實驗六現(xiàn)代免疫學檢測技術ELISA課件

實驗六現(xiàn)代免疫學檢測技術：

ELISA1.了解ELISA的原理及其優(yōu)點，2.掌握試劑盒的使用。3.學習ELISA的實驗操作過程及其應用。一、實驗目的免疫酶技術（酶免疫測定法）

免疫酶技術:將抗原抗體反應的特異性，與酶反應的敏感性相結合的一種方法。它以酶作為標記物，與抗體（或抗原，抗抗體）聯(lián)結，形成酶標抗體（抗原，抗抗體），其與相應的抗原（或抗體）作用后，通過底物的顏色反應進行抗原（抗體）的定性和定量（酶標測定儀），亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究，即酶免疫組織化學技術。目前應用最多的免疫酶技術是酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。二、實驗原理ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化。抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定。酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色。ELISA：根據(jù)檢測目的和操作步驟不向，有以下三種類型的常用方法。酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法雙抗夾心法

竟爭法雙抗體夾心法雙抗原夾心法

(1)包被固相抗體（室溫放置，廠家完成）

(2)加入待檢樣品（抗原）抗體抗原ELISA檢測—雙抗體夾心法（測抗原）放大的反應小孔酶標抗體

(4)加入酶反應底物后顯色（HRP酶與底物反應后,顯蘭色）底物(3)加入酶標抗體試劑（夾心餅干形成!）ELISA檢測—雙抗體夾心法（測抗原）酶標板酶標儀1．乙肝病毒表面抗體(HBsAb)診斷試劑盒。預包被微孔條（包被純化HBsAg）酶結合物：辣根過氧化物酶標記HBsAg

（HBsAg-HRP）抗HBs陽性對照抗HBs陰性對照洗滌液(濃縮液，用前以蒸餾水稀釋，按說明)底物A（H2O2）、底物B（四甲基聯(lián)苯胺<TMB>）和終止液（HCl及2mol/LH2SO4）。四、實驗材料2．乙肝病毒表面抗原(HBsAg)診斷試劑盒。

預包被微孔條（包被純化HBsAb）

酶結合物：辣根過氧化物酶標記HBsAb

（HBsAb-HRP）

HBsAg陽性對照血清

HBsAg陰性對照血清

洗滌液(濃縮液，用前以蒸餾水稀，按說明)底物A、B和終止液。3．微量加樣器，吸水紙等。四、實驗材料1.待檢測樣品待測血清4種：1號、2號、3號、4號注意：待測血清是從醫(yī)院采集的正常血清(人為加進去乙肝表面抗原或者抗體)，但是并不表示血清中不含有可傳染的疾病，所以實驗中要注意安全。五、實驗步驟3.檢測方法

（1）加樣：每孔加待檢血清50ul,每次實驗各做1個陰性對照和陽性對照。注意：每位同學選擇一種待測血清進行檢測（見下圖）。五、實驗步驟陰性陽性待檢血清1號,2號,3號，4號……….對照對照1號同學取待測血清1號陰性陽性待檢血清1號,2號,3號，4號………….對照對照1號同學取待測血清1號2號同學取待測血清2號2號同學取待測血清2號（1）加樣：其他按說明書操作！各50ul血清(2)每孔加1滴酶結合物,充分混勻，37℃孵育30min。(3)甩棄孔內(nèi)液體（在水池中甩棄，不要在實驗室中隨地甩棄）；(4)每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩干。同上洗滌重復4次，拍干。五、實驗步驟4.實驗結果及結論五、實驗步驟陰性對照孔陽性對照孔待測1待測2待測3待測4結果結論5.作業(yè)：按實驗報告要求寫出并上交實驗報告。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原體。在中國，HBV感染或攜帶者已超過1.3億，發(fā)病人數(shù)超過3000萬人。HBV基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，其中有一個單鏈區(qū)。HBV的抗原組成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)組成。三種抗原具有其相應抗體：HBsAb（抗表面抗原抗體）、HBeAb（抗e抗原抗體）、HBcAb（抗核心抗原抗體）。知識介紹HBsAg為二聚體糖蛋白，大量存在于感染者血液中，為HBV感染的主要標志；HBcAg存在于Dane顆粒核心結構表面，為內(nèi)殼成分，其外被HBsAg覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出，但能刺激機體產(chǎn)生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV處于復制狀態(tài)；HBeAg游離于血中，其消長與病毒體消長及DNA多聚酶消長基本一致，故HBeAg為HBV復制及具有強感染性的一個指標；知識介紹HBsAg（本實驗測）HBeAg抗-HBs（本實驗測）抗-HBe抗-HBc結果分析+----HBV感染或無癥狀攜帶者++---急慢性乙肝或攜帶者++--+“大三陽”急慢性乙肝患者（傳染性強）+--++“小三陽”急慢性乙肝感染，趨向于恢復--+++既往感染恢復期----+既往感染或“窗口期”--+--既往感染或接種過疫苗乙肝兩對半檢測的結果判斷方法【注意事項】1．試劑盒應于4℃存放，在有效期內(nèi)使用。2．微孔條須密封防潮，從冷藏環(huán)境中取出時,應在室溫中平衡至潮氣盡干后方可開封啟用，余者及時封存。3．滴加試劑前應將瓶搖勻，使液體混勻。滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確，注意勿將試劑滴在孔壁上。4．洗滌時各孔均須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈。5．待測標本不可用NaN3防腐。所有樣品都應按傳染源處理。知識介紹（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；

（7）孔內(nèi)污染雜物；

（8）酶標儀濾光片不正確；

（9）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現(xiàn)假陽性反應等。

2．測定的重復性差3．白板

（陽性對照不顯色）

（1）漏加酶結合物；