半合成抗生素的制備工藝特點(diǎn)及技術(shù)評(píng)價(jià)要素探討

半合成抗生素的制備工藝特點(diǎn)及技術(shù)評(píng)價(jià)要素探討評(píng)三部張哲峰馬磊張星一摘要：本文針對(duì)半合成抗生素制備工藝的特殊之處，歸納了其研發(fā)和審評(píng)中的關(guān)注點(diǎn)：起始原料（發(fā)酵產(chǎn)物）組份和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致的終產(chǎn)品組份和產(chǎn)品純化問題;起始原料（發(fā)酵產(chǎn)物）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致的合成路線選擇性問題，由于原料藥的活性基團(tuán)較多必須對(duì)反應(yīng)進(jìn)行過程控制；天然來源起始原料的立體構(gòu)型經(jīng)合成反應(yīng)后引起的構(gòu)型轉(zhuǎn)化問題；毒性或無效雜質(zhì)及異構(gòu)體的限度問題；起始原料（發(fā)酵產(chǎn)物）的合法來源問題。天然抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)適當(dāng)修飾以改善其性能，是探索開發(fā)新藥的有效途徑之一，得到的化合物稱之為半合成抗生素。天然抗生素的結(jié)構(gòu)修飾在擴(kuò)展抗菌譜、增強(qiáng)抗菌活性、克服耐藥性、提高穩(wěn)定性、改善藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)（提高血藥濃度、改善組織分布、延長消除半衰期）、降低毒副反應(yīng)以及適應(yīng)制劑需要等方面取得了可觀成績。在歷年上市的新抗生素中，半合成抗生素所占比率逐年上升，2001年以后上市的6種新抗生素均為半合成抗生素。在天然抗生素的結(jié)構(gòu)修飾中一般采用化學(xué)方法：半合成法簡(jiǎn)便易行，但結(jié)構(gòu)可變的幅度有一定限制；全合成法雖可大幅度改變結(jié)構(gòu)，組合化學(xué)法便于高通量篩選，但路線較長，對(duì)工藝條件要求嚴(yán)格，所產(chǎn)生的異構(gòu)體、相關(guān)雜質(zhì)多而復(fù)雜，用到大量有機(jī)溶劑，產(chǎn)品純化精制比較困難，具有相當(dāng)大的難度；近年還有采用添加前體的生物合成與生物轉(zhuǎn)化等方法，以及采用基因工程、細(xì)胞工程以及組合生物合成等生物學(xué)方法。在天然抗生素的結(jié)構(gòu)修飾方法中，半合成法仍占主導(dǎo)地位。尤其在我國目前的注冊(cè)申報(bào)中基本都采用的是半合成方法?？股氐陌牒铣芍苽涔に囃话慊瘜W(xué)藥的化學(xué)合成工藝相比，存在一些特殊之處，主要表現(xiàn)在所用天然來源起始物不同于普通的化工產(chǎn)品，在化學(xué)結(jié)構(gòu)、組份以及來源等方面都有其獨(dú)特之處，值得在研發(fā)和審評(píng)中予以關(guān)注。首先，其起始物為生物發(fā)酵產(chǎn)物，與一般的化學(xué)合成品相比，具有純度較差、組份多且復(fù)雜的特點(diǎn)，因其組份的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，多為同系物，純化分離較為困難，同樣會(huì)參與后續(xù)的合成反應(yīng)，導(dǎo)致多種副產(chǎn)物的產(chǎn)生，給中間體的純化和質(zhì)量控制以及終產(chǎn)品的純度和質(zhì)量帶來一定影響，有時(shí)得到半合成抗生素同樣是一種多組份抗生素，控制原料組份和反應(yīng)條件會(huì)直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量。