課題1菊花的組織培養(yǎng)課件

大多綠色開花植物都是靠種子繁殖。那么，有沒有不用種子來(lái)培育植物的方法呢？扦插嫁接壓條莖的營(yíng)養(yǎng)繁殖方式當(dāng)植物細(xì)胞脫離了原來(lái)所在的植物器官或組織處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素或其它外界條件的作用下，就可以表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整植株。又稱：植物離體培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史1838年，Schleide和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說。1902年，單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性理論。1922年，Knudson用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。1958年，英國(guó)科學(xué)家Steward等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細(xì)胞全能性理論得到證實(shí)，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠定了基礎(chǔ)。1964-1966年，印度科學(xué)家Guha和Maheswari在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。

1972年，Carlson通過兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株。1、細(xì)胞的分化概念：在個(gè)體發(fā)育中，相同細(xì)胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程A.基礎(chǔ)知識(shí)細(xì)胞分化是一種持久性的變化，它發(fā)生在生物體的整個(gè)生命過程中。原因：在特定的時(shí)間和空間條件下基因的選擇性表達(dá)的結(jié)果結(jié)果：形成不同的細(xì)胞和組織一、植物組織培養(yǎng)的基本過程1958年，英國(guó)科學(xué)家Steward等用胡蘿卜根的韌皮部組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株。思考植物組織培養(yǎng)的原理是什么？植物細(xì)胞具有全能性，即已分化的細(xì)胞，仍具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。2、細(xì)胞的全能性①定義：

生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能的特性。②原理：

生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因。3、植物組織培養(yǎng)細(xì)胞離體；①必要條件：一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件②原理:細(xì)胞的全能性③相關(guān)概念:

從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分細(xì)胞、組織或器官。外植體：脫分化：

指已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞,當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體(也受到創(chuàng)傷)培養(yǎng)時(shí),已停止分裂的細(xì)胞,又重新恢復(fù)分裂,細(xì)胞改變?cè)械姆只癄顟B(tài),失去原有結(jié)構(gòu)和功能,成為具有未分化特性的細(xì)胞。再分化：

已經(jīng)脫分化的細(xì)胞在一定條件下,又可經(jīng)過愈傷組織或胚狀體,再分化出根和芽,形成完整植株,這一過程叫作再分化。愈傷組織:

細(xì)胞排列疏松而無(wú)規(guī)則,是高度液泡化的、成無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。脫分化：再分化：愈傷組織：菠蘿的愈傷組織④過程:離體組織或細(xì)胞植物體脫分化細(xì)胞分裂素≈生長(zhǎng)素愈傷組織芽根細(xì)胞分裂素>生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素<生長(zhǎng)素再分化不需要光需要光二、影響植物組織培養(yǎng)的因素1、植物材料的選擇煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難同一植物材料的年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果菊花的組織培養(yǎng)一般選擇：未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝。2、培養(yǎng)基的配制MS培養(yǎng)基主要成分包括：大量元素:N、P、K、Ca、Mg、S等微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等有機(jī)物:如氨基酸、煙酸、肌醇、維生素，蔗糖等1962年，Murashinge和Skoog在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。

你能說出各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必需的大量元素和微量元素兩大類。（P33）思考此時(shí)的組織或細(xì)胞是離體的，不能體現(xiàn)其整個(gè)植物體的光能自養(yǎng),細(xì)胞所生活的環(huán)境必須是含有機(jī)物的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。高等植物是光能自養(yǎng)型生物，為什么在植物組織培養(yǎng)過程中還需要提供有機(jī)物培養(yǎng)基？思考①常用的植物激素：生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素類：2，4－D、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素、6－芐基嘌呤、玉米素3、植物激素的影響③生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素同時(shí)使用，用量的比例對(duì)植物細(xì)胞發(fā)育方向的影響上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明什么問題？生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：>有利于根的分化抑制芽的形成生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：<有利于芽的分化，抑制根的形成生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：＝促進(jìn)愈傷組織形成③生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素同時(shí)使用，用量的比例對(duì)植物細(xì)胞發(fā)育方向的影響①無(wú)機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存。②激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液。③用母液配制培養(yǎng)基時(shí)，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量。湖南長(zhǎng)郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校2009年上學(xué)期制作03MS固體培養(yǎng)基成分及比例502、配制培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml。①配制培養(yǎng)液配制1LMS培養(yǎng)基，先將稱好的瓊脂加800ml蒸餾水，加熱使瓊脂溶化，然后加入蔗糖30g，取配制好的大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液，依次加入，加蒸餾水定容至1000ml。②調(diào)PH③培養(yǎng)基的分裝由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素。3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌1、選材：菊花莖段，取生長(zhǎng)旺盛的嫩枝（二）外植體消毒2、消毒①流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。②酒精處理用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精中搖動(dòng)2－3次，持續(xù)6－7s，立即將外植體取出，在無(wú)菌水中清洗。

