生物化學(xué)1第一章蛋白質(zhì)化學(xué)zjg課件

第一章蛋白質(zhì)化學(xué)生物化學(xué)張金國教授4/10/20231ZhangJG-Biochemistry第一章蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)氨基酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)第三節(jié)

蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第四節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定第五節(jié)蛋白質(zhì)測序4/10/20232ZhangJG-Biochemistry早在1878年，恩格斯就在《反杜林論》中指出:“生命是蛋白體的存在方式?！爆F(xiàn)代生物化學(xué)的實踐完全證實并發(fā)展了恩格斯的論斷：第一，蛋白體是生命的物質(zhì)基礎(chǔ);第二，生命是物質(zhì)運動的特殊形式，是蛋白體的存在方式;第三，這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝。

蛋白質(zhì)概述4/10/20233ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)的分類1、按分子外形的對稱程度：球狀蛋白質(zhì)：溶解性較好、能結(jié)晶，占大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)：可溶性：如血纖維蛋白；不溶性：如膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白4/10/20235ZhangJG-Biochemistry2、按化學(xué)組成：簡單蛋白：完全由氨基酸構(gòu)成結(jié)合蛋白：蛋白質(zhì)＋非蛋白部分（輔基）4/10/20236ZhangJG-Biochemistry3、按溶解度分：可溶、醇溶、不溶清蛋白(albumin)：又稱白蛋白，溶于水，如血清清蛋白、乳清蛋白等。球蛋白(globulin)：微溶于水，易溶于稀中性鹽溶液，如血清球蛋白、肌球蛋白和大豆球蛋白等。精蛋白(protamine)：溶于水及酸性溶液，呈堿性，如魚精蛋白。組蛋白(histone)：溶于水及稀酸溶液，呈堿性，如球蛋白。谷蛋白(glutelin)：不溶于水，溶于70％～80％乙醇，如玉米蛋白。硬蛋白(albuminoid)：不溶于水、鹽、稀酸、稀堿溶液，如膠原蛋白，毛發(fā)、蹄、角及甲殼的角蛋白和絲蛋白，腱、韌帶中的彈性蛋白等。4/10/20237ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能（1）催化功能——酶（2）結(jié)構(gòu)成分（結(jié)締組織的膠原蛋白、血管和皮膚的彈性蛋白、膜蛋白）（3）物質(zhì)運輸（血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運輸載體、脂蛋白、電子傳遞體）（4）貯藏（卵清蛋白、奶酪蛋白、種子蛋白）（5）運動（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動蛋白）（6）激素功能（胰島素、甲狀腺素）（7）防御（抗體、皮膚的角蛋白、血凝蛋白）（8）接受、傳遞信息（受體蛋白、味覺蛋白）（9）調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞生長、分化、和遺傳信息的表達(dá)（組蛋白、阻遏蛋白）（10）其他功能，毒蛋白4/10/20239ZhangJG-Biochemistry1、

元素組成碳50%、氫7%、氧23%、氮16%、硫0-3%微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、鉬凱氏定氮：粗蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.252、

氨基酸組成蛋白質(zhì)是由20種L-型α氨基酸組成的長鏈分子蛋白質(zhì)的組成4/10/202310ZhangJG-Biochemistry一、

氨基酸的結(jié)構(gòu)（一）結(jié)構(gòu)通式第一節(jié)

氨基酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)4/10/202311ZhangJG-Biochemistry基本氨基酸中英文名稱及縮寫代號4/10/202313ZhangJG-Biochemistry（二）立體異構(gòu)不對稱碳原子是與4個不同原子或原于團(tuán)相連接的碳原子,也叫手性碳原子，用“C*”表示。每種氨基酸都有兩種立體異構(gòu)體D-型、L-型。旋光性：左旋（－）、右旋（＋）左旋（－）、右旋（＋）與構(gòu)型無相關(guān)性蛋白質(zhì)分子中的氨基酸都是L-氨基酸!4/10/202314ZhangJG-Biochemistry按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類

1、脂肪族氨基酸

可以分為7組：（三）氨基酸的分類及其部分生物學(xué)活性編碼的蛋白質(zhì)氨基酸（20種）4/10/202315ZhangJG-Biochemistry（2）R中含有羥基的氨基酸（2種）絲氨酸Ser的OH基（pKa=15）在生理條件下不解離，大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。4/10/202317ZhangJG-Biochemistry（3）R中含有硫的氨基酸（2、3種）4/10/202318ZhangJG-Biochemistry半胱氨酸（Cys）的R中含巰基（-SH），具有兩個重要性質(zhì)：（1）在較高pH值條件，巰基離解；（2）兩個Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸（易在膀胱、腎、輸尿管中形成結(jié)石）。

Cys也經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性中心。甲硫氨酸（Met）在生物合成中是一種重要的甲基供體。硒代半胱氨酸（selenocysteine，SeC）：

在天然蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的第21種由三聯(lián)體密碼編碼的L-α-氨基酸。主要存在于谷胱甘肽過氧化物酶中，類似于半胱氨酸也可以生成硒胱氨酸。4/10/202319ZhangJG-Biochemistry（5）R中含有酰胺基團(tuán)（2種）酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)

4/10/202321ZhangJG-Biochemistry（6）R中含堿性基團(tuán)（3種）4/10/202322ZhangJG-Biochemistry賴氨酸（Lys）側(cè)鏈氨基的pKa為10.53，生理條件下，Lys側(cè)鏈帶有一個正電荷（—NH3+），側(cè)鏈的氨基反應(yīng)活性增大。精氨酸（Arg）是堿性最強的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強的有機堿，與NaOH相當(dāng)，pKa值為12.48，生理條件下完全質(zhì)子化。組氨酸（His）是pKa值最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸，是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。在酶的酸堿催化機制中起重要作用4/10/202323ZhangJG-Biochemistry3、雜環(huán)亞氨基酸（1種）脯氨酸Pro是唯一的亞氨基酸，

Pro的α-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。一般出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化。4/10/202325ZhangJG-Biochemistry在蛋白質(zhì)中非極性aa一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心；不帶電何的極性氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，易溶于水，帶電荷的aa和極性aa位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys4/10/202326ZhangJG-Biochemistry必需氨基酸：體內(nèi)不能合成或合成的量不足，不能滿足機體需要，必須從食物中攝取的氨基酸稱必需氨基酸。成年人8種：

Thr（蘇）、Val（丙）、Leu、Ile、Phe、Trp（色）、Lys、Met。胱氨酸和酪氨酸（Tyr）在體內(nèi)可分別由蛋氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)變而來，稱半必需氨基酸。嬰兒期：Arg和His供給不足，是嬰兒的必需氨基酸。4/10/202329ZhangJG-Biochemistry二、

氨基酸的性質(zhì)（一）氨基酸的物理性質(zhì)1、一般物理性質(zhì)無色晶體、熔點高200℃以上，如甘（233℃）、酪（344℃）；味道不同，甜、苦鮮2、氨基酸的旋光性Gly一種構(gòu)型,無旋光性Thr(蘇)和Ile有四種光學(xué)異構(gòu)體。P9圖1-11其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型。

4/10/202330ZhangJG-Biochemistry3、氨基酸的吸收光譜構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在紅外區(qū)和遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。苯(Phe)的max＝257nm，酪（Tyr）的max＝275nm，色(Trp)的max＝280nm。摩爾吸收系數(shù)、波長4/10/202331ZhangJG-Biochemistry（二）氨基酸的化學(xué)性質(zhì)1、氨基酸兩性解離和等電點（1）氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在

①晶體熔點高，離子晶格，不是分子晶格；②除胱、酪外，AA易溶于水，水溶液中的氨基酸是極性分子；③除脯、羥脯外，不溶于非極性溶劑，可用乙醇使氨基酸沉淀析出。（2）氨基酸兩性解離4/10/202332ZhangJG-Biochemistry4/10/202333ZhangJG-Biochemistry氨基酸的等電點及其計算氨基酸的等電點（pI）是指氨基酸凈電荷為零時溶液中的pH值。在等電點時，氨基酸在電場中既不向正極移動，也不向負(fù)極移動，即處于兼性離子狀態(tài)。氨基酸等電點的計算有三種情況：pK1(α-COOH)，pK2(α-NH3+),pKR(R基)解離常數(shù)（1）中性氨基酸：4/10/202334ZhangJG-BiochemistrypH>pI時，氨基酸帶負(fù)電荷，-COOH解離成-COO-，向正極移動。

pH=pI時，氨基酸凈電荷為零pH<pI時，氨基酸帶正電荷，-NH2解離成-NH3+，向負(fù)極移動。

4/10/202335ZhangJG-Biochemistry2、

與茚三酮反應(yīng)茚三酮在弱酸中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物——氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成藍(lán)紫色物質(zhì)（λmax=570nm）；Pro、Hy-Pro與直接形成黃色化合物（λmax=440nm）用分光光度計可以定量測定微量氨基酸。多肽、蛋白質(zhì)與茚三酮也有此反應(yīng)，但是肽越大靈敏度越差。4/10/202336ZhangJG-Biochemistry4/10/202337ZhangJG-Biochemistry3、

與亞硝酸反應(yīng)VanSlyke法測定氨基酸，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定生成的氮氣，即可計算出參與反應(yīng)的氨基酸量，此法可用于氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的測定。4/10/202338ZhangJG-Biochemistry4、氨基酸的與醛類反應(yīng)生成西佛堿（Schiff），西佛堿是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物）。4/10/202339ZhangJG-Biochemistry氨基酸的與甲醛反應(yīng)氨基酸的甲醛滴定是測定氨基酸含量的一種常用方法。當(dāng)溶液中存在1mol/L甲醛時，滴定終點由pH≈12移至pH≈9，（酚酞指示劑的變色區(qū)域）。4/10/202340ZhangJG-Biochemistry5、與2.4一二硝基氟苯的反應(yīng)Sanger反應(yīng)

2.4一二硝基氟苯（DNFB）DNP-氨基酸，黃色，層析法鑒定，被Sanger用來測定多肽、蛋白質(zhì)的NH2末端氨基酸4/10/202341ZhangJG-Biochemistry6、與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)，生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。Edman（瑞典

）用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸4/10/202342ZhangJG-Biochemistry7、與?；噭┓磻?yīng)芐氧甲酰氯（苯甲氧甲酰氯）（carbobenzyloxychloride,Cbz-cl)叔丁氧甲酰氯對-甲苯磺酰氯鄰苯二甲酸酐丹磺酰氯多肽的人工合成中被用作氨基保護(hù)劑。4/10/202343ZhangJG-Biochemistry4/10/202344ZhangJG-Biochemistry

丹磺酰氯（DNS-Cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽鏈—NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測定。NGly—Ala—Ser—Leu—PheC→→DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。

4/10/202345ZhangJG-Biochemistry8、成鹽、成酯反應(yīng)

4/10/202346ZhangJG-Biochemistry9、成肽反應(yīng)4/10/202347ZhangJG-Biochemistry三、氨基酸的分離和分析鑒定層析法：是利用被分離樣品混合物中各組分的化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相（固定相、流動相）中，當(dāng)流動相流進(jìn)固定相時，由于各組分在兩相中的分配情況不同（或電荷分布不同、離子親和力不同等），而以不同的速度前進(jìn)，從而達(dá)到分離的目的。常見的層析法有：紙層析、薄層層析、離子交換層析、氣相層析、高效液相層析、親和層析4/10/202348ZhangJG-Biochemistry（一）紙層析用濾紙作為支持物進(jìn)行層析的方法，是分配層析的一種。原理是：（1）在紙上水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當(dāng)有機相沿紙流動經(jīng)過層析點時，層析點上溶質(zhì)就在水相和有機相之間進(jìn)行分配，溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。（2）氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)。（3）物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置可用Rf（比移值）來表示，在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。4/10/202349ZhangJG-Biochemistry（4）Rf值（比移值）的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、PH層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。4/10/202350ZhangJG-Biochemistry紙層析

單向紙層析圖Rf值

4/10/202351ZhangJG-Biochemistry雙向紙層析圖4/10/202352ZhangJG-Biochemistry（二）離子交換層析法：

用離子交換樹脂作為支持劑的層析法。各種氨基酸分子的結(jié)構(gòu)不同，在同一pH時與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可依據(jù)親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達(dá)到分離的效果。這種分離主要與各種離子所帶電荷有關(guān)，在電荷相同時，與極性，非極性有關(guān)。

4/10/202353ZhangJG-Biochemistry離子交換樹脂：

化學(xué)本質(zhì)：是一種人工合成的聚苯乙烯--苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。陽離子交換樹脂：活性基團(tuán)是酸性的，如磺酸基-SO3H（強酸型），羧基-COOH（弱酸型）陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)是堿性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-

4/10/202354ZhangJG-Biochemistry4/10/202355ZhangJG-Biochemistry4/10/202356ZhangJG-Biochemistry全自動氨基酸分析儀

儀器原理：陽離子交換分離、茚三酮柱后衍生法主要用途：多用于水解蛋白分析，如飼料、農(nóng)產(chǎn)品等；也可以用于游離氨基酸的分析，如血清、尿液、組織液、植物提取液等代表廠家：德國sykam、日本hitachi（日立）、北京溫分儀器廠等4/10/202357ZhangJG-Biochemistry4/10/202358ZhangJG-Biochemistry氨基酸與樹脂上解離基團(tuán)之間的靜電引力氨基酸與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水作用4/10/202359ZhangJG-Biochemistry一、肽1、肽鍵和肽平面肽：一個氨基酸的羧基和另一個氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。肽鍵：氨基酸間脫水后形成的共價鍵稱肽鍵（酰氨鍵）。第二節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)4/10/202360ZhangJG-Biochemistry肽鍵中的C-N單鍵長度為0.132nm,一般的C-N單鍵長度為0.147nm，C=N雙鍵為0.127nm。因此肽鍵中的C-N鍵具有40%雙鍵的性質(zhì)，不能旋轉(zhuǎn)，與相鄰的4個原子構(gòu)成共振平面，即肽平面，酰胺平面，也稱肽單位。肽單位間以α-C原子相隔。4/10/202361ZhangJG-Biochemistry多肽鏈可以看成由aa串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成4/10/202362ZhangJG-Biochemistry4/10/202363ZhangJG-Biochemistry2、肽的命名及結(jié)構(gòu)一個肽可根據(jù)其所含的氨基酸殘基數(shù)簡單地稱為二肽、三肽、四肽等。10個氨基酸以下稱為寡肽，10個以上多肽。肽的命名是從肽鏈的N末端（游離氨基）開始，到C末端（游離羧基）按照氨基酸殘基的順序逐一命名。例如：由絲氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸和亮氨酸組成的五肽就命名為絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸。結(jié)構(gòu)簡寫,N末端寫在左邊，C末端寫在右邊（即從N→C）。4/10/202364ZhangJG-Biochemistry

3、肽的性質(zhì)（1）旋光性一般短肽的旋光度等于其各個氨基酸的旋光度的總和。（2）肽的酸堿性質(zhì)短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。肽的酸堿性質(zhì)主要取決于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。4/10/202365ZhangJG-Biochemistry（3）

肽的化學(xué)反應(yīng)肽的α-羧基，α-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液（NaOH）中，雙縮脲（H2NOC－NH－CONH2）能與銅離子（Cu2+）作用，形成紫色絡(luò)合物。凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。4/10/202366ZhangJG-Biochemistry4、天然存在的活性肽（1）谷胱甘肽谷胱甘肽在體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)過程中起重要作用。清除內(nèi)源性過氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。4/10/202367ZhangJG-Biochemistry（2）催產(chǎn)素和升壓素（九肽激素）催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，有催產(chǎn)及使乳腺排乳的作用；升壓素使血管平滑肌收縮，從而使血壓升高，減少排尿的作用，也稱抗利尿激素。4/10/202368ZhangJG-Biochemistry（3）抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽。青霉素（Benzylpenicillin/Penicillin）又被稱為青霉素G、盤尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一個能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素屬β-內(nèi)酰胺類抗生素。4/10/202369ZhangJG-Biochemistry（4）腦肽有鎮(zhèn)痛作用而又不會像嗎啡，使病人成癮的藥物，中科院上海生化所1982年利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)成功地合成Leu—腦啡肽。4/10/202370ZhangJG-Biochemistry（5）膽囊收縮素由33個氨基酸組成（6）胰高血糖素胰臟α細(xì)胞分泌，它含有29個氨基酸殘基。胰高血糠素可調(diào)節(jié)控制肝糖原降解產(chǎn)生葡萄糖、以維持血施水平，還能引起血管疏張，抑制腸的蠕動及分泌。4/10/202371ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到100萬道爾頓甚至更大。二、

蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)概述4/10/202372ZhangJG-Biochemistry（二）蛋白質(zhì)的構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次

每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)或稱三維結(jié)構(gòu)，這種三維結(jié)構(gòu)通常被稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象。為了表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同組織層次，一般采用下列專門術(shù)語：一級結(jié)構(gòu)（primarystructure)

二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure)

三級結(jié)構(gòu)

(tertiarystructure)

四級結(jié)構(gòu)（quarternarystructure)4/10/202373ZhangJG-Biochemistry

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次4/10/202374ZhangJG-Biochemistry三、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（共價結(jié)構(gòu)）：1、概念蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的種類、數(shù)量、連接方式和排列順序稱為一級結(jié)構(gòu)。是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，它是由基因（遺傳信息、遺傳密碼）決定的。涉及的化學(xué)鍵是肽鍵和少量的二硫鍵。從分子水平上研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為蛋白質(zhì)的人工合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。診斷遺傳病、合成基因探針等高新技術(shù)的研究具有重要意義。4/10/202375ZhangJG-Biochemistry4/10/202376ZhangJG-Biochemistry二級結(jié)構(gòu)：是多肽主鏈本身在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、折疊和盤繞的方式。不涉及側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。氫鍵等次級鍵是維持二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單位，主要有：α-螺旋、β折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等。四、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)4/10/202377ZhangJG-Biochemistry（一）α-螺旋結(jié)構(gòu)4/10/202378ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)-α螺旋結(jié)構(gòu)右手螺旋(順時針)。肽鏈的主鏈形成緊密的螺旋,側(cè)鏈伸向外側(cè)，每一圈包含3.6個氨基酸殘基,每個殘基跨距為0.15nm,螺旋上升一圈的距離(螺距)為3.6×0.15=0.54nm，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13。螺旋通過氫鍵維持穩(wěn)定。第一個肽鍵的NH和第四個肽鍵的CO形成氫鍵,第n個肽鍵的NH和第n+3個肽鍵的CO形成氫鍵。氫鍵取向與主軸基本平行。α-螺旋結(jié)構(gòu)形成的限制因素凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒有H,不能形成氫鍵。靜電斥力。若一段肽鏈有多個Glu或Asp相鄰,則因pH=7.0時都帶負(fù)電荷,防礙α螺旋的形成;同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi),正電荷相斥,也防礙α螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu側(cè)鏈很大，防礙α螺旋的形成。4/10/202379ZhangJG-Biochemistry4/10/202380ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)β—折疊結(jié)構(gòu)（二）β-折迭又叫β-折迭片或β-片層結(jié)構(gòu)，也是蛋白質(zhì)分子中常見的主鏈構(gòu)象之一。所謂β-折迭是兩條或兩條以上充分伸展成鋸齒狀折迭構(gòu)象的膚鏈側(cè)向聚集，按肽鏈的長軸方向平行并列，形成的折扇狀構(gòu)象。β-折迭構(gòu)象靠相鄰肽鏈主鏈亞氨基（NH）和羰基氧原子之間形成有規(guī)律的氫鍵聯(lián)結(jié)維系。平行式N端N端平行式與反平行式4/10/202381ZhangJG-Biochemistry（三）蛋白質(zhì)的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)又叫U型回折、β-轉(zhuǎn)彎或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。是近年來在球狀蛋白質(zhì)分子中發(fā)現(xiàn)的一種主鏈構(gòu)象。球狀蛋白質(zhì)分子主鏈在盤曲折迭運行中往往發(fā)生180°的急轉(zhuǎn)彎，這種回折部位的構(gòu)象即所謂β-轉(zhuǎn)角。β-轉(zhuǎn)角是由4個連續(xù)的殘基組成的，第一個殘基的羰基與第四個殘基的亞氨基間形成氫鍵聯(lián)結(jié)，穩(wěn)定構(gòu)象。4/10/202382ZhangJG-Biochemistry二級結(jié)構(gòu)的多元性球狀蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)一般都不是單一構(gòu)象。主鏈的不同段落構(gòu)象不同，多種構(gòu)象單元交替連接組成整條肽鏈的二級構(gòu)象。4/10/202383ZhangJG-Biochemistry超二級結(jié)構(gòu)：由兩個以上二級結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)的組合體如αα、βαβ、βββ。4/10/202384ZhangJG-Biochemistry五、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（一）概念三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤繞、折疊，形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特定空間結(jié)構(gòu)。也指多肽鏈中所有原子和基團(tuán)的構(gòu)象，也包括所有主鏈和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)主要是靠氨基酸側(cè)鏈之間的氫鍵、疏水鍵、范德華力和靜電作用維持的。

