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文檔簡介
手性藥品當(dāng)代分析方法與技術(shù)
盛彧欣手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第1頁什么是手性藥品(chiraldrugs)
藥品分子結(jié)構(gòu)中存在手性原因,而且由含有藥理活性手性化合物組成藥品,其中只含有效對映體或者以有效對映體為主。藥品藥理作用是經(jīng)過與體內(nèi)大分子之間嚴(yán)格手性識別和匹配而實現(xiàn)。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第2頁手性藥品藥效學(xué)兩種對映體含有相同或相近藥理活性異丙嗪:抗組胺;普羅帕酮:抗心律失常。一個對映體含有藥理活性,另一個活性弱或無活性
這類藥品只有一個對映體與受體有較強(qiáng)親和力,呈活性;另一個作用弱或無活性,為劣映體,這種劣映體相當(dāng)于雜質(zhì)。主要包含:非甾體抗炎藥品α-芳基丙酸類化合物,如萘普生、布洛芬等。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第3頁兩種對映體藥理活性相同,但反應(yīng)強(qiáng)度不一樣代表藥品:抗癌藥環(huán)磷酰胺,S-對映體活性是R-對映體2倍。
兩種對映體含有不一樣藥理活性
這類藥品經(jīng)過作用于不一樣靶器官、組織而展現(xiàn)不一樣作用模式。代表藥品:索他洛爾,S-對映體——β阻斷作用
R-對映體——抗心律失常作用手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第4頁兩種對映體作用相反這類藥品對映體與受體都有一定親和力,但通常只有一個對映體含有活性,另一對映體反而起拮抗劑作用。如:異丙腎上腺素(β1-受體激動劑)
R-(-)-:受體激動作用
S-(+)-:受體拮抗作用一個對映體含有藥理活性,另一個含有毒性作用氯胺酮為中樞性麻醉藥品,只有(S)-(+)-對映體才含有麻醉作用,而(R)-(-)-對映體則產(chǎn)生中樞興奮作用。鎮(zhèn)靜藥沙度利胺(反應(yīng)停),(R)-對映體有鎮(zhèn)靜作用,(S)-對映體及其代謝產(chǎn)物有嚴(yán)重胚胎毒性和致畸作用。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第5頁對映體作用互補(bǔ)性
如:多巴酚丁胺左旋體含有α-受體激動劑作用,對β-受體作用弱,而右旋體為β-受體激動劑,而對α-受體作用弱,所以外消旋體給藥能增加心肌收縮力,但不增加心率和血壓。不一樣作用靶點表現(xiàn)不一樣特征藥品作用于不一樣組織(靶點、受體)展現(xiàn)不一樣特征,這類藥品往往是多功效,作用是多方面。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第6頁手性藥品藥代動力學(xué)吸收被動吸收:手性原因無影響。主動轉(zhuǎn)運和易化擴(kuò)散:可能發(fā)生對映體間競爭性相互作用和吸收改變分布
手性藥品對映體競爭性與血漿蛋白、酶或受體結(jié)合,都可引發(fā)對映體間相互作用及其在分布上改變。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第7頁代謝相互抑制作用:對映體競爭同一代謝酶,會發(fā)生對映體間相互抑制。單向抑制作用:假如一個對映體是另一個對映體代謝抑制劑,則會發(fā)生單向抑制作用。排泄
腎臟排泄立體選擇性主要表現(xiàn)在腎小管分泌、主動轉(zhuǎn)運和腎代謝過程,造成對映體間發(fā)生相互作用。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第8頁
伴隨對手性藥品藥理活性研究不停深入,人們已經(jīng)認(rèn)識并開始重視手性藥品對映體生理作用和代謝過程差異。尤其是1992年美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)提出發(fā)展單一對映體生產(chǎn)計劃和對映體藥品純度判定要求后,怎樣能快速而準(zhǔn)確分離和測定手性藥品已成為醫(yī)藥界關(guān)注重大課題。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第9頁手性藥品拆分方法
利用物理性質(zhì)——溶解度、吸附力等差異,如:結(jié)晶法、色譜法等;利用反應(yīng)速度差異動力學(xué)拆分法;利用酶高度特異性催化反應(yīng)酶拆分法色譜技術(shù)是當(dāng)前手性藥品分離主要方法手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第10頁手性藥品分離慣用色譜技術(shù)高效液相色譜(HPLC)氣相色譜(GC)高效毛細(xì)管電泳(HPCE)超臨界流體色譜(SFC)手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第11頁手性液相色譜法(HPLC)間接法:手性衍生化試劑法(CDR)
