市售雞場真假雞蛋的分子檢測技術(shù),分子生物學論文

市售雞場真假雞蛋的分子檢測技術(shù),分子生物學論文蛋白質(zhì)是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎，它不僅僅是構(gòu)成細胞的基本有機物，而且是生命活動的主要承當者，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。蛋白質(zhì)的主要來源是肉、蛋、奶和豆類食品，一般而言，動物蛋白品質(zhì)較高，含有充足的必需氨基酸。必需氨基酸有8種，無法由人體自行合成，必須從食物中攝取。蛋類含蛋白質(zhì)11%~14%,是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源。蛋類作為中國居民重要動物性食品之一，其營養(yǎng)豐富，為人類蛋白質(zhì)的主要來源。蛋中含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、卵磷脂、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，其蛋清中含卵白蛋白，蛋黃蛋白質(zhì)含量豐富，蛋白質(zhì)的消化吸收率高，對人體生長特別有益。雞蛋是人類獲得蛋白質(zhì)的主要來源之一，其質(zhì)量安全關(guān)系到人體健康，更是關(guān)系國計民生的重大問題。雞蛋的質(zhì)量高低，尤其是蛋品的真?zhèn)侮P(guān)系到千家萬戶的飲食安全。最近幾年，一些不法商販為了牟取暴利，采用化學試劑人工合成雞蛋，人造雞蛋在深圳、杭州等地己相繼被發(fā)現(xiàn)，嚴重損害了消費者的健康。研究表示清楚，人造雞蛋與真雞蛋蛋殼的主要成分都是碳酸鈣，但是蛋清蛋黃的成分不同，人造雞蛋中主要成分是樹脂、淀粉、凝固劑、色素等化學物質(zhì)，毫無營養(yǎng)價值且對人體有害。當前國家尚未出臺相關(guān)標準檢測真?zhèn)坞u蛋，消費者僅能憑感覺和經(jīng)歷體驗辨別，無法實現(xiàn)對蛋品真?zhèn)蔚默F(xiàn)場技術(shù)檢測。湯青萍等對仿土雞蛋的蛋品質(zhì)分析及變化規(guī)律進行了研究，主要集中在蛋白質(zhì)的含量、蛋黃蛋白比、維生素含量上，沒有提及區(qū)分假雞蛋的檢測方式方法。分子檢測技術(shù)是一種利用當代生物技術(shù)水平的檢測技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好、特異性強等優(yōu)點，是新時期食品安全的戰(zhàn)略制高點之一。與常用的毛細管電泳法、光譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)如氣質(zhì)聯(lián)用等法相比，后者固然靈敏度高、測量結(jié)果準確，但是操作復雜、設備價格昂貴、費時費力、不易攜帶、檢測成本高。因而，采用分子檢測技術(shù)對市售雞蛋進行分析。結(jié)果表示清楚，本方式方法快速、簡便，為商品檢驗人員對蛋品市場進行廣泛的監(jiān)測提供科學的手段，為保衛(wèi)消費者權(quán)益提供科學根據(jù)。1材料與方式方法1.1材料與試劑雞蛋，購于黃桷埡市場；農(nóng)村土雞蛋，農(nóng)戶購買。電子精致細密天平，上海奧豪斯公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽；DYY-6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司。丙烯酞胺、N-N亞甲基雙丙烯酚胺、三羥基甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、過硫酸胺、三氯醋酸、考馬斯亮藍250、甲醇、冰醋酸，均為分析純。1.2試驗方式方法1.2.1引物設計參見卵清蛋白基因設計,上游引物5GACACAGATAAATAAGGTTGTTCGC-3,下游引物5TTTCTCAGAAGCCATTGATGATGCCACT-3,引物由TaKaRa公司合成。1.2.2卵清蛋白基因PCR擴增選取7種市售雞蛋，提取雞蛋的基因組DNA.用槍頭取蛋清100L于1.5mL離心管中，參加500L核酸裂解緩沖液，混勻后于恒溫箱中65℃反響1h,期間不時搖勻；在樣品液中參加等體積酚/氯仿〔1/1,v/v〕，混勻，于臺式低溫離心機4℃下12000r/min離心5min;取上清于干凈離心管中，參加等體積氯仿/異戊醇〔1/1,v/v〕，混勻，于4℃下12000r/min離心5min;取上清于干凈離心管中，參加2倍體積冷的無水乙醇，-20℃放置過夜，于4℃下12000r/min離心5min,小心去上清，加500L70%乙醇，于4℃下12000r/min離心5min,小心去上清，空氣中晾干，參加200L無菌水，充分溶解，DNA溶液保存于-20℃。以其做模板，用引物擴增卵清蛋白，擴增PCR片段，反響在PEDNA9600儀器中進行。PCR循環(huán)參數(shù)：變性階段94℃，5min;循環(huán)階段94℃，1min,55℃，35s,72℃，1min,共30次；復性階段72℃，10min,凝膠電泳分析。