轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物課件

1Callaspade，aspade實(shí)事求是Afallinpitagaininwit吃一塹長一智Themanwhohasmadeuphismindtowinwillneversay“impossible”一個(gè)決心取勝的人從來都不會(huì)說“不可能”Fourshortwordssumupwhathasliftedmostsuccessfulindividualsabovethecrowed:alittlebitmore成功的秘訣就是四個(gè)簡單的字：多一點(diǎn)點(diǎn)（凡事比別人多一點(diǎn)點(diǎn)，多一點(diǎn)努力多一點(diǎn)實(shí)踐多一點(diǎn)瘋狂，多一點(diǎn)點(diǎn)就能創(chuàng)造奇跡）2

你是一個(gè)富翁如果早上醒來，你發(fā)現(xiàn)自己還能自由呼吸，你就比在這一周離開人世的100萬人更有福氣。如果你從未經(jīng)歷過戰(zhàn)爭的危險(xiǎn)、被囚禁的孤寂、受折磨的痛苦和忍饑挨餓的難受、你已經(jīng)好過世界上5億人。如果你的冰箱里有食物，身上有足夠的衣服，有屋棲身，你已經(jīng)比世界上70%的人更富足。如果你銀行戶頭有存款，錢包里有現(xiàn)金，你已經(jīng)身居世界上最富有的80%的人之列。如果你的雙親仍然在世，并且沒有分居或離婚，你已屬于稀少的一群。如果你能讀到這段文字，那么，你更是擁有雙份的福氣，你比20億不能閱讀的人更幸福。3父母在,不遠(yuǎn)游,游必有方。父母之年,不可不記。一則以喜，一則以憂。夫樹欲靜而風(fēng)不止，子欲養(yǎng)而親不待?！弊釉?“古之孝者,是謂能養(yǎng)。至于犬馬,皆能有養(yǎng),不敬,何以別乎?”5休無休時(shí)，了無了時(shí)人肯當(dāng)下休，便當(dāng)下了。若要尋個(gè)歇處，則婚嫁雖完，事亦不少。僧道雖好，心亦不了。前人云：“如今休去便休去。若覓了時(shí)無了時(shí)。”見之卓矣。6王維《九月九日憶山東兄弟》獨(dú)在異鄉(xiāng)為異客，每逢佳節(jié)倍思親。遙知兄弟登高處，遍插茱萸少一人。采桑子重陽-------毛澤東人生易老天難老，歲歲重陽，今又重陽，戰(zhàn)地黃花分外香。一年一度秋風(fēng)勁，不似春光，勝似春光，寥廓江天萬里霜。過故人莊[孟浩然]故人具雞黍，邀我至田家。綠樹村邊合，青山郭外斜。開軒面場圃，把酒話桑麻。待到重陽日，還來就菊花。

76.Ojose

OJOSE是一款免費(fèi)的科學(xué)搜索引擎，用戶只需要輸入一個(gè)檢索字段就可以在60多個(gè)不同的數(shù)據(jù)庫之間進(jìn)行檢索

7.Cogprint

Cogprint系統(tǒng)主要集中于一些認(rèn)知科學(xué)領(lǐng)域的電子存檔文件

學(xué)科領(lǐng)域包括心理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、語言學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等

8.Socolar

Socolar是開放獲取資源的平臺(tái)，提供基于開放獲取期刊和開放獲取機(jī)構(gòu)倉儲(chǔ)的導(dǎo)航、免費(fèi)文章檢索和全文鏈接服務(wù)

收錄7000余種開放獲取期刊，其中90%以上期刊經(jīng)過同行評(píng)審,收錄約1100余萬篇文章；900余個(gè)開放獲取機(jī)構(gòu)倉儲(chǔ)，320余萬條記錄