③消毒液處理取出后用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在無(wú)菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液。外植體消毒強(qiáng)度是不是越大越好？（三）接種污染的主要來(lái)源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70％的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅擦洗工作臺(tái)并用紫外線照射20分鐘。1、接種室消毒2、無(wú)菌操作要求操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。3、材料的切取和接種將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶整齊地排列在酒精燈左側(cè)。將消過毒的菊花莖段在無(wú)菌培養(yǎng)皿中切成小段（長(zhǎng)約0.5-1cm）。左手持錐形瓶。右手拉開捆扎錐形瓶的繩子，并將封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接觸瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋轉(zhuǎn)通過火焰，右手用鑷子夾取菊花莖段，放入培養(yǎng)基中。插入時(shí)應(yīng)注意不要倒插。每瓶接種6－8塊外植體。接種后，將封口膜重新扎好。4、接種注意事項(xiàng)①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種。②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊花的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和光照條件。③插入時(shí)應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段的基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)嗎？每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以取用一個(gè)經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。（P35）思考（四）培養(yǎng)1、愈傷組織的培養(yǎng)從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過2周時(shí)間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長(zhǎng)出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。培養(yǎng)愈傷組織時(shí)，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見光，因?yàn)樵跓o(wú)光條件下愈傷組織長(zhǎng)的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下，將愈傷組織連同原來(lái)的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會(huì)分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長(zhǎng)到直徑為1－1.5cm時(shí)，就可以進(jìn)行試管苗培養(yǎng)，否則還需進(jìn)行第二代繼代培養(yǎng)2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色。3、試管苗的培養(yǎng)當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進(jìn)行試管苗的見光培養(yǎng)。（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長(zhǎng)幾日。1、打開封口膜2、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時(shí)間。（六）栽培3、移栽幼苗長(zhǎng)壯后，移栽到土壤中。幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長(zhǎng)情況，適時(shí)澆水、施肥，直至開花。2009年上學(xué)期①培養(yǎng)基的滅菌

（高壓蒸汽滅菌）②外植體的消毒

（酒精、氯化汞）③接種的無(wú)菌操作

（酒精、酒精燈——灼燒）④無(wú)菌箱中的培養(yǎng)；⑤移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時(shí)間。在整個(gè)過程中，是如何來(lái)實(shí)現(xiàn)無(wú)菌操作的？思考C、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、對(duì)接種操作中污染情況的分析接種3～4d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會(huì)表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。適時(shí)統(tǒng)計(jì)污染率，分析接種操作是否符合無(wú)菌要求。正常苗污染苗2、是否完成了對(duì)植物組織的脫分化和再分化觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)出愈傷組織。統(tǒng)計(jì)更換培養(yǎng)基后愈傷組織進(jìn)一步分化成根和芽的比例和時(shí)間。3、是否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)、對(duì)照與記錄做好統(tǒng)計(jì)和對(duì)照，填好結(jié)果記錄表。從實(shí)驗(yàn)的第一步開始就做好實(shí)驗(yàn)記錄，可以分組配制不同培養(yǎng)基，如誘導(dǎo)愈傷或直接分化叢芽的培養(yǎng)基，然后做不同配方的比較。4、生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基（離開培養(yǎng)瓶以后，沾有培養(yǎng)基的根系極易感染細(xì)菌，細(xì)菌大量繁殖，會(huì)導(dǎo)致爛根）又不能傷及根系。一般使用無(wú)土栽培的辦法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12h。掀開塑料薄膜后24h才能移栽。新移栽的組培