生物技術(shù)課件

原位PCR技術(shù)在獸醫(yī)中的應(yīng)用生物技術(shù)在獸醫(yī)方面的應(yīng)用ContentsPCR的基本原理1PCR反應(yīng)五要素2PCR的步驟3PCR反應(yīng)特點

4PCR技術(shù)研究新進展5PCR儀器的發(fā)展

6在獸醫(yī)分子生物技術(shù)中的應(yīng)用71.1PCR的基本原理聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR），又稱無細胞克隆技術(shù)(“freebacteria”cloningtechnique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR反應(yīng)五要素引物酶dNTP模板緩沖液即PCR反應(yīng)的五要素3.PCR的步驟1DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

4、PCR反應(yīng)特點PCR反應(yīng)特點特異性強

對標(biāo)本的純度要求低

靈敏度高

簡便、快速

4.1特異性強

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。4.2靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌。4.3簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。5、PCR技術(shù)研究新進展簡并PCR的原理基本原理就是根據(jù)氨基酸序列設(shè)計兩組帶有一定簡并性的引物庫，從不同生物物種中擴增出未知核昔酸序列的基因。簡并PCR簡并PCR的應(yīng)用找到進行PCR的基因序列，就會發(fā)現(xiàn)新基因。基因表達的檢測、病毒的檢測、基因組研究等。6、PCR儀器的發(fā)展pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。自perkin–elmercetus公司第一臺pcr擴增儀問世以來，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國內(nèi)外生產(chǎn)和銷售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經(jīng)過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。國內(nèi)外生產(chǎn)的幾種DNA擴增儀儀器型號生產(chǎn)廠家型式特點管數(shù)報價1109型北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合機械臂變溫水浴電子調(diào)溫40×0.5ml16400元/臺90A/B型中科院遺傳所機械臂變溫水浴電熱14000元/臺PTC-51A/B型軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院變溫氣流電子調(diào)兼作套式30×0.5ml12000元/臺DNAThermalCyclerPerkin–ElmerCetus(美)變溫鋁塊壓縮機致冷48×0.5mlUS$20000.-Thermocycler＃60＃00＃180B..Braun

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DM30000.-7.1檢測病原體與原位雜交相比,原位pcr先對待檢測片斷進行擴增,因而具有高度的敏感性,可檢出原位雜交檢不出的單拷貝、低拷貝（<20）基因?，F(xiàn)已被用于多種病原體，病毒如FMDV、IBDV等,細菌如結(jié)核桿菌等,最近用原位PCR檢測組織中寄生感染的文獻也有報道大大提高了這些病原體的檢出率.7.2觀察病原體在體內(nèi)的分布規(guī)律原位PCR能在感染組織的細胞內(nèi)顯示特定病毒的DNA或RNA序列,為病毒的組織細胞定位;能將擴增結(jié)果和細胞類型聯(lián)系,確定受感染細胞的類型,探明病原的分布規(guī)律;還能動態(tài)觀察具有感染性的細胞數(shù)量百分比,以此判斷病情,評價藥效

7.3檢測導(dǎo)入基因原位PCR可用基因檢測的手段對外來基因進行鑒定,并判斷基因?qū)胄颅h(huán)境后發(fā)生哪些變化,為臨床獸醫(yī)分子水平的研究和診斷提供有益的幫助,現(xiàn)已應(yīng)用于基因治療和轉(zhuǎn)基因動物等導(dǎo)入基因的檢測和觀察.參考文獻PCR技術(shù)詳解及分析鄧小紅任海芳重慶工商大