數(shù)據(jù)每天更新

另外：常用的十七大學(xué)術(shù)搜索引擎

【免費(fèi)期刊全文數(shù)據(jù)庫】——獲取查找到的論文的全文

1.DOAJ

2003年5月由瑞典Lund大學(xué)圖書館推出，提供2800余種期刊的篇目檢索和900余種期刊的全文檢索，收錄論文16萬余篇。

開放獲取期刊：可以免費(fèi)進(jìn)行閱讀、下載、復(fù)制、分發(fā)、打印、檢索和全文鏈接的期刊

其特點(diǎn)是研究性和學(xué)術(shù)性強(qiáng)，且全文免費(fèi)

92.HighWirePress

1995年由斯坦福大學(xué)HighWire出版社建立

生物醫(yī)學(xué)和其它學(xué)科重要期刊的網(wǎng)絡(luò)版，內(nèi)容涉及生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理科學(xué)以及社會(huì)科學(xué)期刊和其它的網(wǎng)絡(luò)出版物

3.BioMedCentral

BMC屬獨(dú)立的非贏利性血紅素出版機(jī)構(gòu)，致力于提供生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)的開放獲取180余種生物醫(yī)學(xué)開放獲取期刊

內(nèi)容涵蓋生物學(xué)和醫(yī)學(xué)兩大領(lǐng)域

4.PLoSjournal

PLoS于2000年10月成立，屬非營利性組織出版商，致力于使全球范圍內(nèi)的科技和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的文獻(xiàn)成為可以免費(fèi)獲取的公共資源

5.免費(fèi)生物醫(yī)學(xué)期刊

400多種期刊，9種語言

免費(fèi)生物醫(yī)學(xué)圖書導(dǎo)航

6.Biovisa

收集了1000余種在選生物醫(yī)學(xué)期刊信息

7.BiolineInternational

10提供來自發(fā)展中國家的開放獲取的期刊的全文

8.SciELO

提供近200種巴西網(wǎng)絡(luò)版科技期刊

可看到英文文摘，論文全文為葡萄牙語或者英語

9.PubMedCentral

生命科學(xué)期刊文獻(xiàn)全文免費(fèi)檢索系統(tǒng)

共收錄100余種期刊

10.國外大學(xué)免費(fèi)碩博全文數(shù)據(jù)庫

UniversitatsbibliothekMunchen(Germany)

UniversityofCampinasFacultyofEducation

UniversityofFlorida

AustralianDigitalThesesProgram

UniversityofNewOrleans

UniversityofPretoria:ElectronicThesesandDissertations

11

1.全球免費(fèi)全文科技期刊

2.中國研學(xué)資源網(wǎng)——免費(fèi)學(xué)習(xí)資源,免費(fèi)論文全文期刊,電子書下載,開放課程,專業(yè)學(xué)習(xí)網(wǎng)站,碩博論文庫

3.國外免費(fèi)-開放獲取期刊

免費(fèi)全文期刊大全

4.知網(wǎng)，維普，萬方等各大數(shù)據(jù)庫的免費(fèi)賬號(hào)：

5.【最后一招】：通過免費(fèi)搜索引擎搜索到的論文，在開放獲取數(shù)據(jù)庫沒有找到全文的話，免費(fèi)獲取自己所需的論文全文的一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的方法：

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（immunodeficientanimal)

T淋巴細(xì)胞缺陷裸小鼠、裸大鼠B淋巴細(xì)胞缺陷性連鎖免疫缺陷NK細(xì)胞缺陷Beige小鼠聯(lián)合免疫缺陷T、B缺陷SCID

TB、NK聯(lián)合缺陷鼠

獲得性免疫缺陷

小鼠、猴、等AIDS模型

免疫缺陷動(dòng)物先天免疫缺陷第七章免疫缺陷動(dòng)物14一）裸小鼠(nudemice)BALB/c裸基因位于11號(hào)染色體，主要特征：無毛（Hairless）、裸體（Naked）和無胸腺（Athymus）。毛發(fā)發(fā)育異常，不能讓T細(xì)胞正常分化，細(xì)胞免疫低下，B細(xì)胞功能正常繁殖：雄鼠精子尾部呈盤卷狀，無活動(dòng)力，由于純合雌裸鼠受孕率低，會(huì)食仔因此繁殖：純合雄鼠（nu/nu)

