第四節(jié)胚胎干細胞培養(yǎng)與應用

細胞是機體組成的基本單位細胞細胞群組織機體小飛守角制作目前一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點1.干細胞的概念：是指動物（包括人）早期胚胎及某些器官中具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞。即未分化或未完全的種子細胞。干細胞（Stemcell）又叫起源細胞。2.干細胞作用：是重建、修復病損或衰老組織、器官功能的種子細胞。一、干細胞小飛守角制作目前二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點專能干細胞多能干細胞全能干細胞按分化潛能按發(fā)育狀態(tài)胚胎干細胞成體干細胞3、干細胞的分類小飛守角制作目前三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點專能干細胞：（multipotentstemcell）只能向一種或兩種密切相關的細胞類型分化。如上皮組織基底層的干細胞，肌肉中的成肌細胞。全能干細胞：（Totipotentstemcell）具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細胞（ES細胞）多能干細胞：（pluripotentstemcell）具有分化出多種組織細胞，但有失去發(fā)育為個體的潛能。如造血干細胞、神經(jīng)干細胞。小飛守角制作目前四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點成體干細胞

成年動物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復和再生的能力。成體干細胞在其中起著關鍵的作用。在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新的干細胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。小飛守角制作目前五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點造血干細胞是體內(nèi)各種血細胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血干細胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病的最有效方法。與骨髓移植和外周血干細胞移植相比，臍血干細胞移植的長處在于無來源的限制，對HLA配型要求不高，不易受病毒或腫瘤的污染。造血干細胞小飛守角制作目前六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點造血干細胞分化小飛守角制作目前七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點骨髓；外周血；臍帶血；胎兒造血系統(tǒng)；胚胎干細胞。造血干細胞的來源造血干細胞的移植：1、采集供體者的造血干細胞（骨髓、外周血、臍帶血），并與受體進行HLA配型；2、適度抑制受體免疫系統(tǒng)。小飛守角制作目前八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點成人細胞或臍血(骨髓和血)/胎兒組織(專能/多能)。人工流產(chǎn)后的人類胎兒生殖組織(全能)。通過體外授精產(chǎn)生的人類胚胎，治療不育癥的夫婦不再需要(全能)。用捐贈者的配子通過體外授精創(chuàng)造的人類胚胎(全能)。女性供卵要非常慎重。通過體細胞核轉(zhuǎn)移技術(克隆技術)產(chǎn)生的人類胚胎(全能)。以上都必須獲得當事人的知情同意。4、干細胞的來源小飛守角制作目前九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點1.概念：簡稱ES或EK細胞,是由早期胚胎或原始性腺中分離出來的未分化狀態(tài)的一類細胞.2.特點：（1）形態(tài):體積小、細胞核大、核仁明顯。（2）功能:具有發(fā)育的全能性，可分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。（3）在體外培養(yǎng)的條件下，ES細胞可以增殖而不發(fā)生分化。對它可以進行冷凍保存，也可以進行遺傳改造。二、胚胎干細胞小飛守角制作目前十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點3、來源：早期胚胎囊胚的內(nèi)細胞團小飛守角制作目前十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點特點：具有增殖能力并保持未分化狀態(tài)、在一定條件下可以向各種組織和器官分化、易于進行基因改造等。內(nèi)細胞團：內(nèi)細胞團（未分化的細胞）具有很強的分化能力，可以進一步分裂、分化，形成組織和器官，再逐步發(fā)育成個體。這些細胞被認為具有全能性，稱為胚胎干細胞。小飛守角制作目前十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點外胚層中胚層內(nèi)胚層滋養(yǎng)層內(nèi)細胞團囊胚(5-6d）移植和培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞（胚胎干細胞）小飛守角制作目前十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點胚胎干細胞培養(yǎng)小飛守角制作目前十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點4、胚胎干細胞的應用理論研究（人體發(fā)育過程、發(fā)育機制和影響因素、體外細胞分化的理想材料）研究新藥（細胞藥理和毒理實驗，藥物致病機理）醫(yī)療手段（提供無免疫排斥的材料，用于疾病治療）改良品種（結(jié)合基因工程培育生長快、抗病力強、高產(chǎn)的新品種）小飛守角制作目前十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點來源于干細胞的組織可能用于治療的疾病

