DNA重組技術(shù)的工具課件

目錄專題1基因工程專題2細胞工程專題3胚胎工程專題4生物技術(shù)的安全性和倫理問題專題5生態(tài)工程專題1基因工程本章考綱要求：學(xué)習(xí)目標1、簡述DNA重組技術(shù)所需三種基本工具的作用.2、認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。學(xué)習(xí)重、難點1、DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用。（重點）2、基因工程載體所需要具備的條件。（難點）一、基因工程的概念

是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)?；蚱唇蛹夹g(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀不同生物間的基因重組人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品思考從結(jié)構(gòu)上分析，為什么不同生物的DNA能夠重組？①基本單位相同空間結(jié)構(gòu)相同堿基配對方式相同基因工程的產(chǎn)物基礎(chǔ)理論催生了基因工程科技探索之路1)DNA是遺傳物質(zhì)的證明2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3)遺傳密碼的破譯1944年艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)DNA可從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體

1953年沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1958年梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制1958年克里克等提出中心法則1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達實驗的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明問題探討蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因工程的“專用工具”一“分子手術(shù)刀”

——限制性核酸內(nèi)切酶二“分子縫合針”

——

DNA連接酶三“分子運輸車”

——基因進入受體細胞的載體閱讀課本4-5頁“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)主要從原核生物中分離純化而來已經(jīng)分離出大約4000種1、識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列2、使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。形成兩種末端；黏性末端或平末端（一類酶）限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放21仔細觀察各限制酶識別的特定序列有何特點？限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點是：1、呈現(xiàn)堿基互補對稱，2、都可以找到一條中心軸線，3、中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。EcoRI限制酶的作用

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端?；仡?、基因工程的概念2、限制性核酸內(nèi)切酶

來源、種類、作用特點、作用結(jié)果限制酶識別的核苷酸序列、斷裂的化學(xué)鍵、產(chǎn)生的末端一、基因工程的概念

通俗地說，就按照

，通過嚴格的設(shè)計，并通過

和

等技術(shù)，賦予生物以新的

，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的

和

。由于基因工程是在

水平上進行設(shè)計和施工的，因此基因工程又叫做

或

。人們的意愿體外DNA重組轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型生物產(chǎn)品DNA分子DNA重組技術(shù)基因拼接技術(shù)限制酶的命名根據(jù)細菌種類而定，以EcoRI為例：三、限制酶識別的核苷酸序列的特點1、呈現(xiàn)堿基互補對稱；2、都可以找到一條中心軸線；3、中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是

反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列

大多數(shù)限制酶識別6個核苷酸序列，少數(shù)限制酶識別4、5或8個核苷酸序列

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

EcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackSmaI只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaI限制酶的作用在G與C之間切割平末端平末端SmaI限制酶的切割

當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。思考1、要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？２、用限制酶切一個特定基因要切斷幾個磷酸二酯鍵？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。４個3、如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶切割，結(jié)果如何？產(chǎn)生相同黏性（平）末端思考4000種限制酶識別85種核苷酸序列。一種限制酶只能識別一種核苷酸序列。一種核苷酸序列可以被多種不同限制酶識別。原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？尋根問底為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾,盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。請寫出EcoRI限制酶切割形成黏性末端的過程?！璆AATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ酶……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ酶下列DNA片段屬于同種限制酶切割的是42類型來源功能相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第5頁“分子縫合針”——DNA連接酶的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)

將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：

DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA（目前未發(fā)現(xiàn)）！可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與限制酶的聯(lián)系DNA連接酶的作用：

將雙鏈DNS片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二脂鍵?！璆AATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合形成重組DNA分子生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一種都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵幾種工具酶的作用比較以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G

(1)其中①和

是由一種限制酶切割形成的

末端，兩者要重組成一個DNA分子，所用DNA連接酶通常是

。（2）

和

是由另一種限制酶切割形成的

末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常是

。反饋練習(xí)：③T4DNA連接酶②④E·coliDNA連接酶

如圖，就下列與核酸相關(guān)酶的作用機理填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______

D.連接b處的酶為_______①③④②無小試牛刀載體的作用載體的必要條件載體的種類閱讀課本第6頁“分子運輸車”——運載體的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)1）能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3）具有某些標記基因，便于進行鑒定和選擇。4）必須是安全的，對受體細胞無害。5）載體DNA分子應(yīng)大小適中，以便于提取和操作1）作為運載工具，將目的基因?qū)胧荏w細胞中2）在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制①質(zhì)粒（存在于許多細菌以及酵母菌等生物細胞中）②病毒：λ噬菌體衍生物、動植物病毒等。

有標記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制最常用運載體——質(zhì)粒①質(zhì)粒本質(zhì)：獨立于擬核或細胞核之外的DNA分布：許多細菌、酵母菌等生物特點：自主復(fù)制、裸露、雙鏈、小型環(huán)狀①質(zhì)粒本質(zhì)：獨立于擬核或細胞核之外的DNA分布：許多細菌、酵母菌等生物特點：自主復(fù)制、裸露、雙鏈、小型環(huán)狀②最常用：大腸桿菌質(zhì)粒天然DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？

自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備所需條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。課堂小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶運載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在宿主細胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個多個限制酶切位點具標記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒

已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段?，F(xiàn)在多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是（）練習(xí)A.3B.4C.9D.12C已知標記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細菌的質(zhì)粒中有無標記基因或標記基因是什么？請設(shè)計實驗、預(yù)期實驗結(jié)果