目前常用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素乙酰螺旋霉素即是一個(gè)典型實(shí)例，該品早期研究時(shí)由于受到分離分析技術(shù)的制約，對(duì)起始原料螺旋霉素的組份情況不是十分清楚，后經(jīng)中國藥品生物制品檢定所專家對(duì)國產(chǎn)和日本進(jìn)口的乙酰螺旋霉素進(jìn)行對(duì)比分析后，清晰揭示了該品的結(jié)構(gòu)和組份情況，螺旋霉素中主要有螺旋霉素I、II、III三個(gè)組分，其中螺旋霉素1、11最終被合成為單、雙乙酰螺旋霉素ii,螺旋霉素m最終成為單、雙乙酰螺旋霉素111,目前臨床應(yīng)用的乙酰螺旋霉素為單乙酰螺旋霉素II、單乙酰螺旋霉素hi、雙乙酰螺旋霉素ii、雙乙酰螺旋霉素m四個(gè)組份的混合物，其效價(jià)之比為1250：1200：1200：1500。因此，得到較好的單、雙乙酰螺旋霉素比例，是提高成品效價(jià)的關(guān)鍵。研究表明，螺旋霉素原料對(duì)成品的效價(jià)有很大的影響，不同來源的螺旋霉素在乙?；^程中會(huì)有較大的差異。因此，在生產(chǎn)過程中需要及時(shí)跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，適當(dāng)調(diào)整?；瘯r(shí)間或催化劑用量，以控制螺旋霉素的?；潭?；由于雙乙酰螺旋霉素m與其他三個(gè)主要成分相比效價(jià)明顯要高，因此在選擇螺旋霉素原料時(shí)應(yīng)盡量用螺旋霉素m組分較多的原料，另外DMAP的用量在反應(yīng)中是一個(gè)關(guān)鍵的因素。如用量少，成品中單乙酰螺旋霉素的量相對(duì)增加，雙乙酰螺旋霉素相對(duì)減少，雙乙酰螺旋霉素m含量的減少必然導(dǎo)致效價(jià)的降低；如DMAP用多了，成品中雙乙酰螺旋霉素含量過高，超過藥典所規(guī)定的65%的限度，則導(dǎo)致藥品不合格。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，不同的螺旋霉素原料所適用的DMAP用量也有較大的差異，且不同等級(jí)或批號(hào)的DMAP會(huì)給成品的總組分與單、雙比例造成波動(dòng)。研究還發(fā)現(xiàn)，在酰化反應(yīng)中，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系的pH值等因素會(huì)影響到產(chǎn)品質(zhì)量和收率。對(duì)于氨基糖苷類抗生素異帕米星的合成情況也是如此，以慶大霉素B為母核，與側(cè)鏈異絲氨酸反應(yīng)即得本品，慶大霉素B由微生物發(fā)酵制得，所用棘抱小單抱菌突變株尚不是產(chǎn)生慶大霉素B的單組分菌種，發(fā)酵液中還含慶大霉素C族組分，故需對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取分離，并考慮這些組份參與后續(xù)合成反應(yīng)后，對(duì)終產(chǎn)品組份情況的影響，氨基糖苷類抗生素的某些組份具有明顯的耳毒性和腎毒性，因此，這些副產(chǎn)物的生物活性和毒性等是研發(fā)和審評(píng)的關(guān)注點(diǎn)。其次，作為生物合成的起始物，分子結(jié)構(gòu)中含有的活潑基團(tuán)（如羥基、氨基、醛基等）較多，而化學(xué)修飾時(shí)，僅希望修飾其中的一部分，而另一些官能團(tuán)需要進(jìn)行化學(xué)保護(hù)，因而，增加了合成制備工作的復(fù)雜性。氨基糖苷類半合成抗生素的制備中不但存在起始原料（發(fā)酵產(chǎn)物）的組份純度問題，而且存在活潑基團(tuán)的保護(hù)問題。威替米星由發(fā)酵產(chǎn)物威大米星為起始原料，在1-N進(jìn)行乙基化修飾而得到，一般有三條合成路線：1）以威大米星為起始原料，直接同乙醛反應(yīng)，然后進(jìn)行硼氫化還原，分離純化得到本品；2）以威大米星為起始原料，先制得3,2,6—三乙酰威大米星，再與乙醛反應(yīng)生成Schiff堿，然后進(jìn)行硼氫化反應(yīng)還原，精制純化，脫三乙酰保護(hù)基團(tuán)得到本品；3）以威大米星為起始原料，溶解于DMF中，加入乙酸酐，保護(hù)2’，3,6'的三個(gè)氨基，得到3,2'，6'—三乙酰威大米星（I），中間體I溶解于乙二醇二甲醚（DME）中與六甲基二硅胺烷進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，保護(hù)5,2’，4’的三個(gè)羥基，得到3,2’，6’一三乙酰一5,2'',4''一三硅烷化威大米星（II），中間體II與乙醛反應(yīng)，生成Schiff堿（III），III再發(fā)生硼氫化反應(yīng)，在1-N上連接乙基，經(jīng)過NaOH處理，樹脂純化，硫酸成鹽，得到硫酸威替米星。