X雜合雌鼠(+/nu)--正常鼠（繁殖）和裸鼠（實(shí)驗(yàn)用）153、裸鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用（1）組織移植（人類腫瘤移植）研究結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腎癌、宮頸癌等移植成功，并可傳代。我國：人體結(jié)腸癌、直腸癌、食道癌、乳腺癌、宮頸癌、咽癌、骨巨噬細(xì)胞癌的移植均獲得了成功。17（2）腫瘤藥物治療和腫瘤免疫研究移植發(fā)囊，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等人的Burkitt淋巴瘤的裸鼠移植后對(duì)環(huán)磷酰胺有較高的敏感性，也與臨床結(jié)果相符。其它腫瘤如乳腺癌和結(jié)腸癌裸鼠移植，對(duì)前者阿霉素和苯丙氨酸氮芥（7mg/kg）均有一定的抑瘤效能，對(duì)后者甲基-CCNO和絲裂毒素也明顯療效。有人用胸腺嘧啶核苷等444～888mg/kg給腫瘤裸鼠連續(xù)灌注96～140小時(shí)，發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制人體黑色素瘤及畸胎瘤的生長，并導(dǎo)致腫瘤消退而對(duì)宿主無明顯毒性，這些新結(jié)果已引起了臨床重視。18（3）免疫和遺傳研究先天性無胸腺裸鼠的遺傳因素，免疫動(dòng)物原缺陷指標(biāo)以及剖檢所見和組織學(xué)觀察等特征，均與人類免疫缺陷性疾病中的原發(fā)性細(xì)胞免疫病相似。各品系裸鼠因遺傳背景的不同，所表現(xiàn)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)亦各不相同，這些裸鼠種群是研究人類各種免疫缺陷性疾病的發(fā)病機(jī)理和遺傳規(guī)律的動(dòng)物模型。我國所應(yīng)用的自發(fā)性免疫缺陷小鼠，主要應(yīng)用的是BALB/c為遺傳背景的裸鼠，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)用了NIH、ICR等非近交系裸鼠19（5）生物制品和藥品的檢定生物制品（疫苗、菌苗）的安全性的免疫原性是制品必不可少的內(nèi)容之一。它涉及制品是否有潛在致癌性、感染因子以及它的毒力是否有返祖的可能性。特別是在應(yīng)用動(dòng)物組織培養(yǎng)疫苗或人類二倍體細(xì)胞株時(shí)，對(duì)檢出這些細(xì)胞潛在的致癌性，某些制品引起的異常發(fā)應(yīng)及其發(fā)生機(jī)理，對(duì)藥物致癌性或抗癌藥物的研究等諸方面，先天性胸腺機(jī)能缺陷的裸鼠是很好的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)手段。21（6）微生物學(xué)上的研究以往麻風(fēng)桿菌只在背上有九條紋的犰狳（Armadillo）身上才能生長，而這種產(chǎn)于南美等地的動(dòng)物難于尋找，也不易飼養(yǎng)和操作。1975年Colston等將麻風(fēng)桿菌接種于裸鼠足掌，發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)桿菌可大量繁殖，引起瘤型麻風(fēng)。又如淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎（LCM）病毒經(jīng)腦內(nèi)接種于無本病毒隱性感染的正常小鼠，可引起腦膜炎，感染細(xì)胞被當(dāng)作靶細(xì)胞而受到破壞，在腦、脊髓內(nèi)發(fā)生了明顯的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但在T細(xì)胞缺損的裸鼠所見卻完全相反，未導(dǎo)致動(dòng)物的死亡，僅出現(xiàn)持續(xù)病毒血癥，體內(nèi)不出現(xiàn)LCM抗體，也無任何免疫反應(yīng)。22二）裸大鼠(nuderat)一、生物學(xué)特點(diǎn)1953年發(fā)現(xiàn)，裸大鼠(nuderat)無胸腺，缺T細(xì)胞，B細(xì)胞功能正常（血清更多）四肢有少量毛23五）嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（severe-combinedimmuodeficientmiceSCID）外觀正常，造成T細(xì)胞不能分化成功能淋巴細(xì)胞，無抗體反應(yīng).胸腺、脾、淋巴結(jié)重量不及正常的30%,組織學(xué)上淋巴細(xì)胞顯著缺乏，T、B細(xì)胞功能陰性，對(duì)外來抗原無細(xì)胞免疫和抗體反應(yīng)，但其巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等功能正常。25許多人類寄生蟲不能感染其它小鼠，而SCID小鼠不但可被人類絲蟲病所感染，而且所出現(xiàn)的病變也與人類相似，因此是研究人類寄生蟲病的新動(dòng)物模型SCID小鼠腫瘤移植存活率高達(dá)36.9％，一般裸鼠為16.8％．少數(shù)可恢復(fù)免疫功能，稱為滲漏現(xiàn)象繁殖：純合子兄妹交配2629二腫瘤的不同移植途徑1）皮下移植（2）腹腔注射：0.2ml細(xì)胞懸液注入腹腔,若注入皮下可形成實(shí)體瘤（3）腎包膜下移植（人卵巢癌細(xì)胞系雙側(cè)移植）（4）原位移植（orthotopic)：如肝癌、肺癌移植到肝、肺中乳腺癌細(xì)胞，用1ml注射器將腫瘤細(xì)胞接種于裸小鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊，接種量每只為只0.2ml含有2X106個(gè)細(xì)胞；1個(gè)月后(腫瘤長、短徑大于1mm)開始治療。