4/10/202385ZhangJG-Biochemistry（二）結(jié)構(gòu)域：大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個緊密的球狀構(gòu)象，彼此以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的獨立折疊單位，一般由100-200個氨基酸殘基構(gòu)成。4/10/202386ZhangJG-Biochemistry結(jié)構(gòu)域

有些較大的球狀蛋白質(zhì)分子或亞基，常常先由幾個二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起形成超二級結(jié)構(gòu)，以此作為形成三級結(jié)構(gòu)的實體，這些超二級結(jié)構(gòu)實體稱為結(jié)構(gòu)域，又叫轄區(qū)。結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步締合則形成近似球形的三級結(jié)構(gòu)。4/10/202387ZhangJG-Biochemistry4/10/202388ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子在一、二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，再進(jìn)行三維空間的多向性盤曲折迭。形成特定的近似球狀的構(gòu)象，稱為蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)包括蛋白質(zhì)分子主鏈和側(cè)鏈所有原子或原子團(tuán)的空間排布關(guān)系。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象特點（1）三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象近似球形。（2）分子中的親水基團(tuán)相對集中在球形分子的表面，疏水基團(tuán)相對集中在分子內(nèi)部，形成所謂“親水表面，疏水核”。（3）三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性主要靠疏水相互作用維系。親水表面能吸附形成厚厚的水化膜和雙電層，對蛋出質(zhì)分子構(gòu)象起很好的保護(hù)作用。（4）三級結(jié)構(gòu)形成之后，蛋白質(zhì)分子的生物活性部位就形成了。4/10/202389ZhangJG-Biochemistry六、蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（一）概念由兩條或多條具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過次級鍵締合形成的聚集體稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。其中每一個具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基（subunit）。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)包括亞基的種類，數(shù)目及各個亞基在寡聚蛋白中的空間排布和亞基之間的互相作用。但不涉及亞基內(nèi)部結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)亞基之間主要通過疏水作用、氫鍵、范德華力等作用力形成四級結(jié)構(gòu)，其中最主要的是疏水作用。4/10/202390ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)分子的亞基數(shù)目一般為偶數(shù)，大多數(shù)蛋白質(zhì)含2個或4個亞基，亞基可以是相同的或不同。由兩個或兩個以上亞基組成的蛋白質(zhì)稱為寡聚蛋白質(zhì)，無四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)稱為單體蛋白質(zhì)。（二）亞基與蛋白質(zhì)生物活性的關(guān)系亞基單獨存在時無生物活性，只有相互聚合成特定構(gòu)象時才有完整的生物活性。如血紅蛋白是由4個亞基構(gòu)成的四聚體，其中兩個α亞基，兩個β亞基。4/10/202391ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)有些球狀蛋白質(zhì)分子是由兩個或兩個以上的三級結(jié)構(gòu)單位締合而織成的，通常稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每個三級結(jié)構(gòu)單位稱為一個亞基（或亞單位）。所謂蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)就是指寡聚蛋白質(zhì)分子中亞基與亞基間的立體排布及相互作用關(guān)系，亞基的數(shù)目和類型也屬四級結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)容，但不涉及亞基本身的構(gòu)象。兩個亞基的結(jié)構(gòu)血紅蛋白4/10/202392ZhangJG-Biochemistry寡聚蛋白質(zhì)分子的亞基組成

據(jù)統(tǒng)計，已經(jīng)研究過的寡聚蛋白質(zhì)分子達(dá)700多種。它們的亞基數(shù)目差別很大，少則幾個，多則十幾個，數(shù)十個。大多數(shù)寡聚蛋白質(zhì)是由偶數(shù)亞基組成的。其中，兩個或四個亞基者最多。奇數(shù)亞基的分子很少見。

