病毒培養(yǎng)技術(shù)

病毒培養(yǎng)技術(shù)第1頁/共28頁病毒增殖技術(shù)第2頁/共28頁動物增殖病毒技術(shù)禽胚增殖病毒技術(shù)細胞增殖病毒技術(shù)第3頁/共28頁一、動物增殖病毒技術(shù)

選擇動物的標準：①大動物應(yīng)來源于非疫區(qū)，最好是未接種過相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康(經(jīng)臨床檢查、檢疫)；②對相應(yīng)病毒易感，并十分敏感；③經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康；④家兔、小鼠、大鼠等應(yīng)符合普通級或清潔級實驗動物標準；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級標準；犬和貓應(yīng)品種明確，并符合普通級實驗動物標準；⑤體重、年齡要基本一致，個體差別不宜過大。

第4頁/共28頁二、禽胚增殖病毒技術(shù)（一）禽胚的選擇

SPF雞胚據(jù)國家標準，無22種特定病原體非免疫雞胚應(yīng)無特定病原的母源抗體，普通雞胚可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn)異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚第5頁/共28頁（二）禽胚接種途徑與收獲

絨毛尿囊膜接種法尿囊腔接種法卵黃囊接種法羊膜腔接種法靜脈接種法腦內(nèi)接種法第6頁/共28頁雞胚絨毛尿囊膜接種法

第7頁/共28頁尿囊腔接種法

第8頁/共28頁尿囊液收獲方法

第9頁/共28頁雞胚卵黃囊接種法第10頁/共28頁1．種蛋質(zhì)量①病原微生物：垂直傳遞，如白血病、腦脊髓炎、腺病毒、支原體及傳染性貧血因子等。②母源抗體：③抗生素：立克次氏體和鸚鵡熱衣原體2．孵化技術(shù)①溫度：37～39.5℃。傳染性支氣管炎病毒37℃②濕度：雞胚53％～57％，水禽胚比雞胚高5％～10％。③通風(fēng)：氧氣，二氧化碳。④翻蛋：（三）影響禽胚增殖病毒的因素第11頁/共28頁3．接種技術(shù)

不同病毒的增殖有不同的接種途徑，同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。接種日齡：雞胚13～14日齡。鴨胚15～16日齡，尿囊液含量最高，平均約6～8ml，羊水約1～2ml。接種部位：不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育嚴格防止禽胚污染

①雞胚接種時嚴格無菌操作；

②定期清掃消毒孵化室，保持室內(nèi)空氣新鮮；

③種蛋入孵前先用溫水清洗，消毒，涼干。第12頁/共28頁三、細胞增殖病毒技術(shù)

1．細胞培養(yǎng)的概念

細胞培養(yǎng)(cellculture)是指利用機械、酶或化學(xué)方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至2～4個細胞團懸液進行培養(yǎng)。細胞分類：根據(jù)細胞染色體和繁殖特性原代細胞(primarycell)

細胞株(cellstrain)

傳代細胞（continuedcellline）

細胞系(cellline)第13頁/共28頁（1）原代細胞(primarycell)

指由新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細胞，如CEF細胞。（2）細胞株(cellstrain)又稱二倍體細胞指自繼代培養(yǎng)的細胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標記的細胞。這類細胞且能保持原來的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很多代(50～100代)，但為有限生命；沒有腫瘤原。如PKl5、BHK21和Vero（3）傳代細胞（continuedcellline）\

細胞系(cellline)

能在體外無限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡性腫瘤細胞，且多來源于癌細胞，如HeLa細胞系

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靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(suspensioncellculture)微載體培養(yǎng)(microcarriercellculture)

中空纖維細胞培養(yǎng)(hollowfibrecellculture)

微囊化細胞培養(yǎng)2．細胞培養(yǎng)方法第15頁/共28頁懸浮培養(yǎng)通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞。微載體培養(yǎng)微載體直徑應(yīng)為60～105nm，無毒性，透明，顆粒密度與培養(yǎng)液密度相近似，略重于液體，低速攪拌即能懸浮，不吸收培養(yǎng)液和化學(xué)反應(yīng)，表面光滑、硬度小、有彈性，易于細胞吸附在表面，如DEAE—SephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微載體培養(yǎng)的容器為特制的生物反應(yīng)器，有自動化裝置。細胞產(chǎn)量達106～107個/m1，每升培養(yǎng)液可加微載體2～5g，每克有8000～9000個珠子，培養(yǎng)面積約為2～5萬cm2，比常規(guī)培養(yǎng)面積大10～25倍。第16頁/共28頁中空纖維細胞培養(yǎng)(hollowfibrecellculture)

組成:中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯－丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅等材料制成，外徑50~100μm，壁厚25~75μm，壁呈海綿狀，上面有很多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對細胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有滯留作用。培養(yǎng)液能有效地分布，細胞培養(yǎng)維持時間可達數(shù)月，保持高度活性，培養(yǎng)的細胞密度大，細胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度可達60％～90％；占用空間小，適于各類細胞，但設(shè)備昂貴。第17頁/共28頁培養(yǎng)液血清細胞接種量pH溫度無菌條件培養(yǎng)器皿清潔度3.細胞培養(yǎng)要素RPMI-1640、199、DMEM、F12

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血清成分：必需氨基酸、促進細胞生長和貼壁的成分。α-珠蛋白和白蛋白能促進細胞生長；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促進細胞貼壁。血清選擇：同種動物優(yōu)于異種動物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。血清使用：目前國內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)56℃滅活30min，并進行細胞毒性試驗。生長液血清含量一般為5％～20％。維持液中血清量為0%～5％。血清替代因子：激素和生長因子（如胰島素、上皮生長因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無血清培養(yǎng)液須補加3～8種血清替代因子。第19頁/共28頁細胞接種量細胞在生長過程中分泌刺激細胞分裂的物質(zhì)，若細胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。接種細胞數(shù)量越大，細胞生長為單層的速度越快，但細胞過多對細胞生長也不利。雞胚成纖維細胞為100萬／m1小鼠或地鼠腎細胞為50萬／m1猴腎細胞量為30萬／ml傳代細胞為10～30萬／m1第20頁/共28頁(1)細菌污染(2)真菌污染：念珠菌或酵母菌。培養(yǎng)液中可見黃白色小點狀懸浮物鏡檢時可見菌絲結(jié)構(gòu)。(3)支原體污染：污染率為50％～60％(4)病毒污染

①組織帶毒

②培養(yǎng)液帶毒4．細胞培養(yǎng)污染問題第21頁/共28頁（1）血清：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過2％。（2）溫度：狂犬病病毒32℃，犬皰疹病毒36℃。（3）pH：（4）病毒接種劑量：應(yīng)以TCID50為依據(jù)一般按維持液的1％～10％(V／V)量接入。接種量小，細胞不能完全發(fā)生感染，會影響毒價；接種量過大，會產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒。

(5)病毒接種方法：異步接毒和同步接毒。5.細胞培養(yǎng)病毒要素第22頁/共28頁6.病毒增殖指標與收獲細胞病變(CPE)：①細胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；②細胞聚合，如腺病毒；③細胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；④輕微病變，如正粘病毒、冠狀病毒等。包涵體和血凝性：也可作為檢查病毒增殖的指標。有些病毒不產(chǎn)生CPE。病毒收獲：CPE達80％時收獲，反復(fù)凍融多次使病毒釋放，然后離心除去細胞碎片，上清病毒液