30舉例結(jié)腸癌原位移植：0.1ml細(xì)胞懸液注入腸壁肺癌原位移植：１）支氣管移植：0.03ml細(xì)胞懸液注入支氣管２）瘤塊直接植入：１mm3

瘤塊（５塊左右）縫入肺腫瘤保存：細(xì)胞懸液保存－－－液氮保存２年甚至１０年3132三影響移植模型成功的因素一激素

如乳腺癌細(xì)胞在雌鼠可生長，卵巢切除后不生長，但注射雌激素可生長．前列腺癌細(xì)胞可在雄鼠中生長二鼠年齡有關(guān)

小鼠（３周齡）更容易生長三腫瘤自身特征

結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤最高，乳腺癌低，分化低的也高四滲漏現(xiàn)象（少數(shù)ＳＣＩＤ鼠會(huì)恢復(fù)免疫功能），通過射線照射解決33五移植部位：腋下好，腎包膜下高于皮下，腦內(nèi)接種最高（IgM不能通過血腦屏障），皮下很少轉(zhuǎn)移，腹腔易轉(zhuǎn)移六健康高清潔的環(huán)境中的裸鼠更易成功3435第八章基因工程動(dòng)物一）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過基因工程對(duì)DNA進(jìn)行體外操作，添加或刪除一個(gè)特殊的DNA序列，然后導(dǎo)入早期胚胎細(xì)胞中，產(chǎn)生遺傳結(jié)構(gòu)得以修飾的動(dòng)物，其改變的性狀可以遺傳給后代。二）基因敲除動(dòng)物三）克隆動(dòng)物36轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和