細胞類型 治療的疾病神經(jīng)細胞

中風、帕金森氏病、老年癡呆癥、脊髓損傷、多發(fā)性硬化病 心肌細胞

心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細胞糖尿病軟骨細胞 骨性關節(jié)炎血細胞 癌癥、免疫缺乏癥、遺傳學血液病、白血病肝細胞 肝炎、肝硬化皮膚細胞 燒傷骨細胞 骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細胞 黃斑癥骨骼肌細胞 肌肉萎縮癥小飛守角制作目前十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點三、胚胎干細胞研究面臨的挑戰(zhàn)1、安全性問題（1）胚胎干細胞的研究給法律、倫理、國家安全等方面帶來沖擊。①受精卵是生物發(fā)育的起點，胚胎是生命開始階段，以窒息一個生命的代價去挽救另一個生命是否值得。

②可能導致克隆人的出現(xiàn)（2）觀點：不應該反對以治療為目的的胚胎干細胞研究，而反對生殖性克隆。小飛守角制作目前十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點胚胎干細胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化仍需進一步研究。分化細胞的增殖是一個瓶頸問題，如何得到純化的分化細胞有很多工作要做。對胚胎干細胞向不同組織細胞的“定向分化”的條件尚不清楚，限制了其臨床應用。2、其他技術方面的問題小飛守角制作目前十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點建立并完善維持體外增殖與定向分化的體系。研究轉(zhuǎn)基因或核移植胚胎干細胞的增殖與分化及其調(diào)控機制。誘導分化細胞的性能分析與鑒定。體外重構重要的組織與器官，探索克服移植排斥反應等的技術和方法。對于胚胎干細胞在組織原位再生修復中的作用機制與原位培養(yǎng)模式的探索。3、未來干細胞研究領域小飛守角制作目前十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點胚胎干細胞的培養(yǎng)小飛守角制作目前二十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點胚胎干細胞研究面臨的問題及解決辦法

l用于干細胞研究的胚胎來源困難;

l如何保持胚胎干細胞的全能性，并控制向特別類型細胞轉(zhuǎn)化？

l如何分離、純化干細胞？

l分化后的細胞是否有致瘤性？

l干細胞在體外發(fā)育成完整的器官尚難以做到;

l分化細胞移植仍有可能發(fā)生免疫排斥;

l倫理問題

小飛守角制作目前二十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點應用前景：治療性克隆面臨難題：技術尚需突破社會倫理問題小飛守角制作目前二十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點觀點理由1.不符合倫理道德(1)把試管嬰兒當作人體零配件工廠,是對生命的不尊敬;(2)早期的生命也有活下去的權利,拋棄或殺死多余的胚胎,無異于”謀殺”;(3)有人會濫用設計試管嬰兒技術,而設計嬰兒性別;2.符合倫理道德(1)設計試管嬰兒是為了救人,是救治患者的最好,最快捷的辦法之一;(2)提供骨髓中造血干細胞并不會對試管嬰兒造成損傷;(3)臍帶血乃試管嬰兒的”身外之物”.3.中國政府的觀點中國衛(wèi)生部在《體外受精----胚胎移植及其衍生技術規(guī)范》中規(guī)定,”實施體外受精----胚胎移植及其衍生技術必須獲得衛(wèi)生部批準證書”.小飛守角制作目前二十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點一、掌握核心術語——(記準、寫準、理解透，把握內(nèi)涵和外延)胚胎工程解題策略1.胚胎工程（胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)技術）。2.胚胎發(fā)育［受精卵、卵裂、桑椹胚、囊胚（內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)層細胞）、原腸胚］。3.同期發(fā)情、超數(shù)排卵、沖卵。4.轉(zhuǎn)基因生物、生殖性克隆、治療性克隆、生物武器。小飛守角制作目前二十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點二、能概述精子、卵子發(fā)生過程和胚胎發(fā)育文字流程圖，并思考以下問題。小飛守角制作目前二十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點小飛守角制作目前二十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點1．要注意區(qū)分受精的標志和受精過程結(jié)束的標志。受精的標志是卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體，受精過程結(jié)束的標志是雌、雄原核融合成合子。二、受精作用相關知識辨析2．要辨別三大反應：頂體反應、透明帶反應、卵黃膜封閉作用。（1）發(fā)生的時間不同：頂體反應是發(fā)生在精子與卵子相遇時；透明帶反應是發(fā)生在精子觸及卵黃膜的瞬間；卵黃膜的封閉作用是發(fā)生在精子入卵后。（2）生理作用不同：頂體反應是要形成精子穿越放射冠的通路；透明帶反應是防止多精子入卵受精的第一道屏障；卵黃膜封閉作用則是防止多精子入卵受精的第二道屏障。小飛守角制作目前二十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點3．受精的準備和受精過程要熟悉（1）受精的準備：精子的成熟和獲能；卵細胞必須是減數(shù)第二次分裂中期。（2）受精過程——四步曲

第一步：精子穿越放射冠和透明帶。頂體反應使頂體內(nèi)的酶釋放出來并溶解放射冠內(nèi)的卵丘細胞之間的物質(zhì)，透明帶反應是防止多精入卵受精的第一道屏障。

第二步：精子進入卵黃膜。卵黃膜封閉作用是防止多精入卵受精的第二道屏障。

第三步：原核形成。雄原核形成和雌原核形成。

第四步：合子形成。雌雄原核融合形成合子(受精卵)。小飛守角制作目前二十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點4．動物排出卵子的成熟程度不同，有的可能是次級卵母細胞，如豬、羊等；有的可能是初級卵母細胞，如馬、犬等，但它們都要在輸卵管內(nèi)進一步成熟，當達到減數(shù)第二次分裂的中期時，才具有與精子受精的能力。5．胚胎早期培養(yǎng)過程中有兩次用到了顯微鏡進行檢查：①在進行卵母細胞成熟培養(yǎng)前，要抽取卵母細胞在顯微鏡下檢查并挑選；②胚胎培養(yǎng)前要用顯微鏡檢查受精卵。小飛守角制作目前二十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點（1）受精的標志和受精完成的標志分別是什么？（2）卵裂期、桑椹胚和囊胚中細胞各具有什么特點？①卵裂期的特點：細胞有絲分裂使細胞數(shù)目增加，但胚胎總體積并不增加或略縮小，因此每個細胞的體積會隨分裂的進行不斷縮小，但核內(nèi)遺傳物質(zhì)并未減少。②桑椹胚以前的細胞均未分化，細胞全能性最高，是胚胎分割的最佳時期。受精的標志是卵黃膜和透明帶的間隙出現(xiàn)兩個極體；受精完成標志是雌雄原核融合為合子。小飛守角制作目前三十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點（3）體外受精的操作步驟是什么？答案培養(yǎng)液成分鹽類：無機鹽和有機鹽營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、核苷酸調(diào)節(jié)物質(zhì)：維生素、激素特有物質(zhì)：動物血清③桑椹胚至囊胚的發(fā)育過程中，細胞開始分化，是胚胎移植的最佳時期。但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。其中個體較大的細胞叫內(nèi)細胞團，將來發(fā)育成胎兒的各種組織；而滋養(yǎng)層細胞將來發(fā)育成胎膜和胎盤。①卵母細胞的采集和培養(yǎng)。②精子的采集和獲能。③受精。（4）體外胚胎培養(yǎng)液的成分有什么？小飛守角制作目前三十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點三、胚胎移植1、胚胎移植成功與否的兩個重要條件（1）同種動物之間進行胚胎移植易于成功。這里的“同種”是指“同物種”。（2）供、受體生理狀態(tài)要相同，為此必須做到：①供、受體母畜的發(fā)情時間一致。②移入受體子宮胚胎的位置應該與其在供體內(nèi)的位置相同或相似。2、胚胎移植時間：不同動物其胚胎移植的時間不同。牛、羊要培養(yǎng)到桑椹胚或囊胚階段；小鼠、家兔在桑椹胚前；人胚胎可在4個細胞階段移植；幾乎所有動物不能到原腸胚階段移植，因為此時分化程度高，移植成功率很低。小飛守角制作目前三十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點3．胚胎移植的培育流程以牛胚胎移植為例：(1)選擇的對象包括良種公牛、母牛和普通母牛，處理是指對良種母牛和普通母牛做同期發(fā)情處理，以使其生殖器官的生理變化相同；同時要對良種母牛做超數(shù)排卵處理，以促其多產(chǎn)生卵子。(2)沖卵是指將早期胚胎從良種母牛子宮內(nèi)沖洗出來，而不是沖洗出卵子。(3)良種牛后代的遺傳特性是由供體公牛和母牛決定的，受體母牛只是提供了胚胎發(fā)育的場所，不影響后代的遺傳特性。(4)胚胎移植培育流程中有兩次使用促性腺激素，第一次是對供、受體進行同期發(fā)情處理；第二次用于供體的超數(shù)排卵。小飛守角制作目前三十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點3．胚胎移植成功的保障(生理學基礎)第一，供、受體生殖器官的生理變化是相同的。第二，哺乳動物的早期胚胎形成后，在一定時間內(nèi)不會與母體子宮建立組織上的聯(lián)系，而是處于游離狀態(tài)，這就為胚胎的收集提供了可能。第三，受體對移入子宮的外來胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應，這為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能。第四，供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯(lián)系，但移入受體的供體胚胎的遺傳特性，在孕育過程中不受任何影響。小飛守角制作目前三十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點

b.原理：細胞核的全能性。c.應用：①快速繁育良種、特異、瀕危的動物，改良動物新品種。②利用植物組織培養(yǎng)技術育種。③利用人工種子繁殖物種。④植物體細胞雜交育種。（1）無性繁殖①利用細胞核移植技術育種a.過程育種應用小飛守角制作目前三十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點⑤核移植和植物體細胞雜交產(chǎn)生的后代中都含有兩個親本的遺傳物質(zhì)；植物組織培養(yǎng)和人工種子產(chǎn)生的后代中都只含有一個親本的遺傳物質(zhì)。（2）有性繁殖①利用胚胎（分割）移植育種a.過程小飛守角制作目前三十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點b.原理：細胞（受精卵）的全能性。c.應用：解決動物和人類的不育問題；提高良種家畜的繁殖能力。②單倍體育種技術小飛守角制作目前三十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點四、試管嬰兒與克隆技術

克隆人過程圖：會默畫出試管嬰兒和克隆人的過程圖，思考以下問題。試管嬰兒過程圖：小飛守角制作目前三十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點試管嬰兒克隆人技術基礎體外受精、胚胎移植核移植技術、胚胎移植生殖方式有性生殖無性生殖遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)來自兩個個體遺傳物質(zhì)主要來自核供體（1）上述兩過程的技術基礎、生殖方式、遺傳物質(zhì)方面有什么區(qū)別？小飛守角制作目前三十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點（2）治療性克隆與生殖性克隆有什么區(qū)別與聯(lián)系？類型項目治療性克隆生殖性克隆區(qū)別目的治療人類疾病用于生育，產(chǎn)生新個體水平細胞水平個體水平聯(lián)系