亞基類別組成有兩種類型。一種是由相同亞基組成的均一寡聚蛋白，如過氧化氫酶，是由四個相同亞其組成的四聚體，每個亞基的一、二、三級結(jié)構(gòu)都相同，功能也相同。另一種是由結(jié)構(gòu)不同的亞基組成的非均—寡聚蛋白，如血紅蛋白（α2β2）。

維持四級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素為各亞基之間的作用力如氫鍵、離子鍵、疏水鍵。含有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，單獨的亞基一般沒有生物學(xué)功能，只有完整的四級結(jié)構(gòu)才有生物學(xué)功能。4/10/202393ZhangJG-Biochemistry蛋白質(zhì)的一、二、三、四級結(jié)構(gòu)4/10/202394ZhangJG-Biochemistry（三）維系蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力4/10/202395ZhangJG-Biochemistry4/10/202396ZhangJG-Biochemistry（一）蛋白質(zhì)的相對分子量測分子量的方法：化學(xué)組成法測定最低分子量超速離心法分子篩層析法SDS法沉降系數(shù)法沉降平衡法七、蛋白質(zhì)的性質(zhì)4/10/202397ZhangJG-Biochemistry（二）蛋白質(zhì)的旋光性蛋白質(zhì)分子的旋光性是由構(gòu)成他的各種氨基酸旋光度和α-螺旋結(jié)構(gòu)所決定的。通常蛋白質(zhì)溶液是右旋的，但變性后螺旋結(jié)構(gòu)松開，其左旋性增大。利用這一性質(zhì)可推算蛋白質(zhì)分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)的百分含量。（三）蛋白質(zhì)的紫外光吸收大多數(shù)蛋白質(zhì)含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)在280nm有最大光吸收。利用這一性質(zhì)可用紫外分光光度法測定溶液中蛋白質(zhì)的含量。4/10/202398ZhangJG-Biochemistry等電點：中性鹽（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42+）影響滴定曲線形狀和等電點。鹽離子濃度為0時的等電點稱等離子點。（四）蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點4/10/202399ZhangJG-Biochemistry4/10/2023100ZhangJG-Biochemistry（五）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運動，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過半透膜）穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜②非等電狀態(tài)時，同種電荷的互相排斥。③質(zhì)點大小在1-100nm，可以進(jìn)行布郎運動4/10/2023101ZhangJG-Biochemistry4/10/2023102ZhangJG-Biochemistry（六）蛋白質(zhì)的沉淀作用

①鹽析法:大量的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。②有機溶劑沉淀法：破壞水化膜，降低介電常數(shù)，PEG、丙酮、乙醇等③重金屬鹽沉淀：pH＞pI時帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀④生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pH小于等電時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸。⑤加熱變性沉淀。4/10/2023103ZhangJG-Biochemistry（七）

蛋白質(zhì)的變性（1）天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，如酶失去催化活力，激素喪失活性稱之為蛋白質(zhì)的變性作用。蛋白質(zhì)的變性是很復(fù)雜的，如果有化學(xué)鍵的斷裂和生成就是化學(xué)變化；如果沒有化學(xué)鍵的斷裂和生成就是物理變化。變性蛋白質(zhì)只有空間構(gòu)象的破壞，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級鍵、二硫鍵的破壞，并不涉及一級結(jié)構(gòu)的變化。4/10/2023104ZhangJG-Biochemistry（2）蛋白質(zhì)變性后，往往出現(xiàn)下列現(xiàn)象：①生物活性喪失②硫水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易被蛋白酶水解。③溶解度降低、沉淀，粘度增加。制備活性蛋白質(zhì)時嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。4/10/2023105ZhangJG-Biochemistry（3）變性的因素：強酸和強堿；有機溶劑：破壞疏水作用；去污劑：去污劑都是兩親分子，破壞疏水作用；還原性試劑：尿素、-硫基乙醇；鹽濃度：鹽析、鹽溶；重金屬離子：Hg2+、pb2+，能與-SH或帶電基團(tuán)反應(yīng)。溫度；機械力：如攪拌和研磨中的氣泡。4/10/2023106ZhangJG-Biochemistry（4）可逆變性與不可逆變性變性并非都是不可逆的變化，當(dāng)變性程度較輕時，如去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為復(fù)性。例如，核糖核酸酶中四對二硫鍵及其氫鍵。在β-巰基乙醇和8M尿素作用下，發(fā)生變性，失去生物學(xué)活性，變性后如經(jīng)過透析去除尿素、β-巰基乙醇，并設(shè)法使巰基氧化成二硫鍵，酶蛋白又可恢復(fù)其原來的構(gòu)象，生物學(xué)活性也幾乎全部恢復(fù)，此稱變性核糖核酸酶的復(fù)性。許多蛋白質(zhì)變性時被破壞嚴(yán)重，不能恢復(fù)，稱為不可逆性變性。4/10/2023107ZhangJG-Biochemistry牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵4/10/2023108ZhangJG-Biochemistry

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性4/10/2023109ZhangJG-Biochemistry（八）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（1）雙縮脲反應(yīng)

尿素加熱至180℃左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽部有雙納脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。4/10/2023110ZhangJG-Biochemistry（2）酚試劑（福林試劑）反應(yīng)：

酚試劑（福林Folin）蛋白質(zhì)分子一般都含有酪氨酸Tyr，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物。4/10/2023111ZhangJG-Biochemistry（3）黃色反應(yīng)含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)與濃硝酸混合加熱后呈現(xiàn)黃色的反應(yīng)。反應(yīng)原理是硝酸對苯環(huán)發(fā)生硝化作用，生成黃色的芳香硝基化合物，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。濃硝酸滴到皮膚上，過一段時間皮膚就會發(fā)黃，數(shù)天后死皮褪去，就是因為這個原因。生成的黃色冷卻后，若再與堿或氨水接觸，則顏色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色。

4/10/2023112ZhangJG-Biochemistry（4）米倫氏反應(yīng)：酪氨酸Tyr及含Tyr的蛋白質(zhì)米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。蛋白質(zhì)溶液加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。

4/10/2023113ZhangJG-Biochemistry（5）乙醛酸反應(yīng)：色氨酸Trp及含Trp的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應(yīng)。4/10/2023114ZhangJG-Biochemistry（6）坂口反應(yīng)：Arg及含Arg的蛋白質(zhì)精氨酸分子中含有胍基，能與次氯酸鈉（或次溴酸鈉）及α-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。4/10/2023115ZhangJG-Biochemistry一、一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血由于病人的血紅蛋白分子（用Hb-S表示）與正常人的血紅蛋白（Hb-A表示）相比，在574個氨基酸中只有兩個氨基酸的差異而引起的。正常人的Hb-A的β-鏈第6位為谷氨酸，而Hb-S的β-鏈的第6位為纈氨酸。這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。

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78…Hb-AValHisLeuThrProGluGluLys…Hb-SValHisLeuThrProValGluLys…第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系4/10/2023116ZhangJG-BiochemistrySickle-celldisease4/10/2023117ZhangJG-Biochemistry（二)同功能蛋白質(zhì)中氨基酸順序的種屬差異

目前對不同機體中表現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序進(jìn)較詳細(xì)的比較研究，發(fā)現(xiàn)種屬差異是十分明顯的。例如：不同生物與人的細(xì)胞色素C相差的氨基酸殘基數(shù)目，可以根據(jù)它們在結(jié)構(gòu)上的差異程度斷定它們在親緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近，從而出生物進(jìn)化的研究提供有價值的根據(jù)。4/10/2023118ZhangJG-Biochemistry4/10/2023119ZhangJG-Biochemistry（一）肌紅蛋白

是哺乳動物肌肉中運載氧和貯氧的蛋白質(zhì)。由一條多肽鏈（153個氨基酸殘基）和一個亞鐵血紅素輔基組成?？臻g結(jié)構(gòu)呈緊密球形，氨基酸疏水側(cè)鏈位于分子內(nèi)部，極性氨基酸分布在分子表面，內(nèi)部形成一口袋形空穴，血紅素居于此空穴中。血紅素是鐵卟啉化合物，血紅素的Fe2+與4個吡咯環(huán)的氮原子形成配位鍵，另2個配位鍵1個與93位組氨酸結(jié)合，1個與O2結(jié)合，故血紅素在此空穴中保持穩(wěn)定位置。二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

4/10/2023120ZhangJG-Biochemistry1957年Kendrew,通過X射線衍射測定鯨肌紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)。由8段α螺旋構(gòu)成一個球狀結(jié)構(gòu)，拐彎處為1-8個殘基組成的松散肽鏈，Pro等常存在于拐彎處。是一個致密結(jié)實的球狀分子，其分子內(nèi)部只有一個能容納4個H2O分子的小空間。4/10/2023121ZhangJG-Biochemistry4/10/2023122ZhangJG-Biochemistry（二）血紅蛋白血紅蛋白是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運載氧的一種蛋白質(zhì)。1、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)人體內(nèi)的血紅蛋白由四個亞基構(gòu)成，分別為兩個α亞基和兩個β亞基。α和β都類似于肌紅蛋白，只是肽鏈稍短：α亞基為141aa；β亞基為146aa。血紅蛋白的每個亞基由一條肽鏈和一個血紅素分子構(gòu)成，肽鏈在生理條件下會盤繞折疊成球形，把血紅素分子抱在里面，這條肽鏈盤繞成的球形結(jié)構(gòu)又稱為珠蛋白。珠蛋白肽鏈中第8位的一個組氨酸殘基中的吲哚側(cè)鏈上的氮原子從卟啉分子平面的上方與亞鐵離子配位結(jié)合，當(dāng)血紅蛋白不與氧結(jié)合的時候，有一個水分子從卟啉環(huán)下方與亞鐵離子配位結(jié)合，而當(dāng)血紅蛋白載氧的時候，就由氧分子頂替水的位置。4/10/2023123ZhangJG-Biochemistry血紅蛋白的結(jié)構(gòu)4/10/2023124ZhangJG-Biochemistry2、氧合作用血紅蛋白與氧結(jié)合的過程首先一個O2與血紅蛋白四個亞基中的一個結(jié)合，與氧結(jié)合之后的珠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成整個血紅蛋白結(jié)構(gòu)的變化，這種變化使得第二個O2相比于第一個O2更容易與另一個亞基結(jié)合，而它的結(jié)合會進(jìn)一步促進(jìn)第三個氧分子的結(jié)合，以此類推直到構(gòu)成血紅蛋白的四個亞基分別與四個氧分子結(jié)合。而在組織內(nèi)釋放氧的過程也是這樣，一個氧分子的離去會刺激另一個的離去，直到完全釋放所有的氧分子，這種現(xiàn)象稱為協(xié)同效應(yīng)。4/10/2023125ZhangJG-Biochemistry3、別構(gòu)效應(yīng):