基因敲除轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)基因敲除(geneknockout)37血友病B的治療38基因工程產(chǎn)生的問題：價(jià)格高?只能生產(chǎn)簡單的小分子擔(dān)保，不能生產(chǎn)有著復(fù)雜結(jié)構(gòu)的大分子蛋白?環(huán)境污染？數(shù)量有限？39第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一、概述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal):用人工方法將外源DNA導(dǎo)入或整合到動(dòng)物基因組內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的動(dòng)物。1982年Brinster&Palmiter大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫?0supermice41各種轉(zhuǎn)基因生物424344454647二、基本原理外源基因構(gòu)成順式作用元件+結(jié)構(gòu)基因+報(bào)告基因（融合基因）報(bào)告基因常為熒光素酶、β-半乳糖苷酶和綠色熒光蛋白（GFP)48外源基因的引入顯微注射注射入受精卵結(jié)合克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法發(fā)育植入受體動(dòng)物的子宮或輸卵管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因的檢測Southern雜交、Northern雜交、Western印跡49三、基本方法1.顯微注射法優(yōu)點(diǎn):導(dǎo)入速度快、操作簡單對(duì)DNA大小無限制缺點(diǎn):實(shí)驗(yàn)設(shè)備昂貴簡化流程目的DNA制備——基因工程準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）準(zhǔn)備供體母鼠——提供受精卵顯微注射入雄性原核植入養(yǎng)母子宮、輸卵管外源基因整合及表達(dá)檢測通過互交、回交等育種手段獲得純合子傳代純合子轉(zhuǎn)基因鼠（若外源基因的整合發(fā)生在細(xì)胞分裂后則只能得到嵌合體小鼠）50注射量僅一微微升512結(jié)合克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物52克隆胚胎發(fā)育階段53去核過程注射過程54各種克隆動(dòng)物5556573.胚胎干細(xì)胞法——ES細(xì)胞特點(diǎn)：ES具有全能性。簡化流程獲取ES細(xì)胞穩(wěn)定傳代防止分化轉(zhuǎn)化ES細(xì)胞（引入新基因、誘導(dǎo)基因突變、基因組改造等）篩選后克隆注射入囊胚期的胚胎中植入養(yǎng)母子宮，篩選嵌合體子代通過回交、互交等育種手段獲得純合子后代穩(wěn)定傳代5859604.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法主要適合于家禽類，其受精卵在出生時(shí)已發(fā)展至桑椹胚期5.精子載體法將外源DNA吸附到精子中洗滌精子電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等優(yōu)點(diǎn)：便宜機(jī)制未明：懷疑與CD4蛋白有關(guān)6162注射過程