都屬無性繁殖；產(chǎn)生新個體、新組織，遺傳信息相同

小飛守角制作目前四十頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點鞏固提升1.下列有關動物胚胎移植的敘述中，錯誤的是（）A.受孕母畜體內(nèi)的受精卵或胚胎均能移植B.受體母畜必須處于與供體母畜同步發(fā)情的狀態(tài)C.超數(shù)排卵技術要使用一定的激素D.試管嬰兒只是受精及早期卵裂過程在試管中進行A2.對于優(yōu)良種畜的胚胎移植的說法不正確的是()A.供體母牛必須是同一物種的良種B.受體母牛必須是同一物種的良種C.供體公牛必須是同一物種的良種D.受體母牛可以是同一物種的一般健康牛B小飛守角制作目前四十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點3.供體的胚胎移植到受體后，游離的胚胎在發(fā)育過程中形成胎盤與受體相連，并通過胎盤與受體的血液進行物質(zhì)交換。以下說法正確的是()A.受體是為供體胚胎提供發(fā)育的條件B.受體與胚胎血型應相同，否則會發(fā)生免疫排斥C.受體與胚胎血液混融在一起D.胚胎心肺功能都能正常運行A4.在胚胎移植中供體的主要職能（）A.提供優(yōu)良的供體基因B.提供優(yōu)良遺傳特性的胚胎C.提供卵細胞D.提供精子B小飛守角制作目前四十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點5、下列關于滋養(yǎng)層細胞的敘述，不正確的是（）A.囊胚滋養(yǎng)層細胞將來發(fā)育成胎盤和胎膜B.可以用滋養(yǎng)層細胞做DNA分析性別鑒定C.囊胚滋養(yǎng)層細胞就是將來原腸胚的外胚層D.滋養(yǎng)層細胞沿透明帶內(nèi)壁擴展和排列C6、采集的卵母細胞，在體外經(jīng)人工培養(yǎng)成熟后，才能與獲能的精子受精，以下原因不正確的是（ ）A.卵子從輸卵管中沖出也要經(jīng)歷類似精子獲能的過程B.動物排出的卵子成熟程度不同C.體外人工培養(yǎng)至減數(shù)分裂第二次分裂中期時，才算成熟D.沖出的卵子還需要培養(yǎng)一段時間由小變大D小飛守角制作目前四十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點9、利用胚胎干細胞治療肝衰竭，實現(xiàn)此過程的最重要原因是（）

A.細胞分裂B.細胞特化C.細胞分化D.細胞增殖10、“試管嬰兒”技術屬于()A.胚胎移植B.組織培養(yǎng)C.克隆技術D.基因工程A11.下列各項中與“試管嬰兒”的培育有關的是 （ ）①體外受精②體內(nèi)受精③主要在體外發(fā)育④主要在體內(nèi)發(fā)育⑤運用基因工程技術⑥運用胚胎工程技術A.①③⑥ B.②③⑥ C.①④⑥ D.①④⑤CC小飛守角制作目前四十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點

（1）圖中a、b、c過程分別是指

、

、

。（2）供體母牛的主要職能是

；受體母牛必須具備

。超數(shù)排卵沖卵胚胎移植只產(chǎn)生具有優(yōu)良遺傳特性的胚胎健康的體質(zhì)和健康的繁殖能力12、（09·深圳3月）牛胚胎移植的基本程序如圖所示，請據(jù)圖回答：小飛守角制作目前四十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點（3）為了提高牛胚胎的利用率，常采取的方法是

；處理的時期是

；理由是

。（4）從哺乳動物早期胚胎或原始性腺中分離出來的細胞，稱為ES或EK細胞。這類細胞的形態(tài)特征有

。（5）你認為胚胎移植技術在生產(chǎn)實踐中的主要意義有哪些？

。胚胎分割移植桑椹胚或囊胚期此時還未出現(xiàn)細胞分化或分化程度低體積小、細胞核大、核仁明顯胚胎移植技術可以加快優(yōu)良種畜的繁殖速度，迅速推廣新品種關鍵信息“供體母?！?、“受體”、“提高牛胚胎利用率”小飛守角制作目前四十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點13.（09·南通期末調(diào)研）下圖是培育能產(chǎn)生凝血因子牛的過程示意圖，試回答相關問題：（1）為能從良種母牛體內(nèi)一次取得多枚卵子，可以采用

的方法。據(jù)報道，這種技術已經(jīng)被濫用于人類生育中，從而出現(xiàn)許多人工“多胞胎”，這種技術帶來的危害之一是

。注射促性腺激素影響胎兒的健康發(fā)育、對孕婦的身體不利等小飛守角制作目前四十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點（2）在過程③中，當一個精子進入卵細胞后會激發(fā)卵子發(fā)生反應，如透明帶反應等，其意義是

。（3）過程④中為保證人凝血因子基因能夠在受精卵中穩(wěn)定存在并表達，需要先將該基因與

結(jié)合，檢驗人凝血因子基因是否導入受精卵的方法是

。（4）過程⑥涉及的技術是

，為保證該過程的成功，一般應選擇

相同的同種母畜。防止多精入卵載體運用目的基因探針進行檢驗（DNA分子雜交技術）`胚胎移植生理狀態(tài)小飛守角制作目前四十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十七點14.（09·海南4月模擬）克隆羊“多利”的問世引