1.2.3卵黃蛋白的SDS電泳選取7種市售雞蛋，用槍頭取蛋黃100L,裂解液提取雞蛋黃蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度〔生工試劑盒〕，并進行SDS蛋白質(zhì)電泳，上樣量為20g/mL.1.2.4雞蛋卵磷脂的檢測卵磷脂在蛋黃中含量較高，通過提取卵磷脂可以檢測雞蛋的成分。取100L蛋黃，1mL冷丙酮，混勻10000r/min離心10min,取沉淀，參加5mL石油醚和15mL乙醇，放入燒杯中混合均勻。離心10000r/min離心10min,收集上清。將濾液收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度設為40℃。收集產(chǎn)品，進行薄層層析檢測。2結(jié)果與分析2.1卵清蛋白基因PCR結(jié)果與分析卵清蛋白是動物卵中的貯藏蛋白，給發(fā)育中的胚胎提供氨基酸，也是食物中重要的蛋白質(zhì)來源，對人體健康具有多種改善和提高作用。通過檢測卵清蛋白能進行雞蛋真?zhèn)蔚蔫b別。卵清蛋白基因PCR電泳片段約為520bp,結(jié)果如此圖1所示。此片斷經(jīng)測序后，序列與已登錄的雞卵清蛋白基因序列一致。由圖1可知，市售真雞蛋與農(nóng)村土雞蛋的卵清蛋白擴增片段一致。由于人造雞蛋主要樹脂、淀粉、凝固劑、色素等化學物質(zhì)，假如進行DNA提取后，根本無法獲得卵清蛋白基因PCR擴增結(jié)果，檢測應該為無電泳條帶。故此圖中未顯示假雞蛋的電泳條帶。2.2卵黃蛋白的SDS電泳結(jié)果與分析雞蛋的卵黃中含有大量的蛋白質(zhì)，每100g雞蛋含蛋白質(zhì)12.8g,蛋黃多居于蛋白的，由系帶懸于兩極。蛋黃體積約全蛋的30%~32%,主要組成物質(zhì)為卵黃磷蛋白，華而不實含有人體必需的8種氨基酸，并與人體蛋白的組成極為近似，人體對雞蛋蛋白質(zhì)的吸收率可高達98%.SDS電泳既可分析蛋白質(zhì)的純度，可以對蛋白質(zhì)的濃度進行鑒定分析，它在生化物質(zhì)分析及生物活性物質(zhì)的分離、制備中和純度鑒定中具有廣泛應用前景。通過提取雞蛋蛋黃發(fā)現(xiàn)，在同樣的體積下，5泳道的蛋白質(zhì)染色要比2~4泳道的蛋白質(zhì)染色條帶深，表示清楚其總蛋白質(zhì)含量農(nóng)村土雞蛋要大于雞場雞蛋，但其兩者的電泳圖的圖形條帶數(shù)量差異不同不大，結(jié)果見圖2.但假如要進行農(nóng)村土雞蛋與雞場雞蛋的分子鑒定，用該方式方法不精到準確，應進一步進行農(nóng)村母雞和雞場母雞的微衛(wèi)星序列鑒定分析才能確定，故本試驗中的方式方法不合適農(nóng)村土雞蛋和雞場雞蛋的鑒定分析。2.3雞蛋卵磷脂的檢測結(jié)果與分析雞蛋卵磷脂可以作為一檢測指標，蛋黃卵磷脂中的主成分是磷脂酰膽堿〔PC〕，卵磷脂是細胞膜的主要組成成分，適量補充卵磷脂有利于細胞的新陳代謝，恢復組織器官的功能，延緩衰老。雞蛋蛋黃卵磷脂薄層圖譜如此圖3所示。雞蛋樣品具有卵磷脂，假如是假雞蛋，由樹脂、淀粉等構(gòu)成，根本不可能有卵磷脂的陽性結(jié)果存在，故卵磷脂的薄層層析檢測可以作為鑒別真假雞蛋的方式方法。3討論本試驗結(jié)果顯示，市售雞場雞蛋與農(nóng)村土雞蛋都有共同的擴增卵清蛋白基因片段，市售雞場雞蛋與農(nóng)村土雞蛋的SDS凝膠電泳條帶類似，這兩種均可作為分子技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的方式方法。該檢測技術(shù)可避免以往單憑感官檢驗的缺陷，可作為一種準確、快速、高效的檢測真假雞蛋的有力措施。而對于市售假雞蛋，這兩種檢測方式都無法獲得陽性結(jié)果，即不能通過雞蛋的DNA提取獲得卵清蛋白的基因片段，也不能通過SDS凝膠電泳獲得相應的蛋白質(zhì)條帶。雞蛋的卵磷脂薄層層析圖也顯示，假如是真雞蛋，則會有卵磷脂的存在，可通過薄層層析檢測到陽性結(jié)果，否則沒有。雞場雞蛋與農(nóng)村土雞蛋檢測結(jié)果表示清楚，這3種方式方法都能夠作為真假雞蛋的鑒定方式方法，而農(nóng)村土雞蛋與雞場雞蛋的區(qū)別假如要從分子水平上進行區(qū)分，這3種方式方法都難以進行定量確定。可通過微衛(wèi)星序列獲得相應農(nóng)村母雞和農(nóng)村土雞蛋的微衛(wèi)星序列進行分析鑒定，進而精到準確判定。本試驗研究的3種鑒定方式方法適用于真假雞蛋的鑒定，假如為真雞蛋，用此3種方式方法為陽性結(jié)果，反之則為陰性結(jié)果，該研究可為更好地保衛(wèi)人們的健康和進一步落實食品質(zhì)量安全市場準入制度提供技術(shù)保障。以下為參考文獻：[1]沈慧樂。雞蛋與人類健康[J].中國家禽，2008,30〔17〕：61-62.[2]楊芳，馬美湖。雞蛋膽固醇與人體健康[J].中國家禽，2018,31〔14〕：29-35.[3]湯青萍，陳寬維，李慧芳，等。仿土雞蛋的蛋品質(zhì)分析及變化規(guī)律研究[J].中國家禽，2008,30〔9〕：22-25.[4]郭堯君。蛋白質(zhì)電泳試驗技術(shù)[