普茲太聲稱轉(zhuǎn)基因土豆對老鼠有毒，能破壞其免疫系統(tǒng)（實際上是腸道損害），歐洲輿論因之大嘩，導(dǎo)致歐盟限制轉(zhuǎn)基因食物進口。1999年5月，美國康奈爾大學(xué)洛希（JohnLosey）實驗室向英國《自然》雜志報告說，他們用沾有抗蟲害轉(zhuǎn)基因玉米花粉的草葉喂養(yǎng)大花蝶的幼蟲，導(dǎo)致這些毛毛蟲死亡．68熱門問題對人體的毒副作用及引發(fā)過敏外源基因在自然界不受控制的隨機轉(zhuǎn)移導(dǎo)致基因污染抗生素抗性基因（常用于篩選）抗除草劑基因抗蟲害基因?qū)е鲁壓οx以及對生態(tài)環(huán)境的危害我國抗蟲棉已占棉花種植面積的35％侵犯宗教信仰把豬的基因轉(zhuǎn)移到牛中等69世界上沒有絕對的安全正確的提問有沒有合理的理由和確鑿的證據(jù)表明市場上的轉(zhuǎn)基因食品要比相應(yīng)的“天然”食品更有害健康？普茲太的實驗動物數(shù)量太少、缺乏對照、膳食不合理、最后土豆是生的花粉實驗中，花粉濃度遠遠高于自然界中的情況，而且毛毛蟲只有被花粉污染的草葉可吃。對策過敏避開易引起過敏的物種基因（牛奶、干果、蛋類、海產(chǎn)品、小麥、豆類）基因污染植物基因在消化道中轉(zhuǎn)移給微生物，僅在結(jié)腸全切的情況中偶見。2001年2月《自然》雜志發(fā)表了一項在英國進行的長達十年的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因土豆、甜菜、油菜和玉米并沒有將基因污染給周圍的野草。7071第三節(jié)基因敲除原理：通過基因同源重組的過程定向地從及基因組上移除特定基因的過程。DNA定點同源重組在同源依賴的重組酶的作用下，配對的同源雙鏈DNA分子可以彼此交換DNA片斷的現(xiàn)象。分類基因敲除——常用于個體水平上的基因功能研究基因敲入——可用于基因治療727374日本科學(xué)家最近通過改變老鼠的基因，培育出了一只不怕貓的老鼠75一、條件ES細胞的制備和培養(yǎng)打靶載體：Neor（抗新霉素）陽性篩選標(biāo)志位于同源區(qū)內(nèi)，表征重組成功的篩選標(biāo)志新霉素（G418）——氨基甙類抗生素，具耳毒性HSV-tk（具自殺性質(zhì)）陰性篩選標(biāo)志來源于單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶位于同源區(qū)外，表征重組區(qū)域精確的篩選標(biāo)志GCV——自殺性底物76二、基因敲除簡化流程構(gòu)建打靶載體制備待敲除基因兩端同源片斷目的基因鏈接到質(zhì)粒中并切除其中央大部分區(qū)域?qū)eo基因鏈接到同源片斷中間導(dǎo)入ES細胞并篩選注射入胚泡并植入假孕小鼠子宮嵌合體小鼠雜交育種獲得純系7778798081普希金假如生活欺騙了你,

不要悲傷,不要心急!憂郁的日子里需要鎮(zhèn)靜:相信吧！快樂的日子將會來臨。

心永遠向往著未來；現(xiàn)在卻常是憂郁：一切都是瞬息，一切都會將過去；

而那過去了的，就會成為親切的懷念。82你知道我在等你嗎

莫名我就喜歡你深深地愛上你

沒有理由沒有原因

莫名我就喜歡你深深地愛上你

從見到你的那一天起

你知道我在等你嗎你如果真的在乎我

又怎會讓無盡的夜陪我度過

你知道我在等你嗎你如果真的在乎我

又怎會讓握花的手在風(fēng)中顫抖

莫名我就喜歡你深深地愛上你

在黑夜里傾聽你的聲音83大中國

我們都有一個家，名字叫中國，兄弟姐妹都很多，景色也不錯，家里盤著兩條龍

是長江與黃河，還有珠穆朗瑪峰兒是最高山坡

我們都有一個家，名字叫中國兄弟姐妹都很多，景色也不錯，看那一條長城萬里在云中穿梭

看那青藏高原比那天空還遼闊，我們的大中國呀

好大的一個家，經(jīng)過那個多少

那個風(fēng)吹和雨打

我們的大中國呀好大的一個家

永遠那個永遠那個我要伴隨她

中國祝福你，你永遠在我心里

中國祝福你，不用千言和萬語

84國際歌起來,饑寒交迫的奴隸

起來