在生物體內(nèi)，當(dāng)某種物質(zhì)特異地與蛋白質(zhì)分子的某個部位結(jié)合，觸發(fā)蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能活性改變的現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)（allostericeffect），又稱為變構(gòu)效應(yīng)。某些含多個亞基的蛋白質(zhì)由于一個亞基的構(gòu)象改變而引起其余亞基和整個分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變。血紅蛋白是一個別構(gòu)蛋白，受到波爾效應(yīng)（H+和CO2）和別構(gòu)效應(yīng)（2,3-二磷酸甘油酸）的顯著影響，其氧合曲線表現(xiàn)為S型曲線。注意：CO的毒性作用！空氣中0.1%導(dǎo)致窒息死亡！CO與血紅蛋白的結(jié)合力是氧的250倍。4/10/2023126ZhangJG-Biochemistry肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧結(jié)合曲線4/10/2023127ZhangJG-Biochemistry一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化的實質(zhì)增加制品（preparation）的純度或比活力蛋白質(zhì)分離純化的一般程序：1、前處理、抽提2、粗分級3、細(xì)分離4、濃縮結(jié)晶5、保存第四節(jié)蛋白質(zhì)分離純化與鑒定4/10/2023128ZhangJG-Biochemistry

電泳

前處理粗分離細(xì)分離生物組織

無細(xì)胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過濾疏水層析吸附層析4/10/2023129ZhangJG-Biochemistry（1）前處理：①將組織和細(xì)胞破碎動物組織和細(xì)胞：電動搗碎機（waringblender)勻漿器（homogenizer)超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處（分解肽聚糖）②差速離心法收集細(xì)胞的某一組分③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。4/10/2023130ZhangJG-Biochemistry（2）蛋白質(zhì)的抽提。通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_溶液把蛋白質(zhì)提取出來。（3）粗分級一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級沉淀法（鹽析）②等電點選擇性沉淀法③有機溶劑分級沉淀法④熱處理選擇性沉淀法⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法4/10/2023131ZhangJG-Biochemistry（4）細(xì)分離①透析除鹽②sephdexG-25凝膠過濾除鹽層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤狀電泳、等電聚焦、雙向電泳密度梯度離心4/10/2023132ZhangJG-Biochemistry（5）濃縮晶體與保存濃縮方法：真空冷凍干燥法，蛋白質(zhì)幾乎無變性。保存方法：①晶體保存：結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。②凍干粉保存：③溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20～-70℃保存。4/10/2023133ZhangJG-Biochemistry二、混合蛋白質(zhì)分離純化的方法（一）根據(jù)分子大小分離（二）根據(jù)電荷差異分離（三）根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離（四）根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）選擇性吸附分離（物理吸附）根據(jù)疏水性的差異

4/10/2023134ZhangJG-Biochemistry（一）根據(jù)分子大小和形狀的差異1、凝膠過濾法凝膠過濾層析利用一定大小孔隙的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作層析介質(zhì)（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小、形狀不同擴(kuò)散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。也稱分子排阻層析、分子篩。優(yōu)點：操作方便，所需設(shè)備簡單。缺點：分辨率低，分離操作較慢。交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）、瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-GelA）4/10/2023135ZhangJG-Biochemistry4/10/2023136ZhangJG-Biochemistry4/10/2023137ZhangJG-Biochemistry4/10/2023138ZhangJG-Biochemistry半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。2、透析和超濾法：除去小分子物質(zhì)

4/10/2023139ZhangJG-Biochemistry超濾：施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過一半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。優(yōu)點：常溫、條件溫和、節(jié)能環(huán)保，適合濃縮富集。缺點：不能直接得到干粉制劑。4/10/2023140ZhangJG-Biochemistry3、離心法借助于離心力，由于比重不同的物質(zhì)所受到的離心力不同，從而沉降速度不同。使樣品中不同質(zhì)量、密度、大小和形狀的顆粒達(dá)到分離。

濃度梯度離心、差速沉降離心4/10/2023141ZhangJG-Biochemistry4/10/2023142ZhangJG-Biochemistr