生物制藥技術(shù)2-基因構(gòu)建課件

生物制藥技術(shù)2016-3-71《生物制藥技術(shù)（含實驗）》課程教學(xué)大綱2生物制藥研發(fā)的基本流程3基因構(gòu)建發(fā)酵培養(yǎng)分離純化制劑研究質(zhì)量研究中試放大穩(wěn)定性研究藥效學(xué)研究安全藥理研究臨床申報藥學(xué)(實驗室)藥學(xué)(中試)藥理學(xué)臨床試驗2.1.1基本概念2.1.2質(zhì)粒、載體2.1.3工程細胞與細胞庫2.1.4表達方式選擇2.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達2.1.6實例2.1基因與工程細胞構(gòu)建5第二章重組蛋白藥物的藥學(xué)概論2.1

基因與工程細胞構(gòu)建基因重組——分子水平、提取、連接、轉(zhuǎn)染、復(fù)制、表達別稱——基因工程、DNA重組、遺傳工程、基因操作、克隆工程細胞的三要素基因載體宿主細胞62.1.1基本概念基因——一段具有蛋白結(jié)構(gòu)編碼的核酸序列載體——質(zhì)粒、噬菌體、病毒限制性內(nèi)切酶、連接酶抗生素抗性基因——Kan、Neo、Tet、Amp、Str宿主細胞——細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞2.1

基因與工程細胞構(gòu)建72.1.1基本概念2.1.2質(zhì)粒、載體2.1

基因與工程細胞構(gòu)建92.1

基因與工程細胞構(gòu)建102.1

基因與工程細胞構(gòu)建11原始種子庫主種子庫工作種子庫2.1

基因與工程細胞構(gòu)建13調(diào)控調(diào)控生物遺傳中心法則DNARNAProtein2.1

基因與工程細胞構(gòu)建14蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)PrimaryStructure——ThesequenceofaminoacidsonthepolypeptidechainSecondaryStructure——Conformationofthepolypeptidechain(3Dstructure)TertiaryStructure——ThreeDimensionalStructure(Folding)oftheproteinQuaternaryStructure——Complexationwithotherproteins(Similarordissimilarstructures)2.1基因與工程細胞構(gòu)建152.1.4表達方式選擇2.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達2.1基因與工程細胞構(gòu)建172.1基因與工程細胞構(gòu)建182.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達SolubleInclusionBodySecreting2.1

基因與工程細胞構(gòu)建原核細胞表達系統(tǒng)192.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達正常細胞生長特性錨地依賴性血清依賴性接觸抑制性形態(tài)依賴性體外培養(yǎng)正常細胞改變某些特征，越過生理臨界點，繼續(xù)無限制分裂——細胞系形成2.1基因與工程細胞構(gòu)建哺乳動物細胞表達系統(tǒng)212.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達哺乳動物細胞表達系統(tǒng)受體細胞條件細胞系特征——喪失細胞接觸抑制和錨地依賴性遺傳穩(wěn)定性——外源基因多次傳代不丟失合適的標記——便于篩選與維持生長快且齊——分裂周期短，生長均一安全性——不合成、分泌致病物質(zhì)，不致癌以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞必須條件2.1基因與工程細胞構(gòu)建222.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達遺傳標記哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1

基因與工程細胞構(gòu)建232.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達真核表達載體必要原件高活性啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、有效mRNA翻譯信號復(fù)制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位點標志基因內(nèi)含子內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1

基因與工程細胞構(gòu)建

一般真核mRNA的翻譯都需要5'帽子來介導(dǎo)核糖體結(jié)合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5'端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合，起始蛋白質(zhì)翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內(nèi)部核糖體進入位點序列（Internalribosomeentrysite,IRES）252.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)的方式IPTG/乳糖低溫pH低磷表達檢測方式表達標志物電泳GFP遺傳穩(wěn)定性基因穩(wěn)定性——瓊脂糖電泳、指紋圖譜、PCR、測序表達穩(wěn)定性——表達標志物、活性四環(huán)素蛻皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1

基因與工程細胞構(gòu)建262.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達組織纖溶酶原激活劑2.1基因與工程細胞構(gòu)建292.1.6實例組織纖溶酶原激活劑2.1基因與工程細胞構(gòu)建302.1.6實例tPArPA

527個氨基酸分子量65kD缺失突變

355個氨基酸

分子量39kDKringleⅡ、絲氨酸蛋白酶區(qū)Finger區(qū)、KringleⅠ、KringleⅡ、EGF區(qū)、絲氨酸蛋白酶區(qū)2.1

基因與工程細胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑312.1.6實例2.1基因與工程細胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑322.1.6實例載體：pET-44a宿主菌：BL21酶切位點：PshAⅠ/HindⅢ2.1

基因與工程細胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑3