D2定性定量檢測(cè)

D2受體定性定量檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)さ闹苽銹BS沖洗過(guò)的細(xì)胞懸液，3000g,4＞離心5分鐘。小心的棄去上層液，用30ml冰涼的緩沖液重新懸浮細(xì)胞。（緩沖液I：20mMHEPES緩沖液+10mMEDTA,PH=7.4）。細(xì)胞混勻20-30秒，然后39000g,4°C離心45min。離心后棄去上層清液，用30ml冰冷的緩沖液再懸浮。（緩沖液II：20mMHEPES緩沖液+0.1mMEDTA,PH=7.4）。細(xì)胞混勻20-30s，然后39000g，4°。離心45min。小心的棄去上層液，用5ml冰涼的緩沖液3重新懸浮細(xì)胞。（緩沖液III：20mMHEPES緩沖液+0.1mMEDTA+10%甘油,PH=7.4）。膜蛋白濃度使用Bradford法蛋白定量測(cè)定（考馬斯-）膜蛋白使用緩沖液III（20mMHEPES緩沖液+0.1mMEDTA+10%甘油,PH=7.4）稀釋到1mg/ml，均分到2ml管中，1ml/管。-80C儲(chǔ)存。Bradford法蛋白定量測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。二、試劑與器材1.試劑：①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白（bsa），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。②考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。2.器材：可見(jiàn)光分光光度計(jì)旋渦混合器試管16支三、操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)方法取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表中的第8、9、10管。加完試劑2-5分鐘后，即可開(kāi)始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2O加5.0mlg—250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。考馬斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1.0mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白質(zhì)（約1.0mg/ml）0.020.040.06蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考馬斯亮藍(lán)g-250試劑5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值（A595）（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。2.微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10—100mg/ml），可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml,,空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0mlH2O,考馬斯亮藍(lán)g—250試劑仍加5.0ml,同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。放射性配體結(jié)合試驗(yàn)材料和試劑人多巴胺D2受體膜、3H螺哌隆、氟哌啶醇、96孔平板Bindingbuffer:50mMHEPES,10mMMgSO4,5mMCaCl2pH7.4,at4°CWashbuffer:50mMHEPES,pH7.4,at4°C冷配基儲(chǔ)存液：2mM冷配基溶于乙醇中，儲(chǔ)存于-20°C5Xsolution（50uM）：330uL冷配基（飽和結(jié)合試驗(yàn)）5xsolution:5x10-11~5x10-4M,8個(gè)濃度梯度冷配基（抑制試驗(yàn)）熱配基3H螺哌隆放射性比度：16.2Ci/mmol、濃度：1.0mCi/mL、解離常數(shù)：0.08nM假定Kd=0.4nM,選擇10倍Kd（4nM）為反應(yīng)系統(tǒng)中熱配體的最大濃度。85ul5*的工作液裝滿四管（每管20ul，兩管為總結(jié)合，兩管為非特異性結(jié)合）。8個(gè)濃度梯度在用前兩倍稀釋備用。（飽和結(jié)合試驗(yàn)）通常在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中330ul的5*工作液裝滿16管（8個(gè)濃度梯度稀釋的冷配體兩份）（競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)）膜工作液D2/CHO-K1被制備并稀釋成0.05mg/ml因此20ul的工作液即含有1ug的膜蛋白。這一總量已由之前的膜蛋白定量試驗(yàn)確定，所以總結(jié)和濃度不能超過(guò)加到每管中的CPM的10%。飽和結(jié)合試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1concentrationofthehotligand,8totally總結(jié)合60uLbindingbuffer20uLmembraneworkingsolution20uLhotligandworkingsolutionof1concentration兩份非特異性結(jié)合40uLbindingbuffer20uLmembraneworkingsolution20uLcoldligandworkingsolution20uLhotligandworkingsolutionof1concentration兩份方法用聚乙烯亞胺溶液預(yù)處理微量培養(yǎng)板1、96孔板每個(gè)孔加入100ul0.5%的PEI(聚乙烯亞胺，溶于超純水)在4°C孵育30-60分鐘可使非標(biāo)減少。2、平板用millpore真空歧管8-15mmHg過(guò)濾，然后每孔用2ml清洗緩沖液(4-8C)清洗。結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)在96孔板混合反應(yīng)并在搖床上以500rpm的搖速在25C孵育一小時(shí)。過(guò)濾空管用透明的微孔板封口膜密封，反應(yīng)系統(tǒng)移到平板上，過(guò)濾后的配體受體結(jié)合物留在平板上。清洗每個(gè)管用3ml清洗Buffer清洗。底部封閉平板底部在用不透明的底部微孔板封口膜封閉前先用清潔的紙和通風(fēng)櫥十燥，每個(gè)管中加入20ul水溶性閃爍液，孔板用微孔板封口膜封閉，孔板用閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)1分鐘/管。結(jié)果分析用以下公式把CPM轉(zhuǎn)換成pmol/mgICPMpmol/mgprotein=2.22x10,2(dpm/Ci)*efficiency(CPM/DPM)*specificactivity(Ci/mmo1)*10'°(mol/pmol)*amountofmembranes(mg)數(shù)據(jù)在軟件上用非線性回歸(曲線擬合)的單位點(diǎn)結(jié)合(雙曲線)處理。程序給出包括Kd，Bmax等結(jié)果。AR2接近1被視為一個(gè)表明良好的非線性回歸的指示。飽和曲線的數(shù)據(jù)可以得到特異結(jié)合/總結(jié)合(TOT-NSB)/總結(jié)合的高比率。抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)冷配基的終濃度5x工作液配方10-5M5x10-4M+40uLbindingbuffer10-6M5X10-5M+20uLmembranesolution+20uLworkingsolutionofcoldligand+20uLhotligand10-7M5x10-6M10-8M5x10-7M10-9M5x10-8M10-10M5x10-9M10-11M5X10-10M10-12M5x10-11M用聚乙烯亞胺溶液預(yù)處理微量培養(yǎng)板1、96孔板每個(gè)孔加入100ul0.5%的PEI(聚乙烯亞胺，溶于超純水)在4°C孵育30-60分鐘可使非標(biāo)減少。2、平板用millpore真空歧管8-15mmHg過(guò)濾，然后每孔用2ml清洗緩沖液(4-8C)清洗。結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)在96孔板混合反應(yīng)并在搖床上以500rpm的搖速在25C孵育一小時(shí)。過(guò)濾空管用透明的微孔板封口膜密封，反應(yīng)系統(tǒng)移到平板上，過(guò)濾后的配體受體結(jié)合物留在平板上。清洗每個(gè)管用3ml清洗Buffer清洗。底部封閉平板底部在用不透明的底部微孔板封口膜封閉前先用清潔的紙和通風(fēng)櫥十燥，每個(gè)管中加入20ul水溶性閃爍液，孔板用微孔板封口膜封閉，孔板用閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)1分鐘/管。結(jié)果分析用以下公式把CPM轉(zhuǎn)換成pmol/mgICPMpmol/mgp