去核過程63四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的可能應(yīng)用基因產(chǎn)品的制備——生物制藥使用乳球蛋白的啟動(dòng)子可以使外源基因在乳腺中特異表達(dá)異種器官移植——轉(zhuǎn)基因豬（實(shí)驗(yàn)階段）建立人類疾病動(dòng)物模型等高脂血癥（HLP）、AS、高血壓、低血壓等心血管疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型已成功建立培育新品種加速生長抵抗疾病擴(kuò)大生存范圍——耐寒能力等64656667三、轉(zhuǎn)基因植物安全性探討緣起1998年，蘇格蘭免疫學(xué)家普茲太聲稱轉(zhuǎn)基因土豆對(duì)老鼠有毒，能破壞其免疫系統(tǒng)（實(shí)際上是腸道損害），歐洲輿論因之大嘩，導(dǎo)致歐盟限制轉(zhuǎn)基因食物進(jìn)口。1999年5月，美國康奈爾大學(xué)洛希（JohnLosey）實(shí)驗(yàn)室向英國《自然》雜志報(bào)告說，他們用沾有抗蟲害轉(zhuǎn)基因玉米花粉的草葉喂養(yǎng)大花蝶的幼蟲，導(dǎo)致這些毛毛蟲死亡．68熱門問題對(duì)人體的毒副作用及引發(fā)過敏外源基因在自然界不受控制的隨機(jī)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致基因污染抗生素抗性基因（常用于篩選）抗除草劑基因抗蟲害基因?qū)е鲁?jí)害蟲以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害我國抗蟲棉已占棉花種植面積的35％侵犯宗教信仰把豬的基因轉(zhuǎn)移到牛中等69世界上沒有絕對(duì)的安全正確的提問有沒有合理的理由和確鑿的證據(jù)表明市場上的轉(zhuǎn)基因食品要比相應(yīng)的“天然”食品更有害健康？普茲太的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量太少、缺乏對(duì)照、膳食不合理、最后土豆是生的花粉實(shí)驗(yàn)中，花粉濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然界中的情況，而且毛毛蟲只有被花粉污染的草葉可吃。對(duì)策過敏避開易引起過敏的物種基因（牛奶、干果、蛋類、海產(chǎn)品、小麥、豆類）基因污染植物基因在消化道中轉(zhuǎn)移給微生物，僅在結(jié)腸全切的情況中偶見。2001年2月《自然》雜志發(fā)表了一項(xiàng)在英國進(jìn)行的長達(dá)十年的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因土豆、甜菜、油菜和玉米并沒有將基因污染給周圍的野草。7071第三節(jié)基因敲除原理：通過基因同源重組的過程定向地從及基因組上移除特定基因的過程。DNA定點(diǎn)同源重組在同源依賴的重組酶的作用下，配對(duì)的同源雙鏈DNA分子可以彼此交換DNA片斷的現(xiàn)象。分類基因敲除——常用于個(gè)體水平上的基因功能研究基因敲入——可用于基因治療727374日本科學(xué)家最近通過改變老鼠的基因，培育出了一只不怕貓的老鼠75一、條件ES細(xì)胞的制備和培養(yǎng)打靶載體：Neor（抗新霉素）陽性篩選標(biāo)志位于同源區(qū)內(nèi)，表征重組成功的篩選標(biāo)志新霉素（G418）——氨基甙類抗生素，具耳毒性HSV-tk（具自殺性質(zhì)）陰性篩選標(biāo)志來源于單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶位于同源區(qū)外，表征重組區(qū)域精確的篩選標(biāo)志GCV——自殺性底物76二、基因敲除簡化流程構(gòu)建打靶載體制備待敲除基因兩端同源片斷目的基因鏈接到質(zhì)粒中并切除其中央大部分區(qū)域?qū)eo基因鏈接到同源片斷中間導(dǎo)入ES細(xì)胞并篩選注射入胚泡并植入假孕小鼠子宮嵌合體小鼠雜交育種獲得純系7778798081普希金假如生活欺騙了你,

不要悲傷,不要心急!憂郁的日子里需要鎮(zhèn)靜:相信吧！快樂的日子將會(huì)來臨。

心永遠(yuǎn)向往著未來；現(xiàn)在卻常是憂郁：一切都是瞬息，一切都會(huì)將過去；

而那過去了的，就會(huì)成為親切的懷念。82你知道我在等你嗎

莫名我就喜歡你深深地愛上你

沒有理由沒有原因

莫名我就喜歡你深深地愛上你

從見到你的那一天起

你知道我在等你嗎你如果真的在乎我

又怎會(huì)讓無盡的夜陪我度過

你知道我在等你嗎你如果真的在乎我

又怎會(huì)讓握花的手在風(fēng)中顫抖

莫名我就喜歡你深深地愛上你

在黑夜里傾聽你的聲音83大中國

我們都有一個(gè)家，名字叫中國，兄弟姐妹都很多，景色也不錯(cuò)，家里盤著兩條龍

是長江與黃河，還有珠穆朗瑪峰兒是最高山坡

我們都有一個(gè)家，名字叫中國兄弟姐妹都很多，景色也不錯(cuò)，看那一條長城萬里在云中穿梭

看那青藏高原比那天空還遼闊，我們的大中國呀

好大的一個(gè)家，經(jīng)過那個(gè)多少

那個(gè)風(fēng)吹和雨打

我們的大中國呀好大的一個(gè)家

永遠(yuǎn)那個(gè)永遠(yuǎn)那個(gè)我要伴隨她

中國祝福你，你永遠(yuǎn)在我心里

中國祝福你，不用千言和萬語

84國際歌起來,饑寒交迫的奴隸

起來