對(duì)活性基團(tuán)的保護(hù)問題在上述三種工藝中具有不同的措施，合成中不對(duì)擬不修飾的活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，得到的產(chǎn)物組份復(fù)雜，純化分離的難度加大；對(duì)這些基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，可減少產(chǎn)物分離純化的難度，但增加了合成反應(yīng)的復(fù)雜性，在研發(fā)和評(píng)價(jià)中應(yīng)對(duì)其權(quán)衡利弊，綜合考慮。硫酸異帕米星的合成工藝同樣存在類似問題，該品的常見合成工藝為：以慶大霉素B為起始原料，與正-叔丁氧羰基疊氮物反應(yīng)，使6位伯胺的叔丁氧碳?；；?，再與S-N-（3-芐氧羰基氨基-2-羰基丙酰氧基）-琥珀酰胺反應(yīng)，使1位芐氧羰酰異絲氨酸?；?，再氫化水解脫保護(hù)基叔丁氧碳?；推S氧羰?；?，得異帕米星，經(jīng)離子交換樹脂分離純化后與硫酸反應(yīng)得硫酸異帕米星粗品。用甲醇：水（3：1）的混合溶劑重結(jié)晶，再用二氯甲烷洗滌除去其它有機(jī)雜質(zhì)。問題是：慶大霉素B結(jié)構(gòu)中1、3、6'位均連接氨基，反應(yīng)活性相當(dāng)，申報(bào)單位采用羥基硅烷化后產(chǎn)生的空間位阻作用降低3、6'位氨基的反應(yīng)活性，以保證得到異帕米星。根據(jù)文獻(xiàn)或?qū)＠?，一般采用叔丁氧羰基法或甲?；Ｗo(hù)法直接保護(hù)3、6'位氨基，又根據(jù)本品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果，3位氨基進(jìn)行?；母碑a(chǎn)物約2%，提示3、6'位氨基都有可能參加了反應(yīng)，故建議在質(zhì)量研究中應(yīng)分析目前采用的有關(guān)物質(zhì)檢查方法是否能將可能產(chǎn)生的副產(chǎn)物檢出，提供相關(guān)的檢測(cè)圖譜，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定是否訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。第三，起始原料（發(fā)酵產(chǎn)物）合法來源問題也是一個(gè)值得關(guān)注的問題，比如發(fā)酵菌種的來源、鑒定、發(fā)酵工藝的控制與產(chǎn)品組份和結(jié)構(gòu)等質(zhì)量信息間的關(guān)系等需要研發(fā)者和評(píng)價(jià)者予以關(guān)注。氨基糖苷類半合成抗生素的制備中通常所用起始原料大多結(jié)構(gòu)類似，僅存在微小差別，比如有些起始物生產(chǎn)菌是在慶大霉素發(fā)酵菌種基礎(chǔ)上進(jìn)行誘變得到，甚至發(fā)酵產(chǎn)物為純度較高的慶大霉素某一組份。因此，在其合成工藝的評(píng)價(jià)中，還需關(guān)注發(fā)酵菌種的來源和鑒定情況，尤其當(dāng)所用發(fā)酵產(chǎn)物并不是獲準(zhǔn)上市藥品時(shí)更需引起關(guān)注。異帕米星和威替米星的合成起始原料慶大霉素B和威大米星均為微生物發(fā)酵制得，且均不是上市原料藥，其生產(chǎn)菌和成熟的發(fā)酵技術(shù)僅為某些機(jī)構(gòu)作掌握，因此，對(duì)這類原料的來源不能等同于普通的化工產(chǎn)品，需要提供詳細(xì)的菌種來源、鑒別及傳代穩(wěn)定性等資料以及起始原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（重點(diǎn)說明其組份純度情況），并分析其它組份雜質(zhì)經(jīng)后續(xù)合成過程后，可能生成的副產(chǎn)物及其控制措施。