激光共聚焦顯微技術(shù)

激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)LaserScanningConfocalMicroscopyFruitFlyEmbryoNervousSystemMedicago（苜蓿）crosssectionofastemshowinglignin（木質(zhì)素）autofluorescenceinblueandchloroplastautofluorescenceinred.ThisimagewastakenwiththeLeicaAOBSconfocalmicroscope激光掃描共聚焦顯微鏡成像的基本原理激光掃描共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用量子點(diǎn)技術(shù)及其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用主要內(nèi)容激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡(jiǎn)稱(chēng)LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、組織胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域，對(duì)生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。

有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，20年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡，1985年WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。

一、激光掃描共聚焦顯微鏡成像的基本原理1水銀弧光燈2中密度濾片3光鑭4場(chǎng)鑭5激發(fā)濾片6分光鏡（BSP)7物鏡8樣品9,10發(fā)射濾片11目鏡BasicsofconventionalfluorescencemicroscopeFluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterConfocalPrincipleObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterDifferencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope1122觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來(lái)自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來(lái)自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。共聚焦顯微鏡一次只有樣品的小部分區(qū)域被照明，而普通熒光顯微鏡則有更寬的區(qū)域被照明。共聚焦掃描顯微鏡的成像原理激光作為光源采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。掃描方式成像激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。光點(diǎn)共聚焦

光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔（照明針孔和探測(cè)針孔）。直徑約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過(guò)一系列的透鏡，最終同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來(lái)自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來(lái)自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。ConfocalPrinciple照明針孔探測(cè)針孔二色鏡或分光鏡激光光源激光光源掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測(cè)器）自動(dòng)顯微鏡控制系統(tǒng)（數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)）圖象輸出設(shè)備（顯示器、打印機(jī)、存儲(chǔ)器）二、激光掃描共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)12345541234534LSCM的基本特點(diǎn)觀察方式以熒光為主光源激光（紫外、可見(jiàn)光、近紅外）照明方式點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出實(shí)時(shí)觀測(cè),數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察共聚焦顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)高分辨率：圖像與對(duì)比度增強(qiáng)，使用短波長(zhǎng)的紫外光，大大提高了分辯率。是普通熒光顯微鏡分辨率的1.4倍（0.51/0.37)普通熒光顯微鏡分辨率共聚焦顯微鏡分辨率共聚焦顯微鏡應(yīng)用常見(jiàn)錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)在實(shí)際應(yīng)用中盡管幾乎所有標(biāo)本都采用的是熒光標(biāo)記，但決不能將LSCM認(rèn)為就是一種“高質(zhì)量圖像的熒光顯微鏡”.共聚焦顯微鏡并不總是熒光檢測(cè)的最好工具。共聚焦顯微鏡能同時(shí)或序貫檢測(cè)多種熒光通道，但不能將共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)單地作為一種共存研究的工具。

共聚焦顯微鏡真正的威力是依賴(lài)于其強(qiáng)烈抑制焦平面外熒光信號(hào)的能力，有很好的深度分辨能力或光學(xué)切片功能。基于該性質(zhì)的應(yīng)用包括:樣品的顯微斷層掃描(microscopicCT)Z掃描切片的3-D重建厚樣品的分辨率

多通道同時(shí)檢測(cè)，可實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的生理活動(dòng)和形態(tài)變化:生理學(xué)研究：如細(xì)胞內(nèi)各種離子濃度隨時(shí)間的變化情況.活細(xì)胞多種標(biāo)記物同時(shí)進(jìn)行成像，動(dòng)態(tài)觀察不同形態(tài)學(xué)事件的發(fā)生。如分泌顆粒的分泌過(guò)程。1單張光學(xué)切片功能是共聚焦顯微鏡最基本的功能可來(lái)自單標(biāo)和多標(biāo)樣本往往采用固定后的組織或細(xì)胞標(biāo)本；活細(xì)胞也可進(jìn)行特定時(shí)間點(diǎn)的單張光學(xué)切片vestigial

apterousCiD

(cyanine5).三、激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用

Notjustthestructureofasinglecell,therelationshipofadjacentcellsatdifferentplanecanalsobeviewedclearlylikebelow:

2細(xì)胞顯像可用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞的觀察、分析CriteriaFixedCellsLivingCellsLimitsofilluminationFadingoffluorophorePhototoxicityandfadingofdyeAntifadereagentPhenylenediamine,etc.NONE!MountantGlycerol(n=1.51)Water(n=1.33)HighestNAlens1.41.2TimeperimageUnlimitedLimitedbyspeedofphenomenon;

lightsensitivityofspecimenSignalaveragingYesNoResolutionWaveopticsPhotonstatisticsHertelL.A.,StrickerS.A.andLokerE.S.2000.CalciumdynamicsofhemocytesofthegastropodBiomphalariaglabrata:effectsofdigenetictrematodesandselectedbioactivecompounds.InvertebrateBiology,v.119(#1):27-37.腹足綱一種淡水螺Biomphalariaglabrata血細(xì)胞的鈣離子動(dòng)態(tài)變化探針：CalciumGreenFuraRedCalciumGreenFuraRed10s腎上皮細(xì)胞有絲分裂共聚焦顯微鏡觀察mCherryH2B_mEmEB3骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)mEmerald_ER負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞內(nèi)體EGFP_Endosomes負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞內(nèi)溶酶體HeLa細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體Afocusmotorcanmovethestageinpreciseincrementssothatmultipleimagesfromconsecutiveplanescanbeindividuallyscannedandsaved.3光學(xué)切片功能（細(xì)胞CT)，實(shí)現(xiàn)三維重建步進(jìn)電機(jī)0.1μmBycollectingaseriesofimagesofthespecimenatdifferentdistancesfromthelens(focalplanes)athrough-focusseriesor“Z-series”canbecreated.Lodgepolepine(黑松)NatureCellBiology

5,15(2003)Yellowandredfluorescencerepresents

acridineorange-stainedsecondarycellwalls

and

chloroplasticautofluorescence,

respectively.The3Dimagewasreconstructedfromopticalsectionsobtainedonaconfocalmicroscope(FV500,Olympus).Scalebarrepresents20μm.4.熒光多標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行熒光多標(biāo)記（物質(zhì)共存、空間關(guān)系定位等）motornerve-Cy2musclebagfiber-Cy3

Nucleus-DAPI細(xì)胞膜（AlexaFluor488）AlexaFluor594標(biāo)記的單壁碳納米管透射光通道重疊圖像Hela細(xì)胞內(nèi)化碳納米管過(guò)程12hat37°CAconfocalopticalsectiondemonstratesthatduringtelophase,

microtubules(red)formaphragmoplast(桶狀紡綞體)array

andperoxisomes(green)aggregateimmediatelyinsidethese.

TheDNAinthenucleiisstainedblue.

ImagefromCollingsetal.(2003).PeroxisomesMicrotubulesDAPIPeroxisomalaggregationinonionmaybeinvolvedinmembraneproductionand/ormetabolismduringcelldivisionTheroleofhyaluronaninrenalstonediseasehttp://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA29/HA29E.html透明質(zhì)酸Hyaluronanisexpressedbyproliferatingrenaltubularcellsinsubconfluentcultures(2dayspost-seeding).Atcell-cell

contact(4dayspost-seeding)thisstainingstartstofadeawaytocompletelydisappearwhenthetightjunctionsareassembled(5-6dayspost-seeding).ThehyaluronanreceptorCD44isalsoexpressedattheluminalsurfaceinsubconfluentcultures(2dayspost-seeding),atcell-cellcontactCD44istargetedtolateralspaces,whereasatconfluence(6dayspost-seeding),CD44isexclusivelyexpressedatbasaldomainsoftheplasmamembrane.4厚切片觀察因?yàn)楣簿劢癸@微鏡只有焦平面的光線才能成像Theabovetwoimagesaretakenfromthesamefieldoftheplantof60μmthickbydifferentmeans.ThefirstoneistakenbyCCDcamerainthewildfieldmicroscopeconfiguration.thesecondoneistakenbyconfocalmicroscopywithpinholesizeatoneAiryunit.共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細(xì)胞骨架蛋白等基因表達(dá)產(chǎn)物）、DNA、RNA等細(xì)胞膜流動(dòng)性（熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）細(xì)胞內(nèi)活性氧變化細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位四、量子點(diǎn)在生物及醫(yī)學(xué)分析中的應(yīng)用量子點(diǎn)(QuantumDots，QDs)（LuminescenceSemiconductornanocrystals發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體）由于量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)特性,20世紀(jì)70年代，應(yīng)用主要集中在電子與光學(xué)方面20世紀(jì)80年代，生物學(xué)家已經(jīng)對(duì)量子點(diǎn)產(chǎn)生了濃厚的興趣，但由于它的熒光量子產(chǎn)率低，工作集中在研究量子點(diǎn)的基本特性方面1997年以來(lái)，量子點(diǎn)制備技術(shù)的不斷提高,量子點(diǎn)已越來(lái)越可能應(yīng)用于生物學(xué)研究。量子點(diǎn)可作為生物探針是從1998年AlivisatosAP.

ChanWC兩個(gè)研究小組開(kāi)始，此后量子點(diǎn)的功能進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn)、推廣，使之成為生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

量子點(diǎn)通常以CdSe為核、CdS或ZnS為殼的核-殼型納米體，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比，它有其獨(dú)特的性質(zhì)：量子點(diǎn)具有較大的斯托克位移和狹窄對(duì)稱(chēng)的熒光譜Figs

(A)Excitation(dashed)andfluorescence(solid)spectraoffluorescein(B)atypicalwater-solublenanocrystalsampleinPBS

單個(gè)波長(zhǎng)可激發(fā)所有的量子點(diǎn),而不同染料分子的熒光探針需多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)應(yīng)用范圍廣：可用于多領(lǐng)域和多儀器多種顏色：顏色取決于量子點(diǎn)的大小，在同一激發(fā)波長(zhǎng)下，可發(fā)出多種激發(fā)光，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)的要求。抗光漂白性安全：細(xì)胞毒性低，可用于活細(xì)胞及體內(nèi)研究熒光時(shí)間長(zhǎng)：熒光時(shí)間較普通熒光分子長(zhǎng)數(shù)千倍，便于長(zhǎng)期跟蹤和保存結(jié)果長(zhǎng)頸瓶中不同尺寸的硒化鎘(CdSe)量子點(diǎn)在紫外線的照射下發(fā)出不同顏色的熒光QuantumdotfluorescenceimageofmousekidneysectionQDfluorescenceimageofmousesmallintestineQD可用于非同位素標(biāo)記的生物分子的超靈敏檢測(cè)，如在QD表面連接上巰基乙酸（HS-CH2COOH),從而使量子點(diǎn)既具有水溶性，還能與生物分子（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等）結(jié)合，通過(guò)光致發(fā)光檢測(cè)出QD，從而使生物分子識(shí)別一些特定的物質(zhì)。

SchematicofaZnS－CappedCdSeQDthatiscovalentlycoupledtoproteinQuantumdotscatchcancerearlyQDsaredepictedasgoldspheresthatattractDNAstrandslinkedtocancerrisks.WhentheQDareexposedtocertaintypesoflight,theytransfertheenergytofluorescentmolecules,shownaspinkglobes,thatemitaglow.ThisenablesresearcherstodetectandcounttheDNAstrandslinkedtocancer.(Credit:YiZhang/JohnsHopkinsUniversity)/science-technology/quantum-dots-catch-cancer-early/AQD-EGFbindsandactivatescellsexpressingaGFP-fusedEGFR.(a)RedQD-EGFandgreenGFP-EGFRcolocalizeonthecellmembranewithinminutesand(b)arerapidlyinternalizedtogetherintoendosomesinthecytoplasm.(c)IndividualreceptorsonlongsensoryfilamentscalledfilopodiacanbevisualizedbyQD-EGFbinding.Imagesaresingleconfocalsectionsthroughlivingcells.SnapshotsintimeshowingretrogradetransportofQD-EGF-receptor-activatedcomplexesonafilopodiumcellsexpressingtheEGFR-EGFPfusionproteinafterashortincubationwithcomplexesofEGF-QDnanoparticles.(Creditforimageandlegend:MaxPlanckInstituteforBiophysicalChemistry).內(nèi)化過(guò)程動(dòng)態(tài)顯示NatureBiotechnology22,198-203(2004)還可進(jìn)行脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)(pulse-chaseexperiments),觀察融合內(nèi)體的壽命.Inpulse-chaseexperimentsusingtwodifferentcolorsofQD-EGF,bindingandendocytosisoforangeQD-EGFbyEGFRwasfollowed22minlaterbyblueQD-EGF.FewendosomescontainbothcolorsofQDs