首先將對映體經(jīng)手性試劑衍生,生成非對映異構(gòu)體后,利用常規(guī)HPLC方法分離測定。適于以下情況拆分:
不宜直接拆分化合物。添加一些基團(tuán),增加色譜系統(tǒng)選擇性。如:手性脂肪胺類提升紫外或熒光檢測效果。如:采取NBD-(L)-APY熒光試劑柱前衍生化測定布洛芬對映體,提升了檢測靈敏度手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第12頁優(yōu)點:*可采取通用非手性柱分離;*經(jīng)過衍生化可提升檢測靈敏度;*分離條件簡單;*分離效果好。缺點:*要有可被衍生化基團(tuán);*要有高光學(xué)純度手性試劑;*兩個對映體衍生化速率和平衡常數(shù)應(yīng)一致;*衍生化和色譜過程中不能發(fā)生消旋化。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第13頁
對衍生化反應(yīng)要求手性衍生化試劑含有高化學(xué)和光學(xué)純度,且在貯存中不發(fā)生改變手性衍生化試劑和反應(yīng)產(chǎn)物含有高穩(wěn)定性衍生化反應(yīng)過程中產(chǎn)物不發(fā)生消旋化現(xiàn)象待測手性藥品含有易于衍生集團(tuán),如氨基、羥基、羧基等反應(yīng)條件溫和、快速、簡便衍生化反應(yīng)生成非對映體在色譜分離時應(yīng)能顯示高柱效手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第14頁慣用手性衍生化試劑
手性羧酸類
包含:酰氯、磺酰氯、酸酐和氯甲酸酯類。主要用于衍生手性醇、胺和氨基酸。可與化合物直接縮合,或與樣品反應(yīng)后,合成更有利于拆分與檢測衍生物。手性胺類
主要用于羧酸、N-保護(hù)氨基酸、醇類等藥品手性拆分。慣用試劑有:苯(萘、蒽)乙胺、二甲氨基萘乙胺、對硝基苯乙胺等。
異(硫)氰酸酯類
易于與大多數(shù)醇類及胺類化合物反應(yīng)而被分離。
光學(xué)活性氨基酸類
廣泛用于胺、羧酸及醇類藥品,尤其是氨基酸類,其衍生化法基于肽合成原理。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第15頁直接法
在分子間引入手性環(huán)境,即采取手性固定相或手性流動相不經(jīng)柱前衍生化直接分離藥品對映體1.手性固定相法(CSP)
連接在固定相上手性識別劑,與藥品對映體反應(yīng)形成非對映體復(fù)合物,然后作分離測定。分離程度和洗脫次序取決于復(fù)合物相對強(qiáng)度。2.手性流動相法(CMP)
向流動相中加入一手性試劑,它與溶質(zhì)常以氫鍵、離子鍵或金屬離子配位鍵生成非對映體締合物,從而以常規(guī)HPLC固定相分離。3.手性檢測器法(CD)手性液相色譜法(HPLC)手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第16頁優(yōu)點★能廣泛適合用于各類化合物,適于常規(guī)及生物樣品分析測定;★除非必須衍生化,不然無需高光學(xué)純度試劑;★樣品處理步驟簡單?!镏苽浞蛛x方便,定量分析可靠性較高;缺點★樣品有時也須作柱前衍生(但不一定是手性衍生化試劑),★對樣品結(jié)構(gòu)有一定限制,其適用性尚不及普通HPLC固定相(包含正相和反相)那樣廣泛?!锲駷橹?,CSP柱商品已經(jīng)有40各種,價格大多昂貴,還未有一個含有類似ODS柱普遍適用性。手性固定相法手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第17頁手性固定相類型:
刷型手性固定相手性聚合物固定相環(huán)糊精手性固定相大環(huán)抗生素手性固定相蛋白質(zhì)手性固定相手性配體交換固定相冠醚手性固定相手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第18頁刷型手性固定相:
由一個光學(xué)純R或S手性異構(gòu)體與擔(dān)體以共價結(jié)合而成。手性藥品對映體與該手性固定相形成暫時性非對映體復(fù)合物,主要包含π-π作用、氫鍵作用和范德華力作用。大多使用非極性流動相,適合用于正相色譜分析。可拆分帶有烷基、醚基或氨基取代π-給電子芳香化合物對映體,并能用于制備分離。優(yōu)點:輕易制備,拆分選擇性好,柱載量高,已經(jīng)有各種商品化柱缺點:只適合用于含有芳香基團(tuán)手性化合物分離。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第19頁
手性聚合物固定相
包含纖維素衍生物型、合成聚合物型,主要經(jīng)過吸引和包合作用實現(xiàn)對映異構(gòu)體拆分。可分離烴、酯、醇、酸、酮、酰胺及含磷和硫化合物等。流動相:烷烴-醇混合體系(正己烷-異丙醇)手性聚合物固定相商品主要是日本Daicell企業(yè)制造chiralcel柱。其中chiralcelOD和chiralcelAD柱幾乎能夠滿足常見85%手性化合物拆分,應(yīng)用廣泛。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第20頁手性聚合物固定相Chiralcel柱類型與應(yīng)用手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第21頁環(huán)糊精手性固定相:
α
-、β-和γ-環(huán)糊精(CD)是分別由6~8個葡萄糖單位經(jīng)過α
-(1,4)連接組成環(huán)狀低聚糖。CD-CSP經(jīng)過共價鍵將CD鍵合到硅膠上,形成對水穩(wěn)定鍵合相。
α
-
CD
:適合較小如含單苯基藥品對映體分析γ-
CD
:適合用于較大分子藥品分離,如甾體藥品或含有稠環(huán)藥品。β-
CD
:應(yīng)用最廣。對含有苯環(huán)、雙環(huán)和多取代苯環(huán)手性藥品能夠?qū)崿F(xiàn)良好拆分。如巴比妥類藥品和麻黃堿等流動相:含水反相系統(tǒng)和非水有機(jī)系統(tǒng)均可影響分離原因:溫度、pH、離子強(qiáng)度、流速手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第22頁
大環(huán)抗生素手性固定相
將包含多個手性中心大環(huán)抗生素固定到硅膠上形成了一類用于對映體拆分分析新型手性固定相。用于手性固定相制備大環(huán)抗生素有:萬古霉素、替考拉寧、利福霉素和利托菌素A
。
手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第23頁蛋白質(zhì)手性固定相:
以離子鍵(或共價鍵)和蛋白交聯(lián)作用將蛋白質(zhì)固定于硅膠上,利用蛋白質(zhì)分子與手性化合物分子間立體選擇性作用,進(jìn)行藥品對映體分離,其機(jī)理普通有氫鍵、靜電作用、疏水作用、離子對和離子交換等作用。人α-酸性糖蛋白(α-AGP):各種類型藥品人血清白蛋白(HSA):各種類型藥品牛血清白蛋白(BSA):適于陰離子型手性化合物,如氨基酸及其衍生物、芳香亞砜和香豆素類等卵黏蛋白(OVM):用于胺類和羧酸化合物手性拆分纖維素二糖水解酶(CBH):適于分離各種類型堿性藥品。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第24頁手性配體交換固定相
經(jīng)過手性金屬配合物與對映異構(gòu)體作用形成非對映異構(gòu)體金屬配合物而進(jìn)行手性拆分。主要用于α-氨基酸及其類似藥品手性拆分。用于形成金屬配合物離子均為過渡金屬離子Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Hg(Ⅱ)。商品配體交換柱有ChiralpakWH和WM等。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第25頁冠醚手性固定相:
主要用于一些含有能夠質(zhì)子化伯胺官能團(tuán)手性化合物分離,尤其是氨基酸及其衍生物對映體拆分。慣用冠醚是“18-冠-6”。普通使用酸性(如高氯酸)流動相。商品柱為日本Daicel企業(yè)CrownpakCR(+)或CR(-)柱。兩柱手性拆分出峰次序相反,能夠滿足對映體純度分析時不一樣要求。冠醚類化合物有劇毒,有致癌性,試驗時必須尤其注意。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第26頁優(yōu)點:使用常規(guī)色譜柱;無需手性試劑衍生;手性添加劑選擇范圍寬;可在柱后搜集到純異構(gòu)體缺點:手性添加劑消耗大;手性流動相添加法拆分方法建立較困難;系統(tǒng)平衡時間長;拆分制備時需分離手性添加劑手性流動相法手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第27頁慣用手性添加劑:
手性離子對試劑
在HPLC流動相中加入反離子,使之與流動相中對映體生成非對映離子對復(fù)合物,因為這些離子對復(fù)合物含有不一樣穩(wěn)定性和分配性質(zhì),在與固定相發(fā)生靜電、疏水或氫鍵作用后,產(chǎn)生差速遷移而得以分離??捎糜诓鸱职被犷?、β-受體阻斷劑、羧酸及磺酸類等化合物手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第28頁手性配體交換試劑
將手性金屬配體交換劑加入HPLC流動相中,形成三元非對映體配合物,此配合物與固定相發(fā)生立體選擇性吸引或排斥反應(yīng),因為其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和能量差異,使對映體得以分離。慣用手性配體交換劑為氨基酸及其衍生物與金屬離子(Cu、Zn、Ni、Cd等)配合物??捎糜诓鸱职被峒捌溲苌铩ⅵ?受體阻斷劑等手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第29頁
手性親和試劑
含有天然手性性質(zhì)蛋白質(zhì)和膽酸鹽可用作HPLC手性流動相法拆分對映體添加劑??山?jīng)過疏水性、靜電、氫鍵和電荷轉(zhuǎn)移等形成類非對映異構(gòu)體而進(jìn)行拆分。可拆分氨基酸、羧酸、胺類、巴比妥及β-受體阻斷劑等。蛋白質(zhì)手性添加劑還可用于藥品-蛋白結(jié)合率測定。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第30頁手性包合試劑
包含環(huán)糊精、環(huán)糊精衍生物和冠醚。主要利用包合作用在極性流動相中與對映體作用實現(xiàn)拆分。已用于分離氨基酸及其衍生物、巴比妥類、氯胺酮、苯妥英代謝物、美芬妥英及其代謝物、偽麻黃堿、去甲羥基安定、哌嗪類鎮(zhèn)痛藥等。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第31頁手性氫鍵作用試劑
藥品對映體經(jīng)過與這類手性多羰基化合物分子間氫鍵作用形成非對映異構(gòu)體而被拆分。(N-乙?;?L-纈氨酸-四丁酰胺)拆分氨基酸及其衍生物和巴比妥類藥品普通使用低級性流動相手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第32頁3.
手性檢測器法(CD)
與紫外或示差折光檢測器聯(lián)用,將所用檢測器前后再串聯(lián)一個旋光檢測器即可,使用雙通道色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)可同時得到兩個檢測器結(jié)果,經(jīng)過計算機(jī)將兩個對映體濃度直接計算出來。適合用于各類化合物,專屬性好,無須與吸收波長相匹配,不須經(jīng)手性分離,在手性藥品測定上含有很大應(yīng)用前景。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第33頁手性氣相色譜法(GC)
間接法(CDR)先經(jīng)過共價結(jié)合作用,在對映體分子中引入另一個手性中心,形成非對映異構(gòu)體后,再用常規(guī)GC方法拆分。對衍生化試劑要求試劑含有高化學(xué)和光學(xué)純度試劑與對映體反應(yīng)必須快速而且定量完成生成非對映體衍生物必須含有一定揮發(fā)性,以適合用于GC分析形成非對映異構(gòu)體混合物須有足夠大色譜行為差異形成非對映體衍生物須含有化學(xué)和立體化學(xué)穩(wěn)定性手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第34頁慣用手性衍生化試劑
酰氯類
可拆分醇類、胺類薄荷醇酯和脲類可拆分醇類、酯類、胺類
異(硫)氰酸酯類
可拆分醇、酸類、糖醇類和其它
可拆分酸類、內(nèi)酯類、樟腦、糖手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第35頁直接法(手性固定相法CSP
)
經(jīng)過使用一個含有光學(xué)活性環(huán)境,即手性固定相,來提供拆分所需要手性中心。手性固定相類型:
基于氫鍵作用手性固定相,主要是氨基酸衍生物固定相基于配位作用手性固定相基于包合作用手性固定相,主要是各種環(huán)糊精衍生物手性固定相特點:
含有手性識別立體結(jié)構(gòu),即最少含有一個手性中心含有低熔點和高沸點,方便在較寬溫度范圍內(nèi)使用含有良好可涂布性能,方便于GC柱制備手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第36頁基于氫鍵作用手性固定相:
主要為手性氨基酸衍生物和手性羧酸酯或酰胺聚合物。這類固定相中含有酰胺基或羧酸酯基,能夠與手性藥品分子中活潑基團(tuán)經(jīng)過氫鍵作用締合,形成非對映異構(gòu)體締合物。因為立體原因和氫鍵作用不一樣,所形成非對映異構(gòu)體締合物穩(wěn)定性也不一樣,造成對映體經(jīng)過色譜柱所需時間不一樣,從而實現(xiàn)對映體分離。對氨基酸、氨基醇對映體含有很好拆分性能。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第37頁基于包合作用手性固定相:
主要為環(huán)糊精衍生物,能夠用于各種類型易揮發(fā)性手性化合物拆分分析,是手性氣相色譜首選固定相。鍵合環(huán)糊精手性柱商品有:Chirasil-Dex系列、Chirasil-Dex-TFA系列。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第38頁基于配位作用手性固定相:
是由過渡金屬離子和手性有機(jī)配體組成手性金屬配合物。手性金屬配合物固定相普通是一價或二價金屬離子配合物。金屬離子有銠(Rh)、銪(Eu)、鎳(Ni)、錳(Mn)、鈷(Co)、銅(Cu)和鋅(Zn)等。手性配體主要是一些衍生萜烯酮,如樟腦酸、薄荷酸和香芹酮等。手性金屬配合物固定相普通要求被分析物含有π電子或孤對電子,分離機(jī)制主要是基于π電子相互作用,偶極相互作用也存在。拆分對象主要為低沸點手性化合物,包含烯、醇、醚、酮、酯以及昆蟲信息素、香精油等。
注:不能使用氫氣做載氣。氫氣還原性會破壞手性金屬配合物。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第39頁高效毛細(xì)管電泳(HPCE)HPCE:
是以高壓電場為驅(qū)動力,毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和/或分配系數(shù)不一樣而實現(xiàn)分離優(yōu)點:手性選擇劑主要為直接加入,操作簡單;手性選擇劑消耗少,運行成本低;分離效率高;分離模式多樣。分離模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)
毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)毛細(xì)管等速電泳(CITP)毛細(xì)管膠束電動色譜(MEKC)毛細(xì)管電色譜(CEC)手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第40頁毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)
基于緩沖液中溶質(zhì)各自電泳遷移速率不一樣而進(jìn)行分離
經(jīng)過向背景電解質(zhì)中添加手性選擇劑方法實現(xiàn)離子型手性化合物拆分分離。應(yīng)用最廣泛。經(jīng)過改變運行電解質(zhì)溶液中手性選擇劑類型和濃度,能夠進(jìn)行分離最優(yōu)化。慣用手性選擇劑:
CD及其衍生物冠醚手性金屬配合物大環(huán)抗生素蛋白質(zhì)和糖類手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第41頁毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)
使用添加了手性選擇劑凝膠為分離介質(zhì),基于被測組分質(zhì)荷比和分子體積不一樣而進(jìn)行分離。慣用手性選擇劑:
CD及其衍生物蛋白質(zhì)類手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第42頁毛細(xì)管等速電泳(CITP)是一個不連續(xù)介質(zhì)毛細(xì)管電泳技術(shù),其基本原理是在毛細(xì)管電泳中到達(dá)平衡后,各區(qū)帶相隨,分成清楚界面以等速移動并完成份離。在CITP中,要使用兩種緩沖液系統(tǒng),其中一個為前導(dǎo)電解質(zhì),充滿整個毛細(xì)管柱,另一個為尾隨電解質(zhì),就是將手性選擇劑作為前導(dǎo)電解質(zhì)加入物,加入到緩沖液系統(tǒng)中進(jìn)行手性拆分。慣用手性選擇劑:
CD及其衍生物冠醚手性金屬配合物大環(huán)抗生素蛋白質(zhì)和糖類手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第43頁毛細(xì)管膠束電動電泳(MEKC)是在CZE緩沖液中加入表面活性劑,當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超出臨界膠束濃度時,表面活性劑分子之間疏水基團(tuán)聚集在一起形成膠束-準(zhǔn)固定相,溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間分配系數(shù)不一樣而得到分離。當(dāng)前最慣用是在十二烷基硫酸鈉或膽酸鹽膠束中加入CD來分離對映體??刹鸱蛛x子型和電中性手性化合物。手性藥物現(xiàn)代分析方法與技術(shù)第44頁毛細(xì)管電色譜
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