包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性-純化課件

包涵體蛋白復(fù)性和純化策略MarketProportionbyHostCells(biopharmaceuticalproteinsor”Pharmateins”)Yeast:28%E.coli:54%Animalcell:21%E.coli

inclusionbodyroute

occupiesaboutahalf包涵體：在某些生長條件下，基因工程菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。包涵體的形成在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。最大缺點(diǎn)：一級結(jié)構(gòu)正確，高級結(jié)構(gòu)錯誤。

包涵體形成的主要原因1.表達(dá)量過高。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能完全正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。

2.重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體3.重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高（37-42℃）或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時容易形成包涵體。4.重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵體表達(dá)的有利因素Advantages:

1.可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。

2.降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。

有時甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的30%3.包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。

4.包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有活性，細(xì)胞破碎和以后復(fù)性前的純化步驟，不用考慮蛋白質(zhì)的失活問題。

分離純化細(xì)菌包涵體蛋白質(zhì)的基本步驟：破碎細(xì)胞

(Disruptionofcell)↓

分離包涵體

(Seperationofinclusionbody)↓

溶解包涵體

(Dissolve

inclusionbody)↓

蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原等。

(Recoveryoftargetproteinconformation)包涵體的復(fù)性前準(zhǔn)備洗滌：由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。包涵體的溶解

1.采用高濃度的變性劑，使其形成伸展的肽鏈。常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強(qiáng)。變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏堿性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。有些蛋白只能用鹽酸胍。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。

4.還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mMDTT，也有使用5mM濃度。實際，還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響。對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯合劑EDTA去除金屬離子。(伸展態(tài))U→(中間態(tài))I→(自然態(tài))N↓

A（包涵體）從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢。當(dāng)溶液中離子強(qiáng)度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時，聚集趨勢占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。蛋白質(zhì)折疊的三態(tài)模型復(fù)性目的

蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個蛋白質(zhì)都有一個最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進(jìn)一步的層析分離得以順利完成。三、包含體蛋白復(fù)性方法幾個要求：活性蛋白的回收率高正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤的折疊蛋白質(zhì)分離。折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品復(fù)性過程耗時少復(fù)性常用方法

1.稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺點(diǎn)是體積增加較大，后續(xù)處理困難。稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體（較低的復(fù)性收率）。有時需低于0.01mg/mL。

脈沖流加復(fù)性：分批次加入到緩沖液中，使折疊中間體保持在較低的水平。例：在5-10mg/mL終濃度下，溶菌酶復(fù)性收率可達(dá)80%以上。4.色譜復(fù)性：輔助手段，兼具分離。

4.1凝膠過濾復(fù)性：除了蛋白質(zhì)在膠粒中傳質(zhì)和擴(kuò)散外，蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間并沒有發(fā)生其他作用。該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，對有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。

4.2吸附型層析復(fù)性：離子交換、疏水層析、親和層析和擴(kuò)張床層析均屬于吸附層析。其基本復(fù)性原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復(fù)性。5.分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰一輔氨酰順反異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。

體內(nèi)復(fù)性主要是在工程菌培養(yǎng)過程中同時加入分子伴侶的基因進(jìn)行共表達(dá)；體外復(fù)性主要是將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫助折疊。StandardIBRenaturationProcess

CellDisruptionRefoldingPost-refoldingpurificationstepIBIsolationIBWashingSolubilizationCentrifugation

RemoveCellDebrisDenaturantPartialRemovalofDenaturantCompleteRemovalofDenaturantIBDissolvedRefoldingE.g1:rhGM-CSFfrE.coliinclusionbodiesPhenylSepharoseFFQSepharoseFFSuperdex75PrepGradeHICIEXGFRenaturedrhGM-CSFRemovesbufferconstituents(Guanidine-HCl,Berol185,glutathioneetc)Purificationfactor:ca2Recovery:92%ofactivityConcentrationfactor:ca5Belew,M.etal.(1994)J.Chromatogr.A,679:67-83大腸桿菌包涵體表達(dá)

(His)6

融合蛋白的擴(kuò)增，純化和復(fù)性E.g2:過程32細(xì)胞培養(yǎng)收獲細(xì)胞細(xì)胞破碎離心5-10000g沉淀物沖洗和離心分離包涵體HiTrap?Chelating＋Ni2+純化和復(fù)性溶解包涵體-細(xì)胞破碎,沖洗和分離每100ml培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞沉淀物於4ml20mMTris?-HClpH8.0在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細(xì)胞，并在+4oC下高速離心10分鐘重新懸浮細(xì)胞沉淀物於2ml含

e.g.urea的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩并在+4oC下高速離心10分鐘用沖洗緩沖液沖洗細(xì)胞沉淀物332MUREA20mMTrisHCl2%TritonX1000.5MNaCl溶解和準(zhǔn)備樣品重新懸浮細(xì)胞沉淀物於5ml溶解緩沖液(e.g.): 20mMTris?-HCl,0.5MNaCl,

5mM咪唑,6M鹽酸胍,

1mM2-巰基乙醇pH834在室溫等30-60分鐘在+4oC離心15分鐘用0.22μm或0.45μm濾膜過濾準(zhǔn)備HiTrap?Chelating柱沖洗5mlH2O加0.5ml0.5MNiSO4沖洗5mlH2O用5-10ml20mMTris?-HCl,

5mM咪唑,6M鹽酸胍,

1mM2-巰基乙醇pH8結(jié)合緩沖液洗柱35最多5分鐘純化和復(fù)性36稀釋樣品,用10ml結(jié)合緩沖液洗柱，5mM咪唑,6M鹽酸胍,pH8.0

上樣，并以20mM咪唑,6M尿素pH8.0緩沖液洗柱復(fù)性

線性梯度：~6to0M尿素

最少30柱體積

流速：0.1ml/min-1ml/min

用沒有尿素緩沖液沖洗5個柱體積純化和洗脫

線性梯度:20mM-500mM咪唑

10-20柱體積用HiTrapDesalting交換緩沖液去除咪唑1.00.750.50.25010203040506065mlManuallyusingasyringe:?Sampleloading?Gua-HClwash?UreawashStartelutionfr.38fr.42fr.46fr.49fr.40Startrefold-ingA280組份分析371: LMW2: 樣品3-6: 鹽酸胍沖洗物7,8: 尿素沖洗物1: LMW2-6: 組份38-427,8: 組份48,491.00.750.50.2505101520mlA280kD

9467

43

3020.114.41 2 3 4 5 6 7 8kD

9467

43

3020.114.41 2 3 4 5 6 7 8Superdex?75HR10/30SDSPAGEPhastGel?Gradient10–15樣品稀釋前處理: 用15%SDS,30%2-巰基乙醇 +10mMTris+1mMEDTA稀釋1:5HiTrapChelating1mlSuperdex75HR10/30文章信息

體內(nèi)，蛋白折疊錯誤，引發(fā)疾病。