第四、天然來源起始原料的分子結(jié)構(gòu)中大多存在構(gòu)型問題，有時(shí)這些構(gòu)型的穩(wěn)定性不是十分穩(wěn)固，需要考慮在后續(xù)的化學(xué)合成過程中是否會(huì)引起這些構(gòu)型的轉(zhuǎn)化，以及如何對(duì)此進(jìn)行監(jiān)控并予以保護(hù)。威替米星及其合成起始原料威大米星均有12個(gè)手性中心，雖然從兩個(gè)結(jié)構(gòu)式看，手性中心的位置沒有發(fā)生改變，但在合成中，尤其活潑基團(tuán)的保護(hù)和解保護(hù)以及反應(yīng)過程的酸堿環(huán)境等因素是否會(huì)引起手性中心的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，需要說明在合成過程中如何保持現(xiàn)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并說明在合成過程中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的措施以及驗(yàn)證方法。第五、天然抗生素的結(jié)構(gòu)修飾中特定副反應(yīng)的控制也是研發(fā)和審評(píng)中值得關(guān)注的一個(gè)問題。如5-內(nèi)酰胺抗生素類抗生素是另一類臨床用量很大的半合成抗生素。通常采用7-ACA或7-ADCA為原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。合成過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的問題包括△-異構(gòu)體（即雙鍵的位置異構(gòu)體）及側(cè)鏈肟基的順反異構(gòu)現(xiàn)象。由頭匏菌素構(gòu)效關(guān)系我們知道，^3頭匏烯類頭匏菌素是無活性的。從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料可知該異構(gòu)體產(chǎn)生的途徑住友有三條：1）由起始原料引入，如頭匏氨芐，終產(chǎn)物中的△異構(gòu)體是由7-ADCA中殘留的^3異構(gòu)體引入；2）在保存過程中降解產(chǎn)生，如頭匏泊肟酯，頭匏呋辛酯等。3）在合成過程中引入，如頭匏毗肟，頭匏他啶；文獻(xiàn)顯示，在合成過程中引入△3異構(gòu)體時(shí)，受多種因素影響，如化合物結(jié)構(gòu)，反應(yīng)的路線、關(guān)鍵步驟使用的試劑種類、試劑加入順序、反應(yīng)的立體選擇性，以及反應(yīng)溫度等。例如在合成頭匏毗肟的過程中，母環(huán)引入N-甲基毗咯烷的反應(yīng)可以同時(shí)生成^3/^2異構(gòu)體，其中^3異構(gòu)體的含量與合成路線是先3位取代后7位酰化或先7位?；?位取代、以及反應(yīng)的具體工藝條件如反應(yīng)溶劑，反應(yīng)溫度等密切相關(guān)。在第三代和第四代頭匏菌素的結(jié)構(gòu)中，通常會(huì)有一個(gè)甲氧肟基,如頭匏噻肟、頭匏唑肟、頭匏甲肟、頭匏曲松、頭匏唑喃、頭匏他啶、頭匏克肟、頭匏匹羅、頭匏毗肟，頭匏唑蘭，以及單環(huán)類5-內(nèi)酰胺氨曲南等等，目的是提高藥物對(duì)5-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性。但甲氧肟基具有順-反異構(gòu)現(xiàn)象，且兩個(gè)異構(gòu)體間的活性差別非常大，如頭匏噻肟（順式結(jié)構(gòu)）抗菌活性要比反式結(jié)構(gòu)強(qiáng)40—100倍。甲氧肟基的順-反異構(gòu)反應(yīng)對(duì)紫外光非常敏感，如頭匏噻肟鈉水溶液（2X10-3M）,254nm紫外光照射45分鐘有50%降解，4小時(shí)后損失95%，感光降解產(chǎn)物主要是反式異構(gòu)體。中國藥典納入的頭匏曲松即采用將其水溶液在紫外線照射后產(chǎn)生反式異構(gòu)體進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。另外，反應(yīng)溫度、PH對(duì)順-反異構(gòu)體的比例也有顯著影響。因此，應(yīng)針對(duì)以上敏感因素進(jìn